WDR1與小鼠精神分裂樣陰性癥狀呈正相關(guān)性

王 梅，王 靜，楊中州，高 雋

精神分裂癥是一類以情感障礙，精神活動與周圍環(huán)境不協(xié)調(diào)，脫離現(xiàn)實為主要特征的常見精神疾病。其終生患病率在世界范圍內(nèi)約為1%[1]。臨床陰性癥狀較為多見，表現(xiàn)為情感低落或情緒冷漠、精神性失語癥、意志缺乏。陰性癥狀的危害不容忽視，且相對更難治療。WDR1(WD repeat protein 1)是一種64 ku的位于細胞質(zhì)中的細胞骨架蛋白，促進F-actin解聚，參與調(diào)節(jié)樹突棘的形成[2-3]。就目前國內(nèi)外的研究結(jié)果來看，有研究者對精神分裂癥患者的背外側(cè)前額葉皮層進行蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)WDR1在該腦區(qū)的表達出現(xiàn)異常[4]。雖然目前發(fā)現(xiàn)WDR1的表達在精神分裂癥中有變化，但是并沒有直接證據(jù)證明海馬腦區(qū)的WDR1與精神分裂癥的關(guān)系及其調(diào)控機制，通過海馬CA1區(qū)條件性敲除WDR1來觀察WDR1與精神分裂樣陰性癥狀的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料實驗選用了兩種基因工程小鼠，均為C57BL/6背景：① WDR1flox/flox小鼠是將loxP片段選擇性地插入WDR1基因內(nèi)含子中，該小鼠由南京大學模式動物所楊中州實驗室贈送；② CA1-Cre小鼠，該小鼠的特點為Cre重組酶特異性表達于海馬CA1區(qū)，該品系小鼠由美國麻省理工學院Picower學習記憶研究所Susumu Tonegawa教授贈送。利用Cre/loxP技術(shù)，將WDR1flox/flox小鼠與CA1-Cre小鼠雜交，即可得到海馬CA1區(qū)特異性敲除WDR1基因的小鼠，即CA1-Cre；WDR1flox/flox(CKO)小鼠。行為學采用8～10周齡雄鼠，20～25 g，每天12/12 h晝夜更替飼養(yǎng)。抗體：Anti-WDR1抗體(美國Proteintech 公司)；腺相關(guān)病毒(上海泰廷生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠基因型鑒定 小鼠出生1周后即可進行基因型鑒定。剪下小鼠的腳趾并編號，將腳趾放入1.5 ml的離心管，加入500 μl消化液，55 ℃烘箱中過夜消化。第2天消化好后振蕩離心，常溫12 000 r/min離心5 min，吸取上清液400 μl的消化液加入離心管，接著加入400 μl預冷的異丙醇，充分混勻后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清液，加入500 μl 75%乙醇混合振蕩，4 ℃或常溫12 000 r/min離心5 min，棄上清液，再加入500 μl 100%無水乙醇混勻4 ℃或常溫12 000 r/min離心1 min。然后棄去上清液，倒置晾干，最后加入80～120 μl滅菌水溶解，放入-4 ℃保存，DNA提取完畢。每個PCR過程采取20 μl體系(2 μl模板DNA，1 μl引物，7 μl水及10 μl的混合taq酶)，放入PCR儀中進行擴增。結(jié)束后放入瓊脂糖凝膠中電泳，在孔中加入DNA marker，跑膠完成后用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶有無及位置。引物序列： WDR1-F:5′-GGACCTTCTAAGCAGTTACAACC-3′；WDR1-R:5′-TTGCACAGAGGTGAATGACAGAG-3′。Camk2-Cre-F:5′-TGCCACGACCAAGTGACAGCAATG-3′；Camk3-Cre-R:5′-ACCAGAGACGGAAATCCATCGCTC-3′。

1.2.2做窩實驗 做窩實驗是用于評價嚙齒類動物筑窩能力的方法，其可以反映出動物的冷漠樣情緒，實驗具體步驟如下：首先，晚上20：00(熄燈)之前1 h將實驗小鼠籠搬至安靜清潔的房間，再將小鼠單籠單只放置，籠內(nèi)添有充足的水、食物以及6片正方形緊密壓制的脫脂棉片。然后，用標簽詳細記錄小鼠的組型、編號，將其貼至籠子的邊緣。最后，每隔2、4、6、12 h觀察小鼠筑窩情況，并用相機拍照進行記錄。根據(jù)小鼠做窩的不同情況，對其做窩行為進行評分，并對得分進行比較，具體的評分標準如下，5分：95%的脫脂棉被撕碎，窩形完美，立體感強，高度高于小鼠身高50%；4分：95%的脫脂棉被撕碎，窩形扁平，高度不足小鼠身高50%；3分：大部分棉片被撕碎，但形狀不規(guī)則，無法辨認出是一個窩；2分：小部分棉片被撕碎；1分：95%以上的棉片保持完好。見圖1。

