CRISPR/Cas9在腫瘤治療中的研究進(jìn)展

呂寶北, 趙鵬翔, 張 鑫, 馬雪梅, 謝 飛

北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院, 北京 100124

癌癥作為威脅人類健康及生命的一種嚴(yán)重疾病，其發(fā)生率和死亡率一直居高不下。其病因往往是細(xì)胞基因組中的突變或遺傳缺陷不斷積累后，最終導(dǎo)致細(xì)胞永生化。通過多種獨(dú)立的系統(tǒng)性基因分析技術(shù)對(duì)腫瘤基因組研究后發(fā)現(xiàn)，一種腫瘤細(xì)胞中的突變或遺傳缺陷往往具有特定的特征[1]，因此通過修復(fù)腫瘤細(xì)胞基因組或者沉默其中特定蛋白的表達(dá)成為研究和治療腫瘤的重要手段[2]。自從CRISPR/Cas9首次被應(yīng)用于基因編輯后，已經(jīng)有很多學(xué)者嘗試將其應(yīng)用于腫瘤病因和治療的研究中。由于CRISPR/Cas9具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、效率高等優(yōu)勢(shì)，可以利用其對(duì)細(xì)胞的基因組進(jìn)行編輯，從而探究腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)理。另外還可以對(duì)引發(fā)腫瘤的基因突變進(jìn)行修復(fù)，或?qū)μ囟ǖ鞍追肿舆M(jìn)行敲除，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的治療。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的進(jìn)步，其在腫瘤研究中的應(yīng)用也越來越廣泛。本文將對(duì)CRISPR/Cas9在腫瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和治療等相關(guān)研究提供參考。

1 CRISPR/Cas9在腫瘤產(chǎn)生機(jī)制研究中的應(yīng)用

作為一種強(qiáng)大的基因編輯工具，CRISPR/Cas9最擅長(zhǎng)的應(yīng)用領(lǐng)域是特定蛋白功能的研究。通過設(shè)計(jì)相應(yīng)sgRNA將目的基因進(jìn)行敲除后研究突變型與野生型的基因差異以及對(duì)細(xì)胞和生物體的影響，從而確認(rèn)其生物學(xué)功能。強(qiáng)大的基因編輯功能可以幫助科學(xué)家更加深入的理解基因與表型之間的因果關(guān)系，為腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究提供更廣闊的前景[3]。

1.1 腫瘤干細(xì)胞中單核苷酸突變形成機(jī)制的研究

腫瘤干細(xì)胞與正常干細(xì)胞具有相似的特征，在腫瘤早期的形成、轉(zhuǎn)移及抗藥性方面具有重要作用[4]。目前關(guān)于腫瘤干細(xì)胞的形成主要有兩個(gè)推測(cè)，即其有可能是從其他正常干細(xì)胞突變而來，或者由細(xì)胞去分化后形成。CD44表面抗原糖蛋白通常作為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物之一，CD44陽性細(xì)胞往往具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移性。利用CRISPR/Cas9將CD44基因敲除后，腫瘤干細(xì)胞在小鼠肝臟中的惡性程度和分化程度大大降低[5]。此外，將干細(xì)胞中的重要錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1敲除后，細(xì)胞極易癌變成為永生細(xì)胞，這也在一定程度上證明了基因突變?cè)谀[瘤干細(xì)胞形成中的作用[6]。Matono等[7]通過CRISPR/Cas9將直腸腫瘤中常見的WNT、MAPK、TGF-β等信號(hào)通路中的突變引入到人體正常腸上皮細(xì)胞中，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件后模擬腸上皮細(xì)胞的生態(tài)環(huán)境，隨后選擇了具有多個(gè)抑癌基因和癌基因突變的細(xì)胞，并將其導(dǎo)入小鼠脾臟，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤可以形成，但是并未發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移所涉及的基因可能并不一致。

