網(wǎng)膜素-1對結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖凋亡的影響及其機制研究

萬麗娟，張群慧，陳明衛(wèi)，季 華

目前已公認(rèn)肥胖與結(jié)腸癌密切相關(guān)，但發(fā)病機制尚不明確。近年來有研究[1]提示脂肪組織分泌的脂肪因子可能是聯(lián)系肥胖與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。網(wǎng)膜素-1(Omentin-1)是脂肪細(xì)胞分泌的一種脂肪因子，前期臨床研究[2]結(jié)果顯示血漿Omentin-1水平與結(jié)腸癌發(fā)生密切相關(guān)，體外實驗顯示Omentin-1可促進結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的增殖。目前有研究[3]表明腫瘤干細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及放化療抵抗有關(guān)，關(guān)于Omentin-1對結(jié)腸癌干細(xì)胞的作用目前國內(nèi)外尚未見報道。該研究通過體外實驗探討Omentin-1對結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為未來結(jié)腸癌的診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480(中科院上海細(xì)胞庫)；免疫磁珠分選器及分選架(美國Miltenyi公司)；CD133間接免疫磁珠試劑盒、MS分選柱(德國Miltenyi公司)；高糖DMEM培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物科技公司)；重組人表皮生長因子、重組人堿性成纖維生長因子(美國Peprotech公司)；B27添加物(50×)(美國Gibco公司)；白血病抑制因子(南京維森特生物技術(shù)有限公司)；磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/絲/蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase， Akt)信號通路抑制劑(LY294002)(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(上海貝博生物公司)；Omentin-1(武漢優(yōu)爾生公司)。

1.2結(jié)腸癌干細(xì)胞免疫磁珠分選用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞。取生長對數(shù)期的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞，胰酶消化后細(xì)胞計數(shù)2×107個，離心后棄上清液，使用350 μl含0.5%胎牛血清、2 mmol/L 乙二胺四乙酸的緩沖液重懸，形成單細(xì)胞懸液。依次加入受體阻斷劑100 μl和CD133/1(AC133)-Biotin 抗體50 μl，混勻后置于4 ℃冰箱孵育10 min，加入緩沖液5 ml清洗2遍，后以1 330 r/min離心10 min，棄去上清液，重懸于400 μl緩沖液中，加入100 μl抗Biotin微珠，4 ℃冰箱孵育15 min。再次用緩沖液清洗細(xì)胞2次，并充分重懸于500 μl緩沖液中備用。將標(biāo)記好的CD133抗體的細(xì)胞懸液加入安裝好的分選柱中，待細(xì)胞懸液自然流盡，PBS洗柱3次，每次均自然流盡，從磁場中取下分選柱，用1 ml PBS快速沖洗分選柱中細(xì)胞，收集于培養(yǎng)板中，即為CD133+結(jié)腸癌干細(xì)胞。

1.3CD133+結(jié)腸癌干細(xì)胞的培養(yǎng)將CD133+結(jié)腸癌干細(xì)胞接種于超低黏附6孔板中，每孔加入2 ml DMEM-F12無血清培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2溫箱中孵育，采用離心換液法每3 d更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，倒置顯微鏡下觀察多數(shù)細(xì)胞形成干細(xì)胞球時(80%)進行傳代。

1.4結(jié)腸癌干細(xì)胞的鑒定結(jié)腸癌干細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細(xì)胞離心后棄上清液，用PBS清洗2次并離心，接種于96孔板中，加入含10% 胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞分化，觀察干細(xì)胞分化貼壁情況。同時將對數(shù)生長期的結(jié)腸癌干細(xì)胞消化重懸為單個細(xì)胞，分為陰性對照組和CD133組，每組計數(shù)2×106個細(xì)胞，PBS清洗2次后，加入500 μl PBS重懸細(xì)胞。陰性對照組只加2 μl PE染色，4 ℃避光孵育，不加CD133抗體，而CD133組先加入CD133抗體2 μl，4 ℃冰箱避光孵育1 h后，用PBS清洗1次，再加入PE 2 μl染色，4 ℃避光孵育15 min后。立即用流式細(xì)胞儀檢測兩組CD133含量。

