甲狀腺功能減退癥對成年期SD大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)的影響及L-T4替代治療的效果

劉 翔,王 芬,桂 麗,朱德發(fā)

甲狀腺功能減退癥(簡稱甲減)是由于各種原因引起的甲狀腺激素(tyroxine hormones, TH)合成、分泌或生物效應(yīng)不足引起的全身性疾病。TH與腎臟疾病關(guān)系密切，在腎臟發(fā)育、維持水電解質(zhì)平衡、腎功能等方面具有重要作用。先天性甲減患者腎臟質(zhì)量較小，腎缺如、異位、多囊腎等腎臟發(fā)育異常發(fā)病率増高[1]。臨床研究[2]表明成年期甲減可導(dǎo)致腎功能損傷,其發(fā)生的具體機(jī)制尚不清楚。因此，該研究采用丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)飲水制備甲減大鼠模型，以觀察甲減對成年期SD大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)的影響以及左旋甲狀腺素(levothyroxine,L-T4)替代治療的效果，為進(jìn)一步探討甲減對腎臟影響的發(fā)生機(jī)制提供形態(tài)學(xué)方面的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器PTU(上海復(fù)星朝輝藥廠)，規(guī)格：50 mg×100片/盒；L-T4(德國默克公司)；三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine，T3)、甲狀腺素(thyroxine，T4)、促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone，TSH)放射免疫試劑盒(北方生物技術(shù)研究所)。 JEM-1230型透射電鏡(日本電子株式會社)。

1.2動物模型制備本實(shí)驗(yàn)選用的研究對象為3月齡健康成年雄性SD大鼠，共30只，造模前體質(zhì)量在260～290 g，均從安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購買。30只大鼠常規(guī)進(jìn)行分籠喂養(yǎng)，每籠5只大鼠，使用標(biāo)準(zhǔn)飼料，采取自由飲水，維持室溫21～26 ℃，室內(nèi)濕度控制在(50±5)%。經(jīng)過1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將30只大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為對照組、甲減組和L-T4治療組。用PTU飲水法(配成濃度0.05%)建立甲減大鼠模型[3]。自第5周起，L-T4治療組大鼠在繼續(xù)PTU飲水的同時(shí)，每天根據(jù)體質(zhì)量，按6 μg/100 g計(jì)算劑量給予L-T4腹腔注射，共持續(xù)2周；同時(shí)對照組及甲減組大鼠予每日腹腔注射同等劑量的生理鹽水。給藥劑量根據(jù)每周各組大鼠稱量的體質(zhì)量結(jié)果給予調(diào)整。

1.3標(biāo)本制備造模完成后稱量所有大鼠的體質(zhì)量，之后進(jìn)行腹主動脈取血，取血前使用水合氯醛充分麻醉(按0.3 ml/100 g體質(zhì)量計(jì)算劑量進(jìn)行腹腔注射)，之后打開腹腔，在腹主動脈進(jìn)行最大程度的取血，取血后迅速離心(4 000 r/min×15 min)，取上層血清待查。取血后將腎臟迅速分離，將腎臟標(biāo)本放在4%多聚甲醛溶液中，等待進(jìn)一步處理后使用透射電鏡觀察。

1.4甲狀腺功能測定使用放射免疫法測定各組大鼠的血清T3、T4及TSH水平，評估甲狀腺功能。

1.5透射電鏡觀察將分離出的腎臟標(biāo)本切成約1 mm3小塊，放入4 ℃的2.5%戊二醛中固定4～6 h，包埋前經(jīng)0.1 mol/L PBS充分沖洗，再以l%鋨酸固定1 h后，經(jīng)乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂(Epon812)包埋，再使用LKB-NOVA型超薄切片儀修塊，并進(jìn)行超薄切片(片厚70 nm)。將切片放在醋酸鈾及枸櫞酸鉛溶液中浸泡染色，之后常規(guī)沖洗，用日產(chǎn)JEM-1230型透射電鏡對腎臟超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察并射片保存。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠體質(zhì)量比較造模前，三組大鼠體質(zhì)量水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；造模結(jié)束后，對照組、甲減組、L-T4治療組體質(zhì)量分別為(420.12 ± 50.06)、(343.06± 36.07)、(384.19±30.32)g，三組大鼠體質(zhì)量各增加了48.14%、22.18%、34.90%；造模后三組間體質(zhì)量比較顯示：甲減組、L-T4治療組體質(zhì)量顯著低于對照組(P<0.05)。

