國(guó)標(biāo)法檢測(cè)蜂蜜淀粉酶值實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革與創(chuàng)新

楊萍萍，袁 朋，徐瑞雪，李建亮，崔言順

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271000)

蜂蜜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，口感獨(dú)特，深受消費(fèi)者歡迎[1-2]。在蜂蜜所含有的一系列營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中，生物酶是其主要的生物活性物質(zhì)，其中淀粉酶的含量最高，能夠促進(jìn)人體對(duì)食物的消化和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[3-4]。但目前市場(chǎng)上蜂蜜產(chǎn)品的質(zhì)量參差不齊，真假難辨[5-8]，而蜂蜜淀粉酶活性的檢測(cè)是控制商品化蜂蜜產(chǎn)品質(zhì)量和安全的重要指標(biāo)之一[9-10]。

蜂蜜淀粉酶值的檢測(cè)方法有試管比色法和分光光度計(jì)法，其中分光光度計(jì)法是最新的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[11-12]。為和社會(huì)實(shí)際銜接，學(xué)校對(duì)蜂蜜淀粉酶值檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)進(jìn)行了一系列的改革，其中“國(guó)標(biāo)進(jìn)課堂”取代陳舊實(shí)驗(yàn)方法就是其中一項(xiàng)重要舉措。在改革的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)不同于簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，需要幾十人同時(shí)進(jìn)行，涉及儀器、耗材、場(chǎng)地的共享使用，簡(jiǎn)單地照搬照抄國(guó)標(biāo)方法并不能直接用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)。為使國(guó)標(biāo)法更好地適應(yīng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)衛(wèi)生檢驗(yàn)教研組對(duì)蜂蜜淀粉酶值檢測(cè)的部分內(nèi)容進(jìn)行了改革和創(chuàng)新。

1 實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)

1.1 材料

1)蜂蜜：來(lái)源于山東泰安某養(yǎng)蜂場(chǎng)的新鮮百花蜜。

2)試劑及配制：碘化鉀、碘、乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)、可溶性淀粉、氯化鈉、冰乙酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。按國(guó)標(biāo)GB/T18932.16—2003要求[12]分別配制0.5 mol·L-1氯化鈉溶液、乙酸鹽緩沖液、2%淀粉溶液、碘溶液等。

3)儀器：超純水系統(tǒng)(Pall，USA)；微量移液器(Eppendorf，Germany)；電子恒溫水浴鍋(常州國(guó)立，中國(guó))；Elx808多功能全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Biotek，USA)；可拆分酶標(biāo)板(江蘇光明器材)。

1.2 方法

1)樣品準(zhǔn)備。將采購(gòu)的蜂蜜樣品充分?jǐn)嚢杈鶆颍鸺訜?。每組分裝100 g于燒杯中作為待檢樣品，標(biāo)記后供淀粉酶值測(cè)定用，常溫保存，勿冷藏。

2)標(biāo)定淀粉溶液。3支試管分別裝有10 mL水、5 mL淀粉溶液和10 mL碘溶液，放入40℃水浴中預(yù)熱15 min。然后將5 mL淀粉溶液全部加入到10 mL水的試管中混合均勻作為待檢的樣品混合液，從中吸取1 mL混合液加入到10 mL的碘溶液試管中，再加入一定體積的水稀釋(先加入少量，需多次加入確定準(zhǔn)確的水體積)。取200 mL加入酶標(biāo)板的檢測(cè)孔中，以水作為空白參照，用多功能全自動(dòng)酶標(biāo)儀在660 nm波長(zhǎng)測(cè)定溶液的吸光度(原國(guó)標(biāo)中是用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，需取2 mL加入比色皿中待檢)，若吸光度值較高則繼續(xù)加水進(jìn)行檢測(cè)，直到產(chǎn)生0.760±0.02的吸光度值。記錄多次加入的全部水的體積數(shù)，并以此作為檢測(cè)樣品溶液時(shí)的稀釋系數(shù)。淀粉溶液新配制后應(yīng)重新進(jìn)行標(biāo)定。