1.5實驗分組觀察不同濃度Omentin- 1對結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討Omentin- 1對PI3K/Akt信號通路的影響，實驗分為5組：對照組、Omentin 1組(1 μg/ml Omentin-1)、Omentin 2組(2 μg/ml Omentin-1)、Omentin LY組(1 μg/ml Omentin-1和50 μmol/L LY294002)、LY組(50 μmol/L LY294002)，每組設(shè)4個復(fù)孔。

1.6CCK-8法檢測結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖情況將對數(shù)生長期的結(jié)腸癌干細(xì)胞以1.5×105個接種于96孔板中，每孔加入100 μl培養(yǎng)基，按分組條件干預(yù)細(xì)胞24 h后，每孔加入10 μl CCK-8，避光孵育3 h，酶標(biāo)儀450 nm處檢測吸光度(optical density，OD)值，實驗重復(fù)3次。為進一步了解Omentin-1對結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖的時間效應(yīng)關(guān)系，應(yīng)用1 μg/ml Omentin-1分別干預(yù)0、1、6、24、48 h后，加入CCK-8試劑10 μl，避光孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm處檢測OD值，實驗重復(fù)3次。

1.7流式細(xì)胞儀檢測結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡情況取對數(shù)生長期的結(jié)腸癌干細(xì)胞以每孔2×106個接種在6孔板中，每孔2 ml DMEM-F12培養(yǎng)基，按分組條件干預(yù)細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞后800 r/min離心5 min，PBS清洗2次，細(xì)胞重懸于400 μl結(jié)合液，5 μl Annexin V-FITC混勻，4 ℃避光孵育15 min，再加入10 μl PI 4 ℃避光孵育5 min，立即用流式細(xì)胞儀檢測，實驗重復(fù)3次。采用Flowjo V7軟件分析結(jié)果。

1.8Westernblot檢測不同濃度Omentin-1干預(yù)后Akt、pAkt蛋白表達取對數(shù)生長期的結(jié)腸癌干細(xì)胞，每孔2×107個接種于6孔板中，按分組條件干預(yù)，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞并提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。加入25 μl蛋白上樣緩沖液(5×)。按實驗分組依次將蛋白上樣，電泳1 h分離，200 mA穩(wěn)流2 h轉(zhuǎn)移至NC膜上。5%封閉液封閉1～2 h，TBST緩沖液洗膜3次，分別加入β-actin(1 ∶2 000)、Akt(1 ∶1 000)、p-Akt(1 ∶1 000)，4 ℃孵育一抗過夜，洗膜3次，5%封閉液加入二抗1 μl(1 ∶8 000)，搖床上低速室溫孵育二抗1 h，再次洗膜3次后滴加顯影液顯影。Quantity One凝膠成像軟件分析相對灰度值。

2 結(jié)果

2.1結(jié)腸癌干細(xì)胞鑒定克隆球形成：應(yīng)用倒置顯微鏡觀察，結(jié)腸癌干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第1天可見小的干細(xì)胞球形成，數(shù)量少；第5天可見明顯干細(xì)胞球形成；第10天干細(xì)胞球進一步增大且變圓；干細(xì)胞球在無血清培養(yǎng)基中呈懸浮生長，見圖1。

分化實驗結(jié)果：應(yīng)用倒置顯微鏡觀察，結(jié)腸癌干細(xì)胞接種于含10%胎牛血清培養(yǎng)基中，第3天仍可見干細(xì)胞球，大部分懸浮生長，小部分細(xì)胞從細(xì)胞球中逸出貼壁呈梭形；第7天大部分干細(xì)胞球逐漸貼壁，呈梭形；第9天干細(xì)胞球全部分化成為梭狀的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，呈貼壁生長，且梭形細(xì)胞數(shù)量較第7天時增多，見圖2。

流式細(xì)胞儀檢測CD133結(jié)果：結(jié)腸癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133+細(xì)胞群含量達80.3%，見圖3。