1.2.3海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng) 手術(shù)器械高壓滅菌。準備預冷的HBSS緩沖液及37 ℃預熱的0.25%胰酶、Neurobasal培養(yǎng)基。用P0新生鼠，冰上取腦后，放入4 ℃預冷的HBSS緩沖液中解剖分離出海馬組織。將組織剪碎后加入0.25%胰酶37 ℃消化5 min，在此期間可輕柔振蕩幾次。消化結(jié)束后，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化反應，將其輕輕吹打混勻至細胞完全分散，室溫下1 000 r/min離心10 min。吸去上清液，根據(jù)沉淀的細胞量加入300 μl左右的DMEM培養(yǎng)液重新懸浮細胞，取上述細胞懸液適當稀釋后用細胞計數(shù)板進行計數(shù)。將所需密度的神經(jīng)元接種于多聚-D-賴氨酸氫溴酸鹽包被過的24孔板中，輕晃培養(yǎng)板使其混勻，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后換Neurobasal培養(yǎng)液，第3天加入10 μmol/L阿糖胞苷來抑制膠質(zhì)細胞的生長，以后每2～3 d半定量換液。

1.2.4神經(jīng)元細胞轉(zhuǎn)染病毒及免疫熒光實驗 神經(jīng)元培養(yǎng)到7～9 d時，轉(zhuǎn)染GFP腺相關(guān)病毒2 μl(AAV-CMV-bGi-eGFP，滴度：2.24×1010)。體外繼續(xù)培養(yǎng)到18～21 d時進行實驗。室溫下，將細胞用4%多聚甲醛固定20 min，用封閉液(3% BSA + 0.3% Triton X-100)封閉1 h，封閉完成后加入配制好的一抗孵育液，4 ℃過夜。次日，4 ℃取出后室溫孵育30 min，然后用PBS/T漂洗，洗去一抗后加入相應的熒光二抗，室溫下避光孵育2 h，再用PBS漂洗。在載玻片上滴加防熒光淬滅劑，將帶有細胞的一面貼到載玻片上，用濾紙吸干多余液體，指甲油封邊后置于暗盒中保存。染好后的細胞貼片用奧林巴斯激光共聚焦顯微鏡采集圖像。

2 結(jié)果

2.1WDR1條件性敲除小鼠的基因型鑒定為了研究WDR1與精神分裂癥的關(guān)系，實驗利用Cre/loxP技術(shù)構(gòu)建了WDR1基因條件性敲除小鼠，將CA1-Cre小鼠與WDR1flox/flox小鼠(簡稱WT小鼠)雜交，子代中l(wèi)oxP位點就有概率在Cre重組酶的作用下將4號外顯子切除，得到CA1-Cre；WDR1flox/flox小鼠(簡稱CKO小鼠)，見圖2A。首先，對WT小鼠和CKO小鼠進行了初步的外觀觀察，發(fā)現(xiàn)出生2個月后的CKO小鼠和WT小鼠在外形上沒有明顯的區(qū)別，見圖2B。接著通過海馬腦片免疫熒光實驗驗證敲除效率，結(jié)果表明CKO小鼠的海馬組織中WDR1的熒光強度明顯降低(t=6.509，P<0.001，n=4)，見圖2C、D。表明WDR1在海馬CA1區(qū)敲除成功。

2.2WDR1敲除后小鼠精神分裂樣陰性癥狀減弱冷漠情緒是精神分裂癥陰性癥狀的一種常見癥狀，做窩實驗能夠評價小鼠是否有冷漠樣情緒。WT組(n=8)與CKO組(n=8)小鼠做窩質(zhì)量在2 h時差異無統(tǒng)計學意義，但是在以后的4、6、12 h時，CKO組小鼠做窩評分明顯高于WT組(t=-1.922、-2.335、-2.274，P=0.029、0.038、0.042)。說明海馬CA1區(qū)敲除WDR1使小鼠更不容易產(chǎn)生冷漠樣情緒。見圖3。

圖1 小鼠做窩實驗的評分標準A: 1分；B: 2分；C: 3分；D: 4分；E: 5分

圖2 WDR1條件性敲除小鼠的鑒定

A:WT與CKO組小鼠基因型鑒定結(jié)果；B:WT組與CKO組小鼠外觀比較；C: 兩組小鼠海馬腦片免疫熒光實驗結(jié)果×20；D:免疫熒光結(jié)果統(tǒng)計；與WT組比較：***P<0.001

