全人源化PD-L1單抗功能活性及其對(duì)人肺腺癌HCC827細(xì)胞毒性作用的研究

謝慶書，束 軍，陳晴晴, 胡思怡

程序性死亡受體1(programmed death receptor-1，PD-1)最初在1992年從鼠T細(xì)胞雜交瘤中分離出來[1]，屬于CD28分子家族，表達(dá)在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面。PD-1有兩個(gè)已知的配體，包括程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1，PD-L1)又稱B7-1或CD274和程序性死亡配體-2 (programmed death ligand-2，PD-L2)又稱B7-DC或CD273[2]。PD-L1屬于B7家族成員，為Ⅰ型跨膜蛋白，在正常情況下，PD-1/PD-L1通路通過負(fù)性調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答防止過度刺激和維持自身抗原的免疫耐受[3]。然而，PD-L1在腫瘤組織中的過表達(dá)，包括黑色素瘤、卵巢癌及非小細(xì)胞肺癌[4]，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中的免疫反應(yīng)障礙。PD-1/PD-L1通路抑制T淋巴細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞因子的釋放，并降低T淋巴細(xì)胞活性，導(dǎo)致腫瘤特異性T細(xì)胞耗竭和凋亡[5]。PD-L1抗體可以抑制PD-L1與受體PD-1的相互作用解除其免疫抑制，增強(qiáng)T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性從而發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。該研究從分子及細(xì)胞水平初步驗(yàn)證自研PD-L1單抗的體外功能活性，為研究PD-L1類抗體提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞 人肺癌HCC827細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢癌細(xì)胞DHO-DG44(DHFR缺陷)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢癌細(xì)胞CHO-PD-L1-TCR及急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat-PD1-NFAT由安徽安科生物工程股份有限公司技術(shù)研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.2主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自Biosharp 公司，G418硫酸鹽 (G418 sulfate)及潮霉素B (hygromycin B，Hg)購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，生物素標(biāo)記的人PD-L1(Bio-hPD-L1)、人PD-1與鼠Fc的嵌合體(hPD-1-mFc)[7]突變體由安徽安科生物工程股份有限公司自行研制，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗人IgG1購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG1購(gòu)自美國(guó)Jackson公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗人IgG1 二抗、HRP標(biāo)記鏈酶親和素(簡(jiǎn)稱SA-HRP)購(gòu)自Thermo公司，熒光素酶試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega 公司，ExpressPlusTM預(yù)制膠購(gòu)自金斯瑞生物科技公司。以羅氏公開的PD-L1抗體Atezolizumab序列為參考，安徽安科生物工程(集團(tuán))股份有限公司自行構(gòu)建未糖基化的IgG1亞型的PD-L1抗體(為方便描述簡(jiǎn)稱阿特朱單抗)，自研全人源化PD-L1單抗由安徽安科生物工程(集團(tuán))股份有限公司饋贈(zèng)(簡(jiǎn)稱自研PD-L1單抗)。