1.2 染色體異位對(duì)腫瘤發(fā)生的機(jī)制研究

腫瘤相關(guān)的染色體異位發(fā)生在腫瘤形成過程中的DNA雙鏈斷裂后，由非同源的DNA結(jié)合導(dǎo)致，這也是腫瘤形成的重要機(jī)制之一[8]。因此獲得可以模擬染色體異位的細(xì)胞模型在腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究中至關(guān)重要，而目前對(duì)于相應(yīng)細(xì)胞和動(dòng)物模型的缺乏也限制了對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制和治療手段的研究。

通過在相應(yīng)位點(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA，可以利用CRISPR/Cas9引發(fā)HEK293A細(xì)胞以及間葉細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中產(chǎn)生雙鏈斷裂，從而模擬腫瘤的形成過程，避免了直接培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在傳代過程中產(chǎn)生新的突變從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外，建立的細(xì)胞模型也可用于抗腫瘤藥物的篩選[9]。如果在sgRNA引發(fā)雙鏈斷裂后，引入一個(gè)DNA模板使得DNA通過同源修復(fù)重新連接在一起，則可以提高模型建立的效率[10]，其精確度也大大提高[11]。Spraggon等[12]通過CRISRP/Cas9與DNA雙鏈斷裂的同源性修復(fù)結(jié)合，在人體細(xì)胞系中表達(dá)染色體異位的產(chǎn)物，建立了尤因氏肉瘤和促纖維增生小細(xì)胞葉瘤的細(xì)胞模型，并可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)染色體異位的表達(dá)量控制，為融合基因?qū)е碌哪[瘤研究提供了新的手段。另外，Jiang等[13]利用CRISPR/Cas9構(gòu)建了小鼠胚胎干細(xì)胞染色體異位細(xì)胞系，并且通過將細(xì)胞系注射入宿主胚胎中建立了嵌合體小鼠模型。

1.3 CRISPR/Cas9在腫瘤細(xì)胞缺陷基因篩選中的應(yīng)用

系統(tǒng)性的基因缺陷篩選是腫瘤研究中的重要手段，可以幫助研究者理解腫瘤形成和腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物產(chǎn)生抗性的原因。此前主要的手段是RNA干擾，但是由于其對(duì)基因的抑制效率并不高，并且有脫靶效應(yīng)，因此會(huì)導(dǎo)致假陽性和假陰性結(jié)果[14]。如果設(shè)計(jì)引物獲得sgRNA文庫，并將其導(dǎo)入細(xì)胞中，就可以在sgRNA的引導(dǎo)下對(duì)基因組進(jìn)行大規(guī)模的敲除，從而篩選對(duì)硫鳥嘌呤(抗癌藥)的抗性基因突變，與預(yù)期結(jié)果一致[15]。為了解決PD-1檢查點(diǎn)阻滯免疫療法在一些腫瘤患者中失效的問題，Manguso等[16]通過CRISPR/Cas9編輯在免疫療法處理的小鼠腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)，干擾素-γ信號(hào)通路中的缺陷導(dǎo)致了對(duì)免疫療法的抗性。將CRISPR/Cas9技術(shù)與數(shù)字技術(shù)相結(jié)合，可以用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)數(shù)以千萬計(jì)的sgRNA，采用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒把每個(gè)sgRNA分別導(dǎo)入單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)哺乳動(dòng)物基因功能的高通量掃描。使用CRISPR/Cas9在增強(qiáng)子元件內(nèi)進(jìn)行功能掃描研究，發(fā)現(xiàn)p53效應(yīng)基因CDKN1A的p53結(jié)合增強(qiáng)子是永生化人體細(xì)胞中致癌基因誘導(dǎo)的衰老所必需的元件[17]。