圖3 不同時間點小鼠做窩質(zhì)量評分

A:兩組小鼠分別在0、4 h做窩照片；B:A中做窩評分統(tǒng)計；與WT組比較：*P<0.05

2.3WDR1敲除后樹突棘明顯增多WDR1能夠促進actin的解聚，進而減少樹突棘密度，而樹突棘減少是精神分裂癥的主要神經(jīng)病理改變，提示在海馬中敲除WDR1可能對精神分裂癥產(chǎn)生影響。通過海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)、病毒轉(zhuǎn)染及免疫熒光染色的方法，觀察CKO小鼠樹突棘的形態(tài)變化。結(jié)果顯示W(wǎng)DR1敲除后，CKO組小鼠相比于WT組，神經(jīng)元的樹突棘明顯增多(n=23，t=6.906，P<0.001)。表明海馬CA1區(qū)敲除WDR1可以增加樹突棘密度，提示W(wǎng)DR1與精神分裂樣陰性癥狀呈正相關(guān)性。見圖4。

圖4 海馬CA1區(qū)敲除WDR1后神經(jīng)元樹突棘增加 免疫熒光×180

A:兩組小鼠海馬神經(jīng)元共聚焦照片；B:兩組小鼠神經(jīng)元樹突棘密度統(tǒng)計；與WT組比較：***P<0.001

3 討論

精神分裂癥的陰性癥狀在行為方面表現(xiàn)為失語癥、意志力下降、快感缺乏和無法正常表達情感，在認知方面則表現(xiàn)為記憶力減退、執(zhí)行能力下降、注意力不能集中、語言能力和閱讀能力降低以及社會認知能力受損，嚴重影響了個人的身心健康和生活質(zhì)量甚至可能危及個人的生命安全。近年來，越來越多的證據(jù)表明WDR1與精神分裂癥有著密切的關(guān)系，有學者對1 162例歐美樣本的全基因組進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)WDR1基因與精神分裂癥的發(fā)病年齡相關(guān)性很大[5]。也有研究[6]顯示在精神分裂癥患者的前額葉皮層中WDR1蛋白表達增加。

WDR1影響actin，促進F-actin解聚，進而影響樹突棘的形成，使樹突棘減少。在海馬CA1區(qū)條件性敲除WDR1后，小鼠海馬中錐體神經(jīng)元的樹突棘增加。海馬被公認為在記憶形成中起到核心作用，但有研究[7]表明在精神分裂癥患者中海馬的結(jié)構(gòu)和功能也是異常的。通過對精神分裂癥患者死后的腦組織進行檢測，結(jié)果顯示神經(jīng)元樹突棘的減少是最常見的神經(jīng)病理改變，并且這種改變出現(xiàn)在海馬菌絲層、額葉皮層、初級視覺皮層和顳葉皮層等多個腦區(qū)[8]。海馬CA1區(qū)條件性敲除WDR1小鼠的樹突棘明顯增加。做窩實驗是用來評價嚙齒類動物的筑窩能力的行為學模型，可以反映出動物的冷漠情緒，目前做窩實驗是一種可以廣泛用來評價嚙齒類動物精神分裂樣陰性癥狀的動物模型[9]。在做窩模型中，CKO小鼠在做窩質(zhì)量評價中也獲得更高的得分，表現(xiàn)出更好的做窩能力。上述結(jié)果提示，WDR1與精神分裂樣陰性癥狀有著密切的聯(lián)系。

目前對于精神分裂癥的研究，越來越重視海馬腦區(qū)在其中的作用。海馬被公認為在學習記憶中有著重要的作用。目前很多研究[10]顯示在精神分裂癥患者中海馬結(jié)構(gòu)及功能異常。在精神分裂癥發(fā)病初期，海馬體積縮小。除宏觀的變化，有研究[11]顯示精神分裂癥患者的一些腦局部微觀結(jié)構(gòu)改變，海馬的錐體細胞體積變小、密度增加，提示軸突發(fā)育過程中的突觸刪除以及樹突棘密度減少[12]。類似的微觀結(jié)構(gòu)改變在前額葉、丘腦等其他腦區(qū)也有出現(xiàn)。除了樹突棘密度的改變之外，突觸的傳遞也會影響精神分裂癥。突觸蛋白是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的蛋白，在突觸的形成與傳遞中也起著重要作用[13]，那么很可能WDR1同樣也可以通過調(diào)節(jié)海馬腦區(qū)樹突棘密度及突觸傳遞來對精神分裂癥產(chǎn)生影響。

綜上所述，實驗結(jié)果表明WDR1很可能是通過影響actin進而改變樹突棘的密度，最終調(diào)控精神分裂癥的陰性癥狀，能夠為WDR1與精神分裂樣陰性癥狀呈正相關(guān)提供直接證據(jù)，即減弱冷漠樣情緒的表型。實驗結(jié)果為以后研究精神分裂癥提出了一個新的思路，WDR1缺失可能能夠改善精神分裂癥的陰性癥狀，也為精神分裂癥的臨床治療提供了一個新的潛在治療靶點。

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