1.1.3主要儀器 FLX800UV熒光分析儀購(gòu)于美國(guó)Biotek公司,超凈工作臺(tái)購(gòu)于蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman 公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HCC827細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng); Jurkat-PD1-NFAT、CHO-PD-L1-TCR細(xì)胞分別用含有0.5 mg/ml G418和0.1 mg/ml Hg加壓的Ham's F12和RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，消化傳代培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2十二烷基硫酸鈉聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定兩抗體純度 轉(zhuǎn)染PD-L1的CHO-DG44 細(xì)胞的上清液中含抗體，經(jīng)過濾、提純、12%ExpressPlusTM預(yù)制膠凝膠電泳、考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.3ELISA法測(cè)定兩抗體的結(jié)合活性及阻斷活性 緩沖液分別稀釋hPD-L1及hPD-1-mFc鋪板，100 μl/孔4 ℃冰箱鋪板過夜。TPBS(含0.1% Tween20的PBS)洗滌3次，封閉劑37 ℃烘箱封閉1 h。TPBS洗滌3次，結(jié)合：封閉劑分別稀釋兩抗體使?jié)舛?1 μg/ml, 3倍稀釋，依次稀釋8個(gè)梯度，100 μl/孔；阻斷：稀釋后的兩抗體(8 μg/ml開始,4倍稀釋)分別與Bio-hPD-L1(終濃度為50 ng/ml)預(yù)混，向96孔板加入100 μl/孔，室溫震蕩孵育1 h。TPBS洗3次，分別加封閉劑稀釋的HRP-羊抗人Fc、HRP-羊抗鼠Fc二抗 100 μl/孔，室溫震蕩孵育30 min。TPBS洗3次，加入OPD顯色、終止、酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm吸光值,每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞阻斷實(shí)驗(yàn)測(cè)定兩抗體的阻斷活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO-PD-L1-TCR細(xì)胞(5×105/ml)接種于96孔板，其余孔加入等體積的PBS，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24 h。用含10% FBS的RPMI1640(理論buffer)培養(yǎng)基稀釋抗體使終濃度為100 μg/ml，3倍梯度稀釋，濃度依次為100.00、33.33、11.11、3.70、1.23、0.41、0.05、0.02、0.00 μg/ml。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat-PD1-NFAT細(xì)胞，計(jì)數(shù)、離心后用理論Buffer重懸調(diào)整細(xì)胞濃度為6.25×105/ml。棄96孔板中細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分別加入稀釋后自研PD-L1單抗、阿特朱單抗，其余孔加等體積PBS,室溫孵育20 min后，向96孔板中加入Jurkat-PD1-NFAT，其余孔加入等體積的PBS，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后每孔加入熒光酶底物Bio-GloTMReagent，37 ℃烘箱孵育10 min后FLX800UV酶標(biāo)儀上機(jī)檢測(cè)其相對(duì)光單位(RLU)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。RLU標(biāo)化值=實(shí)驗(yàn)組相對(duì)光單位/對(duì)照組相對(duì)光單位。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)HCC827細(xì)胞PD-L1的表達(dá) 收集 HCC827細(xì)胞5×105個(gè)，分對(duì)照組(抗體為0)和實(shí)驗(yàn)組，用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS封閉后，加入自研PD-L1單抗(10、1、0.1、0.01 μg/ml)，冰上孵育30 min，封閉液洗滌2次后，再加入FITC-羊抗人IgG二抗，重復(fù)上述洗滌3次后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6細(xì)胞毒性試劑盒檢測(cè)抗體ADCC效應(yīng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC827細(xì)胞用5%FBS的無酚紅RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml接種于圓底96孔板，每孔50 μl。自研PD-L1單抗、阿特朱單抗用培養(yǎng)基稀釋至終濃度為1 μg/ml，4倍梯度稀釋，共9個(gè)梯度,每孔加入50 μl。將昨日提取的等體積的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(human peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)(2×106/ml)，每孔加入50 μl，6 000 r/min離心4 min，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后，6 000 r/min離心板子4 min，取50 μl上清液至新的96孔板。每孔加入顯色試劑50 μl，室溫避光顯色30 min，酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm吸光值。靶細(xì)胞組：設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入上述濃度的HCC 827細(xì)胞50 μl，然后用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)體積為150 μl；靶細(xì)胞最大裂解組：設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入上述濃度的HCC 827細(xì)胞50 μl，收集上清液之前15 min加入細(xì)胞裂解液，使之充分裂解；效靶細(xì)胞組：設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，為未加入抗體，用等體積的培養(yǎng)基替代。細(xì)胞裂解率=OD(實(shí)驗(yàn)組-效靶細(xì)胞組)/OD(靶細(xì)胞最大裂解組-靶細(xì)胞組)。

2 結(jié)果

2.1兩抗體SDS-PAGE電泳分析轉(zhuǎn)染PD-L1的CHO-DG44細(xì)胞，其培養(yǎng)上清液經(jīng)過過濾、提純后, SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，阿特朱單抗與自研PD-L1抗體經(jīng)過二硫蘇糖醇(DTT)還原后，由分別是45、20 ku輕重鏈組成，與分子為130 ku的未還原型阿特珠單抗及自研PD-L1單抗相符，見圖1。

