孕酮對小鼠放射性腦損傷的神經(jīng)保護作用及分子機制

李 卓，張海三，李新娟，魏林郁

放射性腦損傷(radiation-induced brain injury，RBI)是臨床較常見的頭頸部放射治療并發(fā)癥，但其發(fā)病機制仍存在較大的爭論。該課題組前期研究[1-3]顯示，孕酮可通過減輕腦水腫、抑制炎癥反應(yīng)、下調(diào)P2X7受體(P2X7R)表達和清除自由基等機制減輕大鼠缺血性腦損傷，進而減少神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能損害。在放射、缺血、機械和炎癥等損傷病理條件下，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞釋放三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)增加，ATP可使用P2X7R活化，P2X7R的持續(xù)活化引起炎癥介質(zhì)的釋放，后者可加速神經(jīng)細胞的凋亡或壞死[4-5]。基于RBI和大鼠缺血性腦損傷機制中P2X7R及后續(xù)炎癥介質(zhì)這一相似機制，查閱文獻孕酮作用于RBI的機制研究目前未見報道。因此，本研究首先建立小鼠放射性腦損傷模型，通過對比觀察孕酮對小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力、腦含水量、腦脊液炎癥介質(zhì)含量和腦組織P2X7受體蛋白表達水平，探討孕酮對RBI的神經(jīng)保護作用及可能機制，為預(yù)防和治療RBI提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑孕酮(美國Sigma公司)；細胞凋亡TUNEL試劑盒(美國Promega公司)；兔抗鼠P2X7R 多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；小鼠環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2， COX-2)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和白介素-6(interleukin -6, IL-6) ELISA試劑盒(美國eBscienc公司)；β-actin抗體 (北京晶美生物技術(shù)有限公司)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗動物及分組健康雄性BALB/c小鼠小鼠144只，(25.0±2.2)g，SPF級，由新鄉(xiāng)實驗動物中心提供。隨機分為溶劑對照組、單純照射組和孕酮組。孕酮組：腹腔注射孕酮芝麻油液(含孕酮8 mg/kg)2 h后全腦照射30 Gy; 溶劑對照組：腹腔注射等容積芝麻油液后不行腦部照射；單純照射組：腹腔注射等容積芝麻油液2 h后全腦照射30 Gy。每組各48只小鼠。

1.3照射方法照射方法參考Tang et al[6]報道的方法。首先讓小鼠右眼角線和耳后線以上全腦置于照射場(2×2)cm2，然后采用6 mV β離子射線源距離皮膚100 cm進行照射，照射劑量3 Gy/min，總劑量30 Gy。30 Gy總照射劑量的選擇主要是依據(jù)Panagiotakos et al[7]研究顯示：單次照射劑量高于25 Gy可以誘導(dǎo)小鼠發(fā)生RBI。Peng et al[8]研究顯示：小鼠RBI后于最初3 d內(nèi)即可發(fā)生基因和蛋白質(zhì)表達的變化，早于7 d即可發(fā)生腦形態(tài)的改變，8周前即可發(fā)生認(rèn)知障礙。因此，本研究中分別于照射3 d和7 d后處死小鼠，分別檢測小鼠腦脊液ATP、COX-2、TNF-α和IL-6的含量和小鼠腦組織P2X7R蛋白的表達水平；照射7 d后處死動物進行腦含水量測定和小鼠腦細胞凋亡率；隨訪至第8周進行Morris水迷宮實驗評估小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。

1.4Morris水迷宮實驗評價小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力參考Dong et al[9]報道的Morris水迷宮實驗方法，采用計算機視頻跟蹤系統(tǒng)分析潛伏期和路徑總長兩項評價指標(biāo)。潛伏期是指小鼠入水到尋找登上平臺的平均時間；路徑總長是指小鼠入水到尋找登上平臺的平均游泳距離。于第8周起，小鼠在Morris水迷宮測試7 d，每日4次(n=6)。

1.5腦含水量測定照射7 d后每組各深麻醉6只小鼠，取新鮮全腦組織用分析天平稱重，記為濕重，然后于110 ℃恒溫干燥箱內(nèi)放置24 h進行干燥至恒重，稱重記為干重。腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%，以腦含水量間接評估小鼠腦水腫程度。

1.6TUNEL法檢測細胞凋亡率于第7天每組各深麻醉6只小鼠。解剖腦組織，于丘腦中點水平切一取厚度約0.5 cm的腦組織，采用機械-酶消化法將腦組織制成單細胞懸液。用4%多聚甲醛固定單細胞懸液30 min。固定后按照DeadEnd熒光法TUNEL試劑盒程序進行流式細胞儀檢查前標(biāo)記，最后運用流式細胞儀分別獲取每只小鼠腦組織1×104個細胞，并采用488 nm激發(fā)檢測并分析。