2.2Omentin-1對結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖的影響與對照組比較，Omentin 1組、Omentin 2組、Omentin LY組、LY組OD值均明顯降低(F=37.068，P<0.05)；Omentin 2組、Omentin LY組的OD值較1 μg/ml Omentin-1作用于結(jié)腸癌干細(xì)胞0、1、6、24、48 h后，隨干預(yù)時間增加，OD值呈逐漸下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=126.009，P<0.05)。

圖1 倒置顯微鏡下觀察結(jié)腸癌干細(xì)胞球生長 ×400A：第1天；B：第5天；C：第10天

圖2 倒置顯微鏡下觀察結(jié)腸癌干細(xì)胞分化情況 ×200A：第3天；B：第7天；C：第9天

圖3 流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)腸癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133PE-CD133+：CD133陽性細(xì)胞群

Omentin 1組更低，Omentin LY組 OD值低于LY組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=37.068，P<0.05)，見圖4。

2.3Omentin-1對結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡的影響Omentin 1組、Omentin 2組、Omentin LY組、LY組的細(xì)胞凋亡率分別為(17.10±0.86)%、(36.52±1.26)%、(34.35±4.21)%、(23.08±4.99)%，與對照組(5.75±3.48)%比較均上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=42.305，P<0.05)。Omentin 2組、Omentin LY組的細(xì)胞凋亡率較Omentin 1組更高，Omentin LY組的細(xì)胞凋亡率高于LY組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=42.305，P<0.05)，見圖5。

2.4Omentin-1對pAkt/Akt表達的影響與對照組相比，隨著Omentin-1濃度的增加， Akt蛋白表達量有所下降，pAkt蛋白表達量呈明顯下降趨勢， pAkt/Akt比值逐漸下降。與對照組相比，Omentin 1組pAkt/Akt表達降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而Omentin 2組則顯著降低(F=5.200，P<0.05)，見圖6。

圖4 不同濃度Omentin-1對結(jié)腸癌干細(xì)胞活力的影響及與LY294002的相互作用

A：對照組；B：Omentin 1組；C：Omentin 2組；D：Omentin LY組；E：LY組；與對照組比較：*P<0.05；與Omentin 1組比較：#P<0.05；與Omentin LY組比較：△P<0.05

圖5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡A：對照組；B： Omentin 1組；C： Omentin 2組；D： Omentin LY組；E：LY組

圖6 Omentin-1對pAkt/Akt表達的影響

A：對照組；B：Omentin 1組；C：Omentin 2組；與對照組比較：*P<0.05

3 討論

Omentin-1是一種新型的分子量為34 ku的脂肪因子，主要表達于腹部脂肪組織的脂肪細(xì)胞中。已有研究[4-5]表明Omentin-1可能與一些惡性腫瘤，如胃癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系。

Omentin-1與結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)之間也存在相關(guān)關(guān)系。本課題組前期研究[6]顯示CRC患者和正常受試者血漿Omentin-1水平均與高密度脂蛋白呈正相關(guān)性，與三酰甘油、空腹胰島素、腰臀比等呈負(fù)相關(guān)性。結(jié)腸癌患者癌組織中Omentin-1蛋白表達和mRNA水平高于癌旁組織，從結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的細(xì)胞裂解液中檢測出Omentin-1蛋白及mRNA表達，SW480細(xì)胞上清液中檢測到Omentin-1蛋白表達[7]。體外實驗顯示Omentin-1可促進SW480結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡[2]。CRC患者的血清Omentin-1、內(nèi)脂素、絲氨酸蛋白酶抑制劑水平明顯升高，并且這些脂肪因子可能通過各種機制對CRC發(fā)展直接產(chǎn)生作用，這種直接作用甚至有可能比通過肥胖與CRC之間聯(lián)系的間接作用更重要[8]。也有前瞻性群組研究[9]表明，CRC患者血循環(huán)網(wǎng)膜素水平升高，提示Omentin-1與CRC風(fēng)險增加有關(guān)，表明Omentin-1可以作為預(yù)測CRC風(fēng)險的新型標(biāo)志物。但是，有研究[10]顯示無糖尿病的Ⅲ期結(jié)腸癌患者進行手術(shù)和奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶等化學(xué)藥物治療后，Omentin-1水平明顯升高。TMEM207是一種不典型的跨膜蛋白，與Omentin-1的產(chǎn)生有關(guān)，在CRC細(xì)胞中用小干擾RNA使TMEM207基因沉默后，Omentin-1多聚泛素化增加、蛋白酶體降解，從而使Omentin-1分泌減少，結(jié)果可導(dǎo)致結(jié)直腸發(fā)生癌變，Omentin-1水平的下調(diào)可能導(dǎo)致進展期CRC患者預(yù)后不良[11]。雖然目前關(guān)于Omentin-1對結(jié)腸癌細(xì)胞的作用尚有相關(guān)報道，但對結(jié)腸癌干細(xì)胞的作用的研究未見報道。