圖1 阿特朱單抗及自研PD-L1抗體凝膠電泳分析

M：marker；A～D分別為未還原型阿特朱單抗、自研PD-L1單抗；還原型阿特朱單抗、自研PD-L1單抗

2.2ELISA實(shí)驗(yàn)中兩抗體的結(jié)合與阻斷活性結(jié)果表明阿特朱單抗及自研PD-L1單抗均可以與hPD-L1結(jié)合，EC50分別為7.88 ng/ml、18.86 ng/ml(圖2A)。兩者均可以競(jìng)爭(zhēng)性阻斷hPD-L1與hPD-1-mFc的結(jié)合，IC50分別為56.28 ng/ml和190.70 ng/ml(圖2B)。自研PD-L1單抗的結(jié)合和阻斷活性稍弱于阿特朱單抗。

2.3細(xì)胞阻斷實(shí)驗(yàn)中兩抗體的阻斷活性利用基因工程改造的兩個(gè)細(xì)胞株：CHO-PD-L1-TCR細(xì)胞分別為穩(wěn)定表達(dá)PD-L1和TCR激活劑，Jurkat-PD-1-NFAT細(xì)胞含熒光素酶驅(qū)動(dòng)基因NFAT并表達(dá)PD-1。當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，Jurkat-PD-1-NFAT細(xì)胞表面的TCR被CHO細(xì)胞表面的TCR激活劑激活，熒光素酶基因表達(dá)，但兩細(xì)胞表面PD-L1與PD-1的結(jié)合阻斷TCR信號(hào)，導(dǎo)致熒光素酶活性減弱。PD-L1抗體可以阻斷PD-L1/PD-1抑制通路，導(dǎo)致TCR信號(hào)及下游熒光素酶活化。細(xì)胞阻斷試驗(yàn)結(jié)果表明，阿特朱單抗及自研PD-L1單抗均可阻斷兩細(xì)胞表面PD-L1與PD-1的結(jié)合，EC50分別為0.154 8 μg/ml和0.208 5 μg/ml。如圖3所示，阿特朱單抗及自研PD-L1單抗從低濃度(0 μg/ml)到高濃度(100 μg/ml)對(duì)應(yīng)的RLU標(biāo)化值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩抗體在相同濃度下利用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，各濃度組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩個(gè)抗體EC50沒有明顯差異，劑量效應(yīng)呈S型曲線關(guān)系。

圖2 不同濃度阿特朱單抗及自研PD-L1單抗與hPD-L1的結(jié)合及兩抗體阻斷hPD-L1與PD-mFc結(jié)合

A：阿特朱單抗及PD-L1單抗的結(jié)合活性；B：阿特朱單抗及PD-L1單抗的阻斷活性

圖3 不同濃度阿特朱單抗及自研PD-L1單抗阻斷兩細(xì)胞表面PD-L1與PD-1的結(jié)合

2.4FACS測(cè)定人肺腺癌HCC827細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)以自研PD-L1單抗作為一抗，檢測(cè)結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)隨著抗體濃度增加，熒光強(qiáng)度逐漸增加。表明肺腺癌HCC827細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，自研PD-L1抗體與腫瘤細(xì)胞表面PD-L1抗原分子有特異結(jié)合，見圖4。

圖4 HCC827細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)

H-NC：陰性對(duì)照；H-3-10、H-3-1、H-3-0.1、H-3-001分別指10、1、0.1、0.01 μg/ml自研PD-L1抗體對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度

2.5細(xì)胞毒性試驗(yàn)中兩抗體對(duì)HCC827的毒性作用效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比值為20 ∶1時(shí)，阿特朱單抗及自研PD-L1單抗均可以介導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)人肺腺癌HCC827細(xì)胞的殺傷活性，即有ADCC效應(yīng)，并隨著抗體濃度增加，殺傷活性增強(qiáng)，呈S型劑量效應(yīng)曲線。利用單因素方差分析，分別比較自研PD-L1抗體各組(包括對(duì)照組即未加抗體組)細(xì)胞裂解率，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=146.234，P=0.000)，利用單因素方差分析比較阿特朱單抗各實(shí)驗(yàn)組之間裂解率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=196.235，P=0.000)。利用Graphpad Prism 6軟件以抗體濃度對(duì)數(shù)為x軸，細(xì)胞溶解率為y軸(圖5)，自研PD-L1及阿特朱單抗的EC50分別為1.791 ng/ml和1.033 ng/ml。