1.7小鼠腦脊液ATP和炎癥介質(zhì)含量檢測于第3天和第7天每組各深麻醉6只小鼠，剃光小鼠頸部，然后置于在小鼠腦立體定位儀上，使小鼠頭與身體成約135°角度固定。在小鼠枕下做一矢狀切口，解剖分離皮下組織和肌肉。直到顯示延髓和腦脊液，將試管放于枕大池收集腦脊液。 然后使用ELISA試劑盒測定腦脊液樣本的ATP和炎癥介質(zhì)(COX-2、TNF-α和IL-6)的含量。100 μl待測腦脊液加入96孔黑色透明底板，然后置于700 r/min的軌道板振動篩，震蕩2 min，采用多孔板讀數(shù)器測量熒光強度，而熒光強度與待測小鼠腦脊液中相應(yīng)的目標(biāo)蛋白濃度成正比。

1.8Westernblot法檢測P2X7R的表達于第3、7天每組各深麻醉6只小鼠，取右側(cè)腦組織。然后按照文獻[2]報道的方法提取蛋白，并采用Western blot法檢測P2X7R蛋白表達水平。最后使用Alpha Imager 5500凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，采用Fluor Chem 5500凝膠成像分析系統(tǒng)進行蛋白量灰度的分析。

2 結(jié)果

2.1小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的組間比較Morris水迷宮實驗中，單純照射組小鼠平均潛伏期和尋找平臺路徑總長兩項指標(biāo)均分別大于溶劑對照組和孕酮組，其中在訓(xùn)練后的第4天至第7天的上述兩項指標(biāo)數(shù)值組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

2.2腦含水量的組間比較溶劑對照組、單純照射組和孕酮組腦含水量分別為(78.42±0.76)%、(83.44±0.82)%和(80.78±0.61)%，單純照射組明顯高于溶劑對照組，而孕酮組腦含水量明顯低于單純照射組，組間單因素方差分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=69.99，P=0.000 0)。

2.3腦組織細胞凋亡率的組間比較溶劑對照組、單純照射組和孕酮組平均細胞凋亡率分別為(5.4±0.4)%、(35.1±3.9)%和(23.8±2.6)%，單純照射組明顯高于溶劑對照組，而孕酮組明顯低于單純照射組，組間單因素方差分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=182.78，P=0.000 0)。見圖1。

表1 Morris水迷宮實驗中潛伏期的組間比較 (s，±s，n=6)

表2 Morris水迷宮實驗中路徑總長的組間比較 (cm，±s，n=6)

圖1 比較各組小鼠腦細胞凋亡率A：溶劑對照組；B：單純照射組；C：孕酮組；M3所指為凋亡細胞

2.4ATP-P2X7R軸變化的組間比較圖2顯示：在小鼠照射3 d和7 d后，單純照射組小鼠腦脊液ATP水平均明顯高于溶劑對照組和孕酮組，在小鼠照射3 d和7 d后組間單因素方差分析結(jié)果分別為(F=6.097 2,P=0.047 4)和(F=8.313 1,P=0.015 7)。圖3、4顯示：在小鼠照射3 d和7 d后，單純照射組小鼠腦組織P2X7R蛋白的表達水平均高于溶劑對照組，而孕酮組P2X7R蛋白表達水平低于單純照射組。即單純照射組相較于溶劑對照組，ATP-P2X7R軸分泌或表達增加，而孕酮預(yù)處理可以減小上述ATP-P2X7R軸的相應(yīng)改變。溶劑對照組升高，而孕酮組均較單純照射組表達下降。提示RBI引起ATP-P2X7R軸分泌或表達增加，而孕酮預(yù)處理可以降低ATP-P2X7R軸的改變。

圖2 各組小鼠腦脊液中ATP的含量與溶劑對照組比較：*P<0.05；與單純照射組比較：#P<0.05

圖3 各組小鼠腦組織中P2X7R蛋白表達水平的比較1：溶劑對照組；2：單純照射組；3：孕酮組

圖4 各組小鼠腦組織中P2X7R蛋白表達水平灰度值組間比較與溶劑對照組比較：*P<0.05；與單純照射組比較：#P<0.05

圖5 ELISA法檢測各組小鼠腦脊液中炎癥介質(zhì)(COX-2、TNF-α和IL-6)的變化與溶劑對照組比較：*P<0.05；與單純照射組比較：#P<0.05

2.5比較各組炎癥介質(zhì)變化單純照射組和溶劑對照組相比，COX-2、TNF-α和IL-6分泌明顯增加(P<0.01)，而經(jīng)孕酮預(yù)處理后，孕酮組與單純照射組相比，COX-2、TNF-α和IL-6分泌明顯減少(P<0.05)，提示孕酮預(yù)處理可以減少發(fā)射性腦損傷引起的炎癥介質(zhì)的分泌。見圖5。