1.4 CRISPR/Cas9在腫瘤動(dòng)物模型構(gòu)建中的應(yīng)用

由于腫瘤細(xì)胞基因組的復(fù)雜性，在每個(gè)腫瘤細(xì)胞中往往含有多達(dá)幾百個(gè)點(diǎn)突變、染色體的異位和缺失等，因此構(gòu)建相應(yīng)的動(dòng)物模型對(duì)于腫瘤產(chǎn)生機(jī)制的研究至關(guān)重要。在小鼠受精卵中同時(shí)注入Cas9蛋白的mRNA及多個(gè)不同的sgRNA后，可以對(duì)Sox2、Oct4和Mecp2等重要的腫瘤干細(xì)胞基因進(jìn)行編輯，構(gòu)建在相應(yīng)基因帶有標(biāo)簽或熒光基團(tuán)的小鼠模型[18]。同時(shí)，CRISPR/Cas9也被應(yīng)用于建立Tet1和Tet2基因同時(shí)產(chǎn)生突變的動(dòng)物模型，采用的方式同樣是在受精卵細(xì)胞中同時(shí)注入Cas9蛋白的mRNA和sgRNA[19]。此外，通過體細(xì)胞構(gòu)建動(dòng)物模型是研究非家族性腫瘤發(fā)生原因的重要手段，但是其面對(duì)的主要難題就是將Cas9基因運(yùn)輸至目的細(xì)胞內(nèi)。利用流體動(dòng)力學(xué)注射法將Cas9和sgRNA導(dǎo)入大鼠肝臟細(xì)胞后，對(duì)兩個(gè)抑癌基因Pten和p53進(jìn)行沉默即可引發(fā)腫瘤形成[20]。以上研究表明CRISPR/Cas9是一種快速、簡(jiǎn)便、可靠的構(gòu)建腫瘤動(dòng)物模型的手段，為學(xué)者研究腫瘤基因型與表現(xiàn)型之間的關(guān)系提供了合適的實(shí)驗(yàn)材料。

2 CRISPR/Cas9在腫瘤治療中的應(yīng)用

將CRISPR/Cas9應(yīng)用于腫瘤治療的理論基礎(chǔ)是腫瘤細(xì)胞的致癌基因依賴性，即腫瘤細(xì)胞中單個(gè)基因的失活即有可能導(dǎo)致其生長(zhǎng)停止[21]。關(guān)于其機(jī)理目前尚無定論，已有的假說包括遺傳優(yōu)化、致癌基因失憶等[22]。盡管如此，這也為腫瘤的治療提供了新的思路。其中，由于病毒引起的腫瘤機(jī)制比較明確，即可將病毒基因作為基因編輯的靶點(diǎn)，因此該類腫瘤也成為CRISPR/Cas9應(yīng)用的主要目標(biāo)。自從第一例利用基因編輯技術(shù)對(duì)腫瘤進(jìn)行體外治療在中國(guó)出現(xiàn)后，關(guān)于其研究的文獻(xiàn)便呈指數(shù)態(tài)勢(shì)發(fā)展[23]。

2.1 EBV誘發(fā)的淋巴癌和鼻咽癌治療

EBV病毒(epstein-barr virus)是一種雙鏈DNA病毒，在淋巴癌和鼻咽癌的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。在復(fù)制的早期，EBV可以感染淋巴癌和鼻咽癌細(xì)胞，隨后EBV會(huì)表達(dá)幾種蛋白導(dǎo)致細(xì)胞的癌變，包括EBV核抗原1(EBV nuclear antigen 1, EBNA-1)、EBNA-2和晚期膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP-1)和LMP-2。將EBNA和LMP蛋白作為靶點(diǎn)，用CRISPR/Cas9敲除后可以顯著降低腫瘤細(xì)胞活性，減少腫瘤細(xì)胞的增殖[24]。

2014年，CRIPSR/Cas9開始應(yīng)用于基因編輯，Yuen等[25]在多個(gè)人體細(xì)胞系中進(jìn)行了EBV病毒的基因編輯。通過以BART(BamHI A rightward transcript)的啟動(dòng)子為靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA，一段558bp的基因片段被敲除，能夠顯著降低EBV對(duì)健康細(xì)胞的感染能力。在最新的研究中，針對(duì)EBV不同靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)的sgRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入C666-1細(xì)胞系后，EBV的含量降低了約50%，并且可以持續(xù)數(shù)周。但是再次轉(zhuǎn)染并不能將病毒載量進(jìn)一步降低。雖然CRISPR/Cas9無法將EBV完全從細(xì)胞中清除，但是可以大大增加EBV感染細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性，也是一種潛在的鼻咽癌治療手段[26]。