3 討論

在各種類型的癌癥患者中，肺癌是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)的85%, 5年生存率不到15%[8]。以鉑類藥物為基礎(chǔ)的雙藥聯(lián)合化療是未提示基因突變或者易位的晚期非小細(xì)胞肺癌的一線治療[9]，反應(yīng)率僅有15%～30%[10]。雖然肺癌患者有一部分亞群由特異性驅(qū)動(dòng)基因的變異引起，通過分子靶向療法一定程度可以提高患者中位生存期，然而肺癌治療仍受限。過去人們認(rèn)為肺癌是無免疫原性的腫瘤[11]，然而近年來免疫治療特別是針對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑相關(guān)的抗體使肺癌患者獲益。2015年、2016年分別針對(duì)PD-1、PD-L1的抗體：納武單抗(novolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)和阿特朱單抗被批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞肺癌的治療。例如羅氏的阿特朱單抗被批準(zhǔn)用于鉑類為基礎(chǔ)的初始化療失敗或進(jìn)展的轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌的二線治療[12]。

圖5 阿特朱單抗及自研PD-L1單抗介導(dǎo)人PBMCs對(duì)HCC827的毒性作用

PD-L1不僅可以和PD-1結(jié)合，也可以與CD80結(jié)合，而靶向PD-L1的抗體是通過阻斷PD-L1與PD-1的結(jié)合而間接發(fā)揮抗腫瘤作用的，本研究中ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明自研PD-L1單抗可以與hPD-L1結(jié)合，并且可以競(jìng)爭(zhēng)性阻斷hPD-L1與hPD-1的結(jié)合。有研究[13]應(yīng)用基因工程設(shè)計(jì)的高表達(dá)hPD-1和AP-1驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因的Jurkat/AP-1-Luc/hPD-1 細(xì)胞和表達(dá)人CD20和hPD-L1的HEK293/hCD20/hPD-L1細(xì)胞檢測(cè)PD-1單抗REGN2810生物學(xué)活性。本研究用相似模型在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證自研PD-L1單抗可以阻斷兩細(xì)胞表面PD-L1與PD-1的結(jié)合，并且在一定程度上表明自研PD-L1單抗可以通過阻斷PD-L1/PD-1通路激活T細(xì)胞受體下游信號(hào)。

PD-L1在胃癌[14]、肺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，胃癌組織中PD-L1的高表達(dá)與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征相關(guān)，提示靶向PD-L1抗體可作為肺癌潛在治療方法。PD-L1抗體不僅可以通過抑制PD-L1/PD-1通路發(fā)揮抗腫瘤作用，ADCC效應(yīng)也可以發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，本研究細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明自研PD-L1單抗及阿特朱單抗均有ADCC效應(yīng)，對(duì)肺癌細(xì)胞HCC827有相似的毒性作用。雖然研究[15]顯示運(yùn)用來自同一供體的從外周血單個(gè)核細(xì)胞提取的NK細(xì)胞與人PBMCs相比較，純化的NK細(xì)胞與Bavencio(Avelumab)能夠產(chǎn)生更大的溶解活性，實(shí)驗(yàn)中以人PBMCs作為效應(yīng)細(xì)胞驗(yàn)證也是可行的。

綜上所述，該自研PD-L1單抗在體外有一定的功能活性，能夠介導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)人肺腺癌HCC827細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。以往被批準(zhǔn)PD-L1單抗大多是從雜交瘤細(xì)胞獲得，生產(chǎn)成本高并且雜交瘤細(xì)胞基因穩(wěn)定性不易維持，有免疫原性。該自研抗體是從全人源噬菌體抗體庫(kù)篩選和改造的，推測(cè)具有相對(duì)較低的免疫原性，然而本實(shí)驗(yàn)有一定的局限性，在動(dòng)物和臨床上的應(yīng)用還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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