二氫生物喋呤還原酶減輕脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

古艷婷，馮 茹，孫斯凡

糖尿病腎病是由很多因素導(dǎo)致的疾病，患者體內(nèi)存在多種通路的失調(diào)，至今仍未完全闡明。研究顯示糖尿病腎病存在自噬現(xiàn)象的下調(diào)，其中腎臟中的脂代謝紊亂會(huì)促進(jìn)腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[1-2]，且會(huì)導(dǎo)致腎小管細(xì)胞凋亡[3]。研究者在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，二氫生物喋呤還原酶(dihydropteridine reductase，QDPR)在體外高表達(dá)可抑制細(xì)胞的氧化應(yīng)激，但其對(duì)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的抑制是否參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展還不確定[4]。本研究構(gòu)建了野生型QDPR重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，使用脂肪酸(plamitic acid, PA)刺激細(xì)胞，觀察QDPR過表達(dá)對(duì)PA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用的影響，探討QDPR在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑及細(xì)胞鼠單抗V5抗體(美國(guó)Invitrogen公司)；兔多抗LC3(美國(guó)Sigma公司)，兔多抗Beclin 1抗體(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，二抗(美國(guó)Abcam公司)；凝膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒中提試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)；限制性內(nèi)切酶EcoR V、Pst I、Xba I(美國(guó)NewEngland Biolabs公司)；四氫生物喋呤(tetrahydrobiopterin，BH4)檢測(cè)試劑盒(北京antibody-online公司)，ROS檢測(cè)試劑盒(北京Applygen有限公司)。HEK293T細(xì)胞為航空總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2QDPR重組質(zhì)粒的構(gòu)建在大鼠QDPR引物上游和下游分別引入EcoR V酶切位點(diǎn)和 Xba I 酶切位點(diǎn)。引物序列如下：上游5′-AGATATCTGGCGGCTTCGGGCGAGGC-3′；下游5′-ATCTAGAGAAATAGGCTGGAGTAAGCT-3′，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min。經(jīng)雙酶切后再使用T4 DNA連接酶連接目的片段與載體，構(gòu)建rQDPR/pcDNA3.1/V5-His重組質(zhì)粒。

1.3HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組實(shí)驗(yàn)分為A、B、C 3組，A組為空載體組， B組為經(jīng)過PA刺激的空載體轉(zhuǎn)染組，C組為經(jīng)過PA刺激的QDPR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。HEK293T細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染前24 h傳代，以2×106/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，空載體組換成正常培養(yǎng)基，B組和C組加入含濃度為0.5 mmol/L PA的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞液和細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.4BH4和ROS生成量檢測(cè)使用BH4試劑盒檢測(cè)細(xì)胞和細(xì)胞液中BH4的含量。在細(xì)胞中加入含有1 mmol/L DCFH-DA的培養(yǎng)基，然后在37 ℃條件下孵育30 min，隨后用PBS清洗2次，使用熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)。

1.5Westernblot檢測(cè)各組取60 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5 g/L脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜，分別用鼠單抗V5抗體 (1 ∶5 000)、Caspase 3抗體(1 ∶2000)、 Beclin1抗體(1 ∶2 000)、Beclin2抗體(1 ∶2 000)及β-actin 抗體(1 ∶2 000) 4 ℃孵育過夜；使用濃度為1 ∶4 000的二抗孵育1 h，TBST洗膜3次后ECL顯影。采用Image J軟件分析條帶光密度值, 并計(jì)算各指標(biāo)與β-actin光密度值的比值。

2 結(jié)果

2.1QDPR融合蛋白成功表達(dá)用鼠單抗V5抗體檢測(cè)到C組QDPR融合蛋白的表達(dá)，A組以及B組未見目的蛋白表達(dá)，見圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后QDPR融合蛋白表達(dá)

2.2QDPR過表達(dá)對(duì)BH4含量的影響與B組相比，C組細(xì)胞和細(xì)胞液中BH4的含量明顯增多(P<0.05)，A組以及B組之間BH4的生成量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