2.2各組大鼠血清T3、T4及TSH水平與對照組相比，甲減組大鼠血清T3、T4水平顯著降低，TSH水平顯著升高(P<0.01)；L-T4治療組大鼠血清TH及TSH水平與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.3各組大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)在放大10 000倍的透射電鏡下觀察：對照組大鼠腎小球細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，線粒體發(fā)達(dá)、內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)清晰。甲減組大鼠腎小球基底膜結(jié)構(gòu)不規(guī)則；細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊不清，線粒體明顯空泡變性，內(nèi)部嵴斷裂消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆?，F(xiàn)象，間質(zhì)水腫。L-T4治療組與以上超微結(jié)構(gòu)改變明顯改善。見圖1。

在放大20 000倍的透射電鏡下觀察：對照組大鼠腎小球足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，足突排列清晰，足細(xì)胞內(nèi)線粒體內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)清晰。甲減組大鼠腎小球基底膜形態(tài)不規(guī)則；內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)線粒體空泡變性；足細(xì)胞明顯腫脹、融合，內(nèi)部細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清晰；間質(zhì)水腫。L-T4治療組與以上超微結(jié)構(gòu)改變明顯改善。見圖2。

表1 各組大鼠血清 T3、T4、TSH水平(n=10，±s)

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖1 電鏡下大鼠腎小球結(jié)構(gòu)圖 ×10 000A：對照組；B：甲減組；C：L-T4治療組

圖2 電鏡下腎小球足細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖 ×20 000A：對照組；B：甲減組；C：L-T4治療組

3 討論

采用PTU飲水制備大鼠甲減模型已被廣泛應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)中觀察大鼠的活動、飲水及毛發(fā)等情況，本實(shí)驗(yàn)中觀察到在給予PTU(0.05%)飲水約3周時(shí)，實(shí)驗(yàn)大鼠即開始出現(xiàn)活動減少，對外界環(huán)境的刺激反映淡漠，飲食飲水減少，部分大鼠后頸部毛發(fā)稀疏脫落等類似于甲減的臨床表現(xiàn)。6周造模結(jié)束后，甲狀腺功能測定結(jié)果顯示，甲減組甲狀腺激素水平較對照組顯著降低，TSH較對照組顯著增高，L-T4替代治療組血清甲狀腺激素及TSH水平與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明造模成功。

在本研究中，采用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)成年期TH缺乏導(dǎo)致大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了一系列明顯的病理改變。具體表現(xiàn)為甲減組大鼠腎小球足細(xì)胞明顯腫脹、融合，基底膜結(jié)構(gòu)不規(guī)則，內(nèi)部細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清晰，線粒體明顯空泡變性，內(nèi)部嵴斷裂消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆?，F(xiàn)象，間質(zhì)水腫。目前對甲減大鼠腎臟結(jié)構(gòu)方面的研究尚不多，有采用光鏡對甲減大鼠腎臟結(jié)構(gòu)的研究[4]顯示，甲減大鼠的腎小管間質(zhì)結(jié)締組織、炎性細(xì)胞增多，近端腎小管細(xì)胞胞質(zhì)自溶，血管球收縮，且隨病程進(jìn)展腎臟損傷呈加重趨勢。本實(shí)驗(yàn)從微觀角度進(jìn)一步證實(shí)甲減對腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)有損傷作用。

