TLR7激活上調(diào)細胞周期蛋白表達促進Hela細胞增殖

劉 莉，李 磊，顧亞男，周 宏，羅 欣，張勝權(quán)

宮頸癌在世界上是第二個主要引起女性癌癥死亡的疾病[1]，引起女性宮頸癌的主要原因是人乳頭狀瘤病毒感染。此外，一些其他的致病因子，例如普通細菌、病毒和原生動物病原體感染女性生殖道引起黏膜炎癥參與宮頸癌的發(fā)生[2]。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一種重要的模式識別受體廣泛表達在天然免疫系統(tǒng)，是一類I型跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成。TLRs在固有免疫和獲得性免疫中扮演著重要的角色。Toll樣受體7(TLR7)是Toll樣受體家族成員之一，位于核內(nèi)體表面[3]，能夠識別單鏈RNA，包括人類免疫缺陷病毒、流感病毒、水皰性口炎病毒等[4-5]。TLRs家族的信號機制是依賴于胞質(zhì)區(qū)的接頭蛋白分子和激酶進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。根據(jù)接頭蛋白的不同，可以分為銜接蛋白(MyD88)依賴性和非依賴性途徑。定位于胞內(nèi)的TLR7與配體識別后，募集TIR結(jié)構(gòu)域，激活有絲分裂原激活蛋白激酶和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)信號途徑，進而調(diào)控促炎性細胞因子基因的表達，發(fā)揮其抗病毒及抗腫瘤作用[6-7]。咪唑喹啉類(Imiquimod)是一種新型的具有核苷類似物結(jié)構(gòu)的家族成員之一，可以激活TLR7信號通路，但其機制尚不完全清楚。咪唑喹啉衍生物(Gardiquimod)與Imiquimod都是TLR7激動劑，能夠激活TLR7信號途徑，但與Imiquimod相比較，Gardiquimod在腫瘤治療中展現(xiàn)出更大的潛在發(fā)展性[8]。前期研究[9]顯示Gardiquimod能夠促進Hela細胞增殖，該研究進一步探討了Gardiquimod激活TLR7通路促進Hela細胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑Hela細胞購自美國ATCC公司；胎牛血清和DMEM購自美國Gibco公司；胰酶、RIPA裂解液、青霉素鏈霉素溶液及周期試劑盒購自中國上海碧云天生物公司；MTS試劑盒及Gardiquimod購自美國Sigma公司；Cyclin B1、Cyclin E及β-actin均購自美國Abcam公司；二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人宮頸癌細胞Hela生長于含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

1.2.2細胞增殖實驗(MTS) 胰酶消化收集Hela細胞，并調(diào)整細胞懸液濃度為3×104/ml，分別接種于96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng)箱貼壁24 h，加入Gardiquimod藥液，使終濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg/ml，并設(shè)對照組(0 μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后加入MTS試劑，放入溫箱孵育3 h后用酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度。同上述方法種96孔板，加入終濃度為2 μg/ml的Gardiquimod藥液，作用時間分別為1～5 d，對照組培養(yǎng)液加入相同濃度的PBS，5 d后加入MTS試劑，放入溫箱孵育3 h后用酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度。根據(jù)對照組數(shù)值計算每組細胞存活率。

1.2.3細胞周期檢測 胰酶消化收集Hela細胞并調(diào)整細胞懸液濃度為5×104/ml，分別接種于12孔板，每孔加入1 ml，培養(yǎng)箱貼壁24 h，加入終濃度為2 μg/ml的Gardiquimod藥液，作用時間分別為1～5 d，對照組培養(yǎng)液加入相同濃度的PBS。胰酶消化再次收集細胞，按照周期試劑盒操作指南，室溫下避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期，采用Flowjo軟件分析細胞周期，實驗重復(fù)3次。

1.2.4Western blot檢測周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E的表達 胰酶消化收集Hela細胞，并調(diào)整細胞懸液濃度為5×104/ml，分別接種于24孔板，每孔加入0.5 ml，待細胞長到80%匯合時加入終濃度為2 μg/ml的Gardiquimod藥液，作用時間分別為0.2、0.5、1、3、6、12、24 h并設(shè)置對照組。培養(yǎng)后收集每組細胞總蛋白進行SDS-PAGE電泳，按10 μl/孔上樣量加入10%凝膠孔中，依次進行：電泳(濃縮膠60 V，分離膠120 V約2 h)、轉(zhuǎn)移(300 mA恒流1.5 h)、封閉(5%的脫脂牛奶常溫封閉2 h)、孵育一抗(4 ℃孵育過夜)、孵育二抗(常溫?fù)u床孵育2 h)、Thermo Scientific SuperSignal West Pico Trial Kit化學(xué)發(fā)光底物顯影，分析周期蛋白的表達。