圖2 QDPR過表達(dá)對(duì)BH4含量的影響與B組比較：##P<0.01

2.3QDPR過表達(dá)對(duì)PA誘導(dǎo)的ROS生成的影響PA刺激HEK293T細(xì)胞后，B組內(nèi)ROS生成增多，QDPR過表達(dá)(C組)顯著減少PA誘導(dǎo)的ROS生成，三組間F=263.95，可見QDPR顯著降低ROS的生成。見圖3。

圖3 QDPR過表達(dá)對(duì)PA誘導(dǎo)的ROS生成的影響與A組比較：**P<0.01；與B組比較：##P<0.01

2.4QDPR過表達(dá)對(duì)PA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路分子改變的作用經(jīng)過0.5 mmol/L PA刺激細(xì)胞24 h后，Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示：與A組相比，B組經(jīng)過PA刺激后細(xì)胞中Beclin 1和Caspase 3表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，Beclin 2表達(dá)水平下降(P<0.05)；QDPR過表達(dá)后，與B組比較，C組Beclin 1和Caspase 3表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，Beclin 2表達(dá)水平升高 (P<0.05)。見圖4。

圖4 QDPR過表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡通路分子蛋白表達(dá)的影響±s)

3 討論

QDPR在BH4再生過程中起到重要作用，并對(duì)維持體內(nèi)BH4含量穩(wěn)定有很重要意義[5]。而BH4是三種一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)激活所必需的輔助因子，當(dāng)BH4在體內(nèi)的含量不足時(shí)，NOS會(huì)產(chǎn)生脫偶聯(lián)導(dǎo)致ROS生成增多[6]。ROS又與糖尿病腎病的發(fā)生關(guān)系密切[7]。所以筆者提出假設(shè)QDPR可能通過BH4來調(diào)節(jié)ROS的含量，繼而影響細(xì)胞的自噬功能。課題組在前期差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[8]中發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病發(fā)展過程中，QDPR發(fā)生了突變，并且可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激過程與腎臟纖維化過程。但QDPR是否參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展有待進(jìn)一步研究。

糖尿病腎病患者的體內(nèi)存在明顯的PA紊亂，糖尿病腎病患者體內(nèi)PA增高會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎癥等通路的激活，這些通路的激活都參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[9]，高濃度的PA在腎臟中聚集還能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生自噬并發(fā)生凋亡[10-11]。凋亡是由十分復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控的，細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中重要的效應(yīng)因子是Caspase家族。Caspase 3是評(píng)價(jià)哺乳動(dòng)物凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，它降解凋亡過程中標(biāo)志性底物的活性最強(qiáng)，同時(shí)，也可以通過調(diào)節(jié)下游分子的表達(dá)來介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[12]。此外，抑制凋亡的家族成員(Bcl-2)是主要抗凋亡因子[13-14]。近年來有研究[15]顯示在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病腎病大鼠腎組織中存在著細(xì)胞凋亡活性的下調(diào)，包括促細(xì)胞凋亡基因表達(dá)較少以及抑制細(xì)胞凋亡基因表達(dá)增加。Beclin家族中的Beclin-2可以防止凋亡產(chǎn)生，是體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因之一，它通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白來達(dá)到抑制凋亡的目的。而Beclin 1是作為Beclin 2的交互蛋白被分離出來的，Beclin 1擁有與Beclin 2相似的結(jié)構(gòu)域，之后發(fā)現(xiàn)Beclin 1有促凋亡的作用，并且隨著細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，和Vps-Beclin 1復(fù)合體有關(guān)的自噬也被啟動(dòng)，從而引起凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染野生型QDPR重組質(zhì)粒后細(xì)胞中Beclin 2蛋白水平顯著增高，Beclin 1和Caspase 3的表達(dá)明顯降低，提示QDPR可能有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，由此推測(cè)QDPR可能和糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且課題組發(fā)現(xiàn)的QDPR可能是通過氧化應(yīng)激通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，但是它的具體分子機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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