2.2 HPV誘發(fā)的宮頸癌治療

在2012年癌癥引發(fā)的女性死亡病例中，宮頸癌排名第四[27]，并且病例的5年生存率已經(jīng)20多年并未發(fā)生變化，其治療手段目前已處于瓶頸期[28]。宮頸癌由人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染引起，其細(xì)胞生長(zhǎng)依賴于HPV E6和E7蛋白的表達(dá)，因此對(duì)這兩個(gè)基因的抑制和敲除是宮頸癌治療中的一個(gè)重要研究方向。E6基因抑制會(huì)激活細(xì)胞的P53途徑，導(dǎo)致癌細(xì)胞的衰老和凋亡。而E7基因與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb)的重建相關(guān)，抑制其活性可以引起癌細(xì)胞衰老。在以往的研究中，通過RNA干擾抑制兩個(gè)基因的表達(dá)，可使得腫瘤生長(zhǎng)停止[29]。

隨著CIRSPR/Cas9技術(shù)的迅速發(fā)展，其也被應(yīng)用于宮頸癌的治療。在HPV-16和HPV-18細(xì)胞系中，通過敲除E6和E7兩個(gè)基因，細(xì)胞的p53和pRb基因水平恢復(fù)正常，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的程序性死亡[30]。在裸鼠實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)兩個(gè)基因敲除后，其腫瘤生長(zhǎng)也完全停止[31]。除此之外，通過敲除E6基因的上游早期啟動(dòng)子區(qū)域p97，也可以將兩個(gè)基因的表達(dá)抑制，因此針對(duì)兩個(gè)基因的調(diào)控序列進(jìn)行敲除也是治療手段之一。例如可以通過敲除位于E4基因上游的啟動(dòng)子或者E5的一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)節(jié)L1衣殼蛋白的表達(dá)，從而使得細(xì)胞程序性死亡。

2.3 CRISPR/Cas9在其他腫瘤治療中的應(yīng)用

由于腫瘤發(fā)生的原因和腫瘤微環(huán)境在不斷發(fā)生變化，因此在腫瘤治療中設(shè)計(jì)一個(gè)有效的治療手段需要面對(duì)諸多困難。而在發(fā)病原因相對(duì)確定的病毒誘發(fā)腫瘤中，如果需要編輯病毒基因組以減少病毒載量，則CRIPSR/Cas9就是一個(gè)理想的技術(shù)手段。

在非小細(xì)胞肺癌中，程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)會(huì)抑制免疫反應(yīng)，因此可以將病人的T細(xì)胞PD-1蛋白提取后進(jìn)行基因編輯，隨后篩選敲除成功的細(xì)胞，重新注射回機(jī)體，觸發(fā)人體免疫反應(yīng)以清除腫瘤細(xì)胞[32]。目前首例將CRISPR/Cas9應(yīng)用于人體實(shí)驗(yàn)以敲除PD-1基因的研究仍在進(jìn)行。

嵌合抗原受體T細(xì)胞和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)抑制劑是腫瘤治療研究中的新興手段，如果將二者結(jié)合，可能會(huì)具有更大的臨床應(yīng)用價(jià)值。Levi等[33]發(fā)現(xiàn)程序性死亡配體1(PD-L1)的表達(dá)會(huì)抑制嵌合抗原受體T細(xì)胞的腫瘤清除效應(yīng)，因此將sgRNA通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)融合進(jìn)入細(xì)胞基因組，從而獲得PD-L1缺陷細(xì)胞，其對(duì)胰腺癌細(xì)胞的清除能力獲得提高。