2 結(jié)果

2.1Gardiquimod促進Hela細胞增殖隨著Gardiquimod藥物濃度的增加，細胞相對存活率呈明顯的上升趨勢，當(dāng)Gardiquimod藥液濃度為2 μg/ml時Hela細胞相對存活率最大(130%),與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)Gardiquimod藥物濃度一定時，隨著作用時間的增加，細胞相對存活率增加，在第5天相對存活率最大(135%)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2Gardiquimod對Hela細胞周期的影響當(dāng)Gardiquimod藥物濃度(2 μg/ml)一定時，隨著時間的增加，Hela細胞周期中的S期呈逐漸上升趨勢，第2、4、5天實驗組細胞DNA平均含量為14.85%、16.06% 和19.09%，與對照組(10.96%)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=32.997,P<0.05)。G0/G1期隨著作用時間的增加呈現(xiàn)下降的趨勢,第2、4、5天實驗組細胞DNA平均含量為74.36%、74.01%和73.11%，與對照組(81.85%)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=54.585，P<0.05)。而G2/M期細胞無明顯變化。見圖2。

2.3周期蛋白CyclinB1、CyclinE的表達Western blot結(jié)果顯示經(jīng)Gardiquimod處理Hela細胞后，隨著時間的增加，細胞內(nèi)Cyclin B1、Cyclin E蛋白的含量明顯增加，各實驗組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 MTS分析Gardiquimod不同濃度和不同時間對Hela細胞增殖的影響

A:不同濃度的Gardiquimod作用Hela細胞72 h后對細胞增殖的影響；B:Gardiquimod(2 μg/ml)作用Hela細胞不同時間后對細胞增殖的影響；與對照組(0 μg/ml)比較：*P<0.05

3 討論

TLRs通過識別保守的病原體相關(guān)的分子位點，例如細菌的脂多糖、脂肽，或者是細菌和病毒的DNA、RNA 等，誘發(fā)獲得性免疫反應(yīng)。此外TLR7還廣泛表達于多種組織和細胞，包括DC、B、T 細胞等。

圖2Gardiquimod作用Hela細胞不同時間后對細胞周期的影響

A：Gardiquimod作用Hela細胞不同時間后對細胞周期的影響；B：分析Gardiquimod作用Hela細胞不同時間后各細胞周期所占比例；1：對照組；2：第1天；3：第2天；4：第3天；5：第4天；6：第5天；與對照組比較：*P<0.05

圖3 Western blot分析Cyclin B1、Cyclin E的表達

A：Gardiquimod作用Hela細胞不同時間后對Cyclin B1、Cyclin E表達的影響；B：分析Cyclin B1的表達；C：分析Cyclin E的表達；1：對照組；2：0.2 h；3：0.5 h；4：1 h；5：3 h；6：6 h；7：12 h；8：24 h；與對照組比較：*P<0.05

TLR7激活后可誘導(dǎo)多種炎癥因子表達，包括白介素-10、白介素-12、白介素-23、干擾素γ、白介素-2等。研究[10]顯示TLR7的激活在人乳頭狀瘤病毒感染引起的癌癥治療中通過增加巨噬細胞和NK細胞的活性從而抑制腫瘤的增殖。Gardiquimod，TLR7激動劑，在鼠科動物前列腺癌和膀胱癌中對腫瘤的增殖具有抑制作用并且在細胞周期的G2/M期產(chǎn)生阻滯作用[11]。然而，本研究顯示：當(dāng)Gardiquimod作用Hela細胞后，S期DNA增加明顯，細胞增殖旺盛。國外研究[12]顯示，Cyclin E經(jīng)常在腫瘤細胞中過度表達，這種過度表達與乳腺癌患者的生存率下降有關(guān)。本研究顯示：細胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E隨著Gardiquimod作用時間的增加而增加， TLR7信號通路激活后引起細胞周期的改變，周期蛋白水平也隨之改變。Cyclin B1、Cyclin E 的上調(diào)可能參與TLR7信號通路的激活從而促進Hela細胞增殖。這一研究結(jié)果提示Gardiquimod對不同的腫瘤可能存在不同的作用，甚至是相反的結(jié)果，具體機制待進一步研究。

綜上所述，Gardiquimod引起Hela細胞周期和周期蛋白發(fā)生了變化，并對Hela細胞的增殖起到了一定的促進作用，首次發(fā)現(xiàn)了TLR7的激活與宮頸癌細胞增殖的相關(guān)關(guān)系，為研究宮頸癌提供了一個新的思路。

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