3 討論

RBI發(fā)生的確切機制目前仍不甚清楚，既往文獻[10]報道顯示其發(fā)生機制主要與電離輻射直接損傷、自由基損傷、血管內(nèi)皮損傷和免疫反應(yīng)損傷等病理性原因所致的神經(jīng)細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)組織水腫等密切相關(guān)。鄭慧芬 等[11]的研究顯示：20 Gy放射劑量照射大鼠海馬區(qū)腦組織24 h后透射電鏡下即可觀察到血管內(nèi)皮腫脹，照射72 h后開始觀察到細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、染色質(zhì)向細胞邊緣聚集等早期細胞凋亡改變，照射7 d后出現(xiàn)染色質(zhì)進一步凝集、細胞皺縮、細胞膜向內(nèi)包裹染色質(zhì)形成凋亡小體等細胞凋亡的典型超微結(jié)構(gòu)改變。在腦組織功能分區(qū)中，海馬區(qū)主要負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶，故RBI所導(dǎo)致的大鼠腦海馬區(qū)細胞凋亡可進一步使大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶能力的下降[12]。依據(jù)上述理論，本研究采取30 Gy劑量單次照射小鼠腦組織，然后觀察小鼠腦組織細胞凋亡、腦組織水腫和空間學(xué)習(xí)和記憶能力，結(jié)果顯示：照射7 d后小鼠腦組織含水量和細胞凋亡率明顯高于溶劑對照組，照射后第8周，單純照射組小鼠平均潛伏期和尋找平臺路徑總長均明顯大于溶劑對照組。本研究結(jié)果與Xu et al[5]的研究結(jié)論基本一致，提示RBI導(dǎo)致小鼠腦組織水腫和腦細胞凋亡，進而可以引起小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的下降。

另有研究[13]顯示孕酮除生殖調(diào)節(jié)功能外，還具有神經(jīng)保護作用。前期研究[3-5]表明孕酮可通過減輕腦水腫、抑制炎癥反應(yīng)、下調(diào)P2X7R表達和清除自由基等機制減輕大鼠缺血性腦損傷，進而減少神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能損害。本研究通過建立RBI小鼠模型，采用孕酮進行預(yù)處理探討孕酮對RBI的可能保護作用，結(jié)果顯示：孕酮組腦含水量和腦細胞凋亡率明顯低于單純照射組，且Morris水迷宮實驗中小鼠平均潛伏期和尋找平臺路徑總長兩項指標(biāo)均明顯小于單純照射組，其中在訓(xùn)練后的第4天至第7天，上述兩項指標(biāo)組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。提示經(jīng)孕酮預(yù)處理可以減輕RBI所致的小鼠腦組織水腫和腦細胞凋亡，從而改善小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。

P2XR屬于ATP敏感的配體門控離子通道蛋白， P2X7R是P2XR家族中一個亞型。病理或生理因素作用下，ATP釋放增加，作用于細胞膜P2X7R引起細胞膜門控離子通道開放和炎癥介質(zhì)釋放，稱之為ATP-P2X7R軸。ATP-P2X7R軸與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，如肌萎縮側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默病、脊髓損傷與腦卒中等，因此備受關(guān)注[14]。關(guān)于ATP-P2X7R軸在RBI中的改變，多項研究[2，5，15]顯示：電離輻射促使神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞等釋放大量細胞外ATP，高濃度的細胞外ATP通過作用于細胞膜P2X7R，激活小膠質(zhì)細胞和誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)如COX-2、IL-6和TNF-α等釋放增加, 引起炎癥反應(yīng)或介導(dǎo)神經(jīng)元細胞凋亡，加劇神經(jīng)元損傷等病理生理過程。本研究結(jié)果顯示：單純照射組腦脊液ATP濃度、腦組織P2X7R表達水平以及腦脊液炎癥介質(zhì)(COX-2、IL-6和TNF-α)濃度明顯高于溶劑對照組，提示ATP-P2X7R軸及下游炎癥介質(zhì)(如COX-2、IL-6、TNF-α)是RBI發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)和分子機制。同時，孕酮組ATP、P2X7R、COX-2、IL-6和TNF-α等分子水平均明顯低于單純照射組，提示孕酮預(yù)處理可以抑制RBI所致的ATP-P2X7R軸改變和下游炎癥介質(zhì)的釋放，利于減輕RBI所致腦組織病理性損傷。

綜上所述，孕酮預(yù)處理可能通過抑制ATP介導(dǎo)的P2X7R活化以及后續(xù)炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕腦組織水腫、神經(jīng)細胞凋亡、改善小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，起到保護RBI所致的腦功能損害。

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