結(jié)腸癌干細(xì)胞是結(jié)腸癌細(xì)胞中的一小部分細(xì)胞群，具有自我更新、無限增殖和多向分化的特性以及致瘤性。目前腫瘤干細(xì)胞的分選方法主要使用免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀分選法，免疫磁珠法是國際公認(rèn)的干細(xì)胞分選方法，操作簡便、分選出的陽性細(xì)胞比例高。結(jié)腸癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物包括CD133、CD44、LGR5等，其中CD133是結(jié)腸癌干細(xì)胞最具代表性的表面標(biāo)志物之一。

本實驗首先通過間接免疫磁珠分選法從結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中分選出CD133+結(jié)腸癌干細(xì)胞，采用克隆球形成實驗和分化實驗證實免疫磁珠分選及無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的CD133+干細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的無限增殖和多向分化能力，并通過流式細(xì)胞儀鑒定分選后細(xì)胞中CD133含量達80.3%，與相關(guān)研究[12-13]結(jié)果一致。通過不同濃度Omentin-1和不同時間點作用于結(jié)腸癌干細(xì)胞后顯示，Omentin-1可抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖，促進其凋亡，且這種作用呈時間-濃度依賴性。此外，本研究還顯示Omentin-1與LY294002共同作用于結(jié)腸癌干細(xì)胞后，抑制增殖及促進凋亡作用均較單一作用時加強，具有協(xié)同作用。

絲蘇氨酸蛋白激酶/蛋白激酶B屬于PI3K信號通路。PI3K信號通路是刺激生長因子的核心信號通路，PI3K通過其下游分子Akt活化后刺激各種惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進增殖；反之，Akt信號通路抑制可以使一些惡性腫瘤細(xì)胞凋亡。在很多腫瘤中都顯示存在PI3K/Akt通路異常，如非小細(xì)胞肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌，Akt信號通路激活在結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡中也起重要作用。LY294002是PI3K/Akt通路的抑制劑，可降低Akt蛋白的磷酸化水平，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡、抑制其增殖，可能用于治療結(jié)腸癌[14]。本實驗結(jié)果顯示，Omentin-1可以抑制pAkt/Akt活性，其抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖、促進其凋亡的機制可能與抑制Akt活性有關(guān)，與胃癌[4]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[5]的研究結(jié)果一致，并且與LY294002的作用一致。然而有研究[15]顯示，Omentin-1可以在胰島素存在或缺乏的情況下，觸發(fā)Akt通路，通過激活腺苷單磷酸活化蛋白激酶和Akt磷酸化途徑抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而阻止心肌細(xì)胞急性缺血性損傷。推測Omentin-1在不同細(xì)胞中對Akt途徑的作用可能并不相同。

綜上所述，Omentin-1抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖、促進其凋亡，呈時間濃度依賴關(guān)系，且Omentin-1與LY294002在抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖、促進其凋亡的過程中具有協(xié)同作用。另外Omentin-1對結(jié)腸癌干細(xì)胞的作用機制可能與抑制Akt通路有關(guān)。

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