足細(xì)胞與腎小球?yàn)V過功能密切相關(guān)，研究[5]顯示許多動物模型的腎小球疾病中有足細(xì)胞的損傷。目前的一些研究[6]表明多種因素會引起足細(xì)胞功能異常、細(xì)胞凋亡以及數(shù)目減少等，包括了血流動力學(xué)異常、高脂、高糖以及尿蛋白負(fù)荷過重等。國內(nèi)王瑞英 等[7]研究表明甲減時(shí)足細(xì)胞損害的標(biāo)志蛋白Desmin表達(dá)顯著增高，且隨著甲減病程的進(jìn)展該蛋白表達(dá)呈遞增趨勢。線粒體是體內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行有氧氧化的主要結(jié)構(gòu)，提供了細(xì)胞生命活動所需能量的80%，其數(shù)量分布、形態(tài)結(jié)構(gòu)及代謝反應(yīng)受環(huán)境影響變化明顯，因此是細(xì)胞病變或損傷最敏感的指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)中透射電鏡下甲減大鼠足細(xì)胞內(nèi)的線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡變性，雙層膜結(jié)構(gòu)不清，內(nèi)部嵴斷裂、消失等變化。推測其可能的機(jī)制為：TH是調(diào)節(jié)能量代謝的重要激素，在TH缺乏時(shí)，能量代謝發(fā)生了紊亂，致使組織細(xì)胞內(nèi)有氧氧化和氧化磷酸化偶聯(lián)作用障礙，故而與能量代謝密切相關(guān)的線粒體出現(xiàn)較為顯著的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。同時(shí)本研究觀察到甲減組大鼠腎臟足細(xì)胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生了擴(kuò)張、斷裂,結(jié)構(gòu)零亂松散以及核糖體脫顆粒等病理改變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是合成蛋白質(zhì)的場所。已有研究[8]顯示各種因素如缺氧、毒物作用和感染等均會導(dǎo)致其病理變化。甲減時(shí)腎臟以上超微結(jié)構(gòu)的改變均可能影響其正常功能的發(fā)揮?，F(xiàn)有研究[9]證實(shí)甲減的早期即有腎小球?yàn)V過率的下降,腎小管重吸收及最大分泌能力改變,以及尿量減少等，長期甲減造成的改變更為明顯,隨著腎臟損害的加重，出現(xiàn)血尿素氮、肌酐的升高。

L-T4替代治療是甲減的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，本研究中顯示L-T4替代治療后隨著甲狀腺功能的恢復(fù)，在電鏡下觀察到大鼠腎臟受損的超微結(jié)構(gòu)明顯改善。王瑞英 等[4]觀察甲減對腎臟的影響以及激素恢復(fù)快慢對腎臟病理的影響，發(fā)現(xiàn)了激素的快速恢復(fù)更有利于腎臟的病理恢復(fù)。Mooraki et al[10]對4例由甲減所致的急性腎衰竭患者L-T4治療前后的血肌酐和肌酐清除率的測定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過L-T4治療6～12周時(shí)，血肌酐明顯下降，而肌酐清除率明顯上升。以上研究說明TH可能會直接參與腎臟結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)。

本研究中在造模結(jié)束時(shí)對所有大鼠進(jìn)行稱重，顯示甲減組的體質(zhì)量增長水平遠(yuǎn)低于對照組，這與之前對甲減鼠的大多數(shù)報(bào)道相一致[11-13]。然而，一些臨床研究[14]報(bào)道甲減患者體質(zhì)量增加。眾所周知，TH可提高大多數(shù)組織的耗氧率，增加產(chǎn)熱效應(yīng)，因此，甲減可能導(dǎo)致機(jī)體代謝率和能量消耗降低。然而，研究[15]表明，甲減患者的體質(zhì)量增加可能主要是由于水潴留增加有關(guān)，而非由能量消耗減少導(dǎo)致肥胖的后果。在本研究中觀察到甲減大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為明顯的間質(zhì)水腫，提示甲減大鼠機(jī)體可能存在水潴留，然而并未顯示甲減大鼠體質(zhì)量增加，因此，甲減大鼠體質(zhì)量增加減少可能主要與攝入減少有關(guān)，超過了甲減導(dǎo)致的能量消耗的減少[16]。另外，本研究中3月齡SD大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育已相當(dāng)于人類成年期水平，但其身體發(fā)育尚處于成年早期階段，因此，TH的缺乏對生長發(fā)育尤其是體質(zhì)量增長有較大的影響。經(jīng)L-T4替代治療2周后，大鼠的體質(zhì)量增長情況較前有所改善，但較對照組仍偏低，可能與L-T4治療時(shí)間偏短有關(guān)。

綜上所述，甲減可引起成年期SD大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一系列形態(tài)學(xué)改變，經(jīng)過L-T4治療后上述損害可以部分恢復(fù)，說明甲減導(dǎo)致的腎臟超微結(jié)構(gòu)損害是部分可逆的，為進(jìn)一步探討甲減對腎臟影響的發(fā)生機(jī)制提供形態(tài)學(xué)方面的依據(jù)。

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