3)樣品檢測(cè)。

①全自動(dòng)酶標(biāo)儀的檢測(cè)條件，波長(zhǎng)為660 nm；陰性對(duì)照為水。

②樣品處理，稱取精確至0.01 g的蜂蜜樣品5 g，加入水15 mL和乙酸鹽緩沖液2.5 mL，玻璃棒攪拌混勻后全部轉(zhuǎn)移到提前加入氯化鈉溶液1.5 mL的25 mL容量瓶中，加水定容，作為樣品溶液待檢。

③樣品檢測(cè)，5 mL淀粉溶液1支、10 mL樣品溶液1支和10 mL碘溶液15支(原國(guó)標(biāo)方法中碘溶液是1支)，均提前放入40℃水浴中預(yù)熱15 min。將5 mL淀粉溶液全部轉(zhuǎn)入樣品溶液，然后充分混合開(kāi)始計(jì)時(shí)。5 min時(shí)取樣品混合溶液1 mL加入到盛有10 mL碘溶液的試管中，以標(biāo)定淀粉溶液時(shí)確定的水的體積數(shù)稀釋并混勻充分。取200 mL加入酶標(biāo)板的檢測(cè)孔中，以水作為空白參照，用多功能全自動(dòng)酶標(biāo)儀于660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定待檢樣品吸光度(原國(guó)標(biāo)方法中使用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，需取2 mL待檢液加入比色皿中，且比色皿要不斷清洗，并漂洗)。如吸光度值大于特定吸光度值0.235，則重新吸取樣品混合液加入到另1支碘溶液中進(jìn)行測(cè)定，每隔5 min檢測(cè)一次，直到吸光度值小于0.235為止。

④ 數(shù)據(jù)處理，以吸光度值為縱坐標(biāo)，檢測(cè)時(shí)間為橫坐標(biāo)，在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，連接各點(diǎn)成直線。然后在直線上查出樣品吸光度與0.235交叉點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的檢測(cè)時(shí)間，計(jì)算結(jié)果為:

X=300/t

式中，X為所測(cè)樣品溶液的淀粉酶值，單位為mL·g-1·h-1(毫升每克小時(shí))；t為對(duì)應(yīng)的檢測(cè)時(shí)間，單位為min。

2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)的實(shí)施

2.1 學(xué)生分組

在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，指導(dǎo)教師提前一周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)布置，學(xué)生自由組合成2～3人的小組，小組內(nèi)成員合理分工，并指定一人負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)用品的領(lǐng)用、歸還以及數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、報(bào)送等。由班長(zhǎng)負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)分組數(shù)及小組成員名單，并于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前上報(bào)給指導(dǎo)教師，由實(shí)驗(yàn)教師審核成員組合及分工是否合理。實(shí)驗(yàn)樣品、耗材、器皿等均按小組編號(hào)分發(fā)。

2.2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

指導(dǎo)教師提前布置實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，制定實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)和要求。實(shí)驗(yàn)教師進(jìn)行實(shí)驗(yàn)器材分組，并準(zhǔn)備好備份。然后學(xué)生以實(shí)驗(yàn)小組為單位，課前進(jìn)行合理分工，查閱相關(guān)資料，熟悉實(shí)驗(yàn)器材，制定出具體的實(shí)驗(yàn)方案。指導(dǎo)教師針對(duì)每個(gè)小組的實(shí)驗(yàn)方案提出指導(dǎo)性意見(jiàn)和建議。

2.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程的改進(jìn)

國(guó)標(biāo)方法“蜂蜜中淀粉酶值的測(cè)定方法分光光度法GB/T18932.16—2003”在用于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)，由于參與實(shí)驗(yàn)人數(shù)多、實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地?fù)頂D、儀器數(shù)量有限等原因，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中出現(xiàn)了諸多問(wèn)題，不能有效保障實(shí)驗(yàn)秩序的穩(wěn)定和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性。為有利于實(shí)驗(yàn)教學(xué)的順利進(jìn)行，學(xué)校衛(wèi)生檢驗(yàn)教研組對(duì)實(shí)驗(yàn)方法及儀器檢測(cè)等進(jìn)行了部分改進(jìn)。

首先為減少誤差，使實(shí)驗(yàn)中所用試劑準(zhǔn)確保持在40℃，樣品檢測(cè)中除了提前將樣品、淀粉溶液和碘溶液放在水浴中保溫外，需準(zhǔn)備15支10 mL的碘溶液而不是1支。原因是淀粉和樣品混合液共有15 mL，每次取1 mL可以取15次，而碘溶液10 mL只能使用一次，即使大瓶的碘溶液放在水浴中能保持在40℃，但分裝用的試管沒(méi)有預(yù)熱仍會(huì)造成誤差，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。預(yù)熱15支碘溶液比原國(guó)標(biāo)方法中僅預(yù)熱1支碘溶液能更有效地保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確度、科學(xué)性和有效性。

其次檢測(cè)儀器使用多功能酶標(biāo)儀替代分光光度計(jì)。在樣品檢測(cè)過(guò)程中需要5 min測(cè)定一次，若OD值變化較快，則需要1 min測(cè)定一次，時(shí)間間隔比較短，不同小組之間不可能共用1臺(tái)分光光度計(jì)。以一個(gè)班10～15個(gè)小組計(jì)至少需要10～15臺(tái)分光光度計(jì)，而目前實(shí)驗(yàn)室的條件最多只能提供4臺(tái)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。再加上更換、清洗比色皿以及校零的時(shí)間，誤差在所難免。而多功能酶標(biāo)儀配合使用可拆分一次性酶標(biāo)條，一個(gè)小組1條8個(gè)孔，自己做好標(biāo)記，每次加樣1孔，一臺(tái)酶標(biāo)儀可同時(shí)檢測(cè)12個(gè)小組，且不用清洗，自動(dòng)校零，大大提高了時(shí)間的精確性和結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 實(shí)驗(yàn)考核

實(shí)驗(yàn)課程的考核以小組為單位進(jìn)行，兼顧小組中個(gè)人的表現(xiàn)。分別從文獻(xiàn)查閱是否充分、實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)是否合理、實(shí)驗(yàn)操作是否規(guī)范、實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷是否合理，以及實(shí)驗(yàn)衛(wèi)生整潔程度等方面做出評(píng)價(jià)。

3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果

3.1 實(shí)驗(yàn)秩序

該次實(shí)驗(yàn)教學(xué)經(jīng)過(guò)對(duì)參與實(shí)驗(yàn)的學(xué)生提前分組，以小組為單位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備，然后獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)操作以及數(shù)據(jù)的記錄和整理計(jì)算，發(fā)現(xiàn)除個(gè)別小組準(zhǔn)備不充分，儀器操作不夠熟練外，其余組都進(jìn)行了充分的資料收集和器材準(zhǔn)備，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行得有條不紊，井然有序。完全不同于之前實(shí)驗(yàn)課中無(wú)準(zhǔn)備、無(wú)目的性地照著板書(shū)上實(shí)驗(yàn)步驟呆板地稱量加樣、少數(shù)學(xué)生動(dòng)手多數(shù)學(xué)生在實(shí)驗(yàn)室中轉(zhuǎn)圈、依賴?yán)蠋煵僮鲀x器等狀況。準(zhǔn)備不充分的小組在看到別的小組實(shí)驗(yàn)進(jìn)展順利時(shí)明顯感受到了壓力，這將對(duì)以后的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作起到一定的督促作用。

3.2 改進(jìn)效果

從蜂場(chǎng)采集的新鮮蜂蜜淀粉酶值一般在8～10之間，測(cè)定過(guò)程至少需要持續(xù)30～45 min，5 min測(cè)定一次則需要測(cè)定10～15次，國(guó)標(biāo)中樣品混合液可以待檢15次，而碘溶液只有1支，測(cè)定過(guò)程中需要不斷重裝碘溶液，碘溶液的溫度得不到保證，且學(xué)生需要不斷在實(shí)驗(yàn)室中來(lái)回走動(dòng)，造成秩序混亂。溫度是影響酶促反應(yīng)的決定性因素，反應(yīng)溫度的差異將會(huì)直接導(dǎo)致酶促反應(yīng)的快慢不一致，致使最終計(jì)算出的淀粉酶值出現(xiàn)誤差。改進(jìn)后的國(guó)標(biāo)法直接準(zhǔn)備好15支碘溶液，需要測(cè)定時(shí)隨取隨用，既避免了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中學(xué)生頻繁找試管、洗試管、重裝碘溶液的麻煩，保證了實(shí)驗(yàn)溫度的一致性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確度，又使實(shí)驗(yàn)進(jìn)行得井然有序，保障了實(shí)驗(yàn)秩序。

分光光度計(jì)一般只有4個(gè)比色皿槽，其中1個(gè)要加入空白對(duì)照，僅余下3個(gè)槽位可以放置待檢樣品，放置好后需要手動(dòng)拉桿檢測(cè)，檢測(cè)樣品少，且需要時(shí)間比較長(zhǎng)。另外比色皿需要及時(shí)清洗、再用待檢液漂洗，在本實(shí)驗(yàn)中樣品需要5 min檢測(cè)一次，就會(huì)顯得手忙腳亂，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)不可避免的誤差。而全自動(dòng)酶標(biāo)儀具有連續(xù)波長(zhǎng)，波長(zhǎng)選擇范圍比較大，能夠滿足不同波長(zhǎng)的需求。實(shí)驗(yàn)中使用可拆分96孔酶標(biāo)板，可同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣品，即使一個(gè)小組1條，也可以同時(shí)檢測(cè)12個(gè)小組的樣品。且全自動(dòng)酶標(biāo)儀可以自動(dòng)進(jìn)樣，然后進(jìn)行掃描檢測(cè)，只要提前在電腦上設(shè)計(jì)好板的布局，將酶標(biāo)板放在檢測(cè)臺(tái)上，點(diǎn)擊“檢測(cè)”就可以了，檢出結(jié)果會(huì)自動(dòng)扣除空白或者陰性對(duì)照，一目了然。既避免了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中清洗比色皿更換樣品的環(huán)節(jié)，又縮短了學(xué)生等待檢測(cè)的時(shí)間，減少了實(shí)驗(yàn)誤差，有效保障了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.3 考核結(jié)果

鑒于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中學(xué)生的獨(dú)立性稍差，無(wú)法單獨(dú)完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及具體操作，因此采用小組內(nèi)團(tuán)隊(duì)合作的形式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在考核時(shí)要兼顧到小組的整體成果和小組內(nèi)個(gè)人的貢獻(xiàn)和表現(xiàn)。在對(duì)每個(gè)小組的實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行考核時(shí)發(fā)現(xiàn)大部分小組對(duì)數(shù)據(jù)的記錄、整理、計(jì)算等非常清晰，課后能夠?qū)?shí)驗(yàn)過(guò)程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行完整的總結(jié)匯報(bào)和正確的結(jié)果分析，甚至有的小組還配備了圖片說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中隨時(shí)間變化淀粉酶分解淀粉后剩余淀粉和碘溶液反應(yīng)產(chǎn)生顏色的變化過(guò)程。表明學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)出現(xiàn)的結(jié)果及數(shù)據(jù)變化進(jìn)行了充分的思考和分析，這次實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改進(jìn)充分調(diào)動(dòng)了學(xué)生的實(shí)踐動(dòng)手熱情，也促進(jìn)了高校對(duì)創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)。

4 結(jié)束語(yǔ)

“民以食為天，食以安為先”，國(guó)標(biāo)進(jìn)課堂進(jìn)行蜂蜜的衛(wèi)生檢驗(yàn)，縮短了高校與社會(huì)之間的距離，激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情。而改進(jìn)后的國(guó)標(biāo)法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)保障了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，減少了誤差。同時(shí)高值精密儀器的使用也拓寬了學(xué)生的視野[13]，調(diào)動(dòng)了學(xué)習(xí)的積極性，提高了實(shí)踐動(dòng)手能力，收到了超出預(yù)期的實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。