2.4 CRISPR/Cas9在腫瘤治療靶點(diǎn)篩選中的應(yīng)用

在CRISPR/Cas9之前已經(jīng)有學(xué)者用RNA干擾或第二代基因編輯技術(shù)進(jìn)行新的腫瘤基因篩選[34]。而CRISPR/Cas9的出現(xiàn)則提供了新的快速篩選未知腫瘤治療靶點(diǎn)的手段。在肝癌研究中，向人工誘發(fā)的腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)入sgRNA文庫，隨后將該細(xì)胞注射入裸鼠，將單克隆細(xì)胞形成的腫瘤進(jìn)行基因序列分析，鑒定出NF1、TSC2、NF2、BIM和Plnb1 5個(gè)與腫瘤生長(zhǎng)密切相關(guān)的基因[35]。Manguso等[36]通過sgRNA文庫篩選了黑色素瘤細(xì)胞中的2 400個(gè)基因，證明Ptpn2的缺失可以引發(fā)細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而使其作為治療時(shí)的靶基因[16]。CRISPR/Cas9將有助于腫瘤細(xì)胞中新致癌基因的發(fā)現(xiàn)及驗(yàn)證其在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，從而為腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。

3 CRISPR/Cas9應(yīng)用于腫瘤研究的難點(diǎn)和挑戰(zhàn)

盡管CRISPR/Cas9在腫瘤研究中已經(jīng)有多方面應(yīng)用，但是目前仍面臨多個(gè)挑戰(zhàn)需要解決，包括Cas9基因運(yùn)輸、脫靶效應(yīng)及安全性問題等。

3.1 Cas9基因的運(yùn)輸

將CRISPR/Cas9應(yīng)用于腫瘤動(dòng)物模型構(gòu)建和腫瘤治療時(shí)，最大的挑戰(zhàn)就是如何提高將CRISPR/Cas9復(fù)合體輸送至目的基因的效率。在動(dòng)物模型的構(gòu)建中，選用合適的輸送方式將Cas9基因運(yùn)送至目的基因，提高其輸送效率，對(duì)于成功建立動(dòng)物模型十分關(guān)鍵。另外，通過尋找Cas9蛋白的同源蛋白，也可以提高其包裝和輸送的成功率[37]。在腫瘤的治療中，目前主要有腺病毒、慢病毒和非病毒的物理方式。由于腺病毒的免疫原性導(dǎo)致其在臨床應(yīng)用中受到限制[38]。慢病毒由于其可以將自身基因組整合至宿主基因組的特性，可以實(shí)現(xiàn)相應(yīng)致癌基因的永久敲除。但是若sgRNA與宿主細(xì)胞基因組完全整合，sgRNA也無法發(fā)揮其引導(dǎo)作用，因此某些整合酶缺陷的慢病毒突變體更加適合腫瘤治療應(yīng)用[39]。另外一種方式則是將Cas9分為兩部分后，分別導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，隨后sgRNA可以與二者重組成為復(fù)合體，發(fā)揮其剪切作用[40]。

3.2 脫靶效應(yīng)

潛在的脫靶效應(yīng)也是CRISPR/Cas9在腫瘤研究應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，如果Cas9蛋白無法定位至目的基因，極易造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性或假陰性。而在構(gòu)建動(dòng)物模型時(shí)需要極低的脫靶效應(yīng)才能提高成功率，例如使用Cas9D10A內(nèi)切酶和補(bǔ)償sgRNA[41]，或者縮短的sgRNA等手段[42]，可以明顯降低其脫靶效應(yīng)。在腫瘤的臨床治療中，即使是極低的脫靶效應(yīng)也是非常危險(xiǎn)的，其會(huì)導(dǎo)致小片段的插入/缺失突變或者大規(guī)模的基因組改變[43]。目前也有多種手段降低其脫靶效應(yīng)，例如設(shè)計(jì)的sgRNA與基因組中目的基因序列高度同源，從而避免其錯(cuò)配效應(yīng)[44]，或者通過應(yīng)用Cas9蛋白的突變體，提高其與靶標(biāo)結(jié)合的效率等[45]。

3.3 CRISPR/Cas9的安全性和成本等問題

盡管CRISPR/Cas9是一種簡(jiǎn)便高效的基因編輯工具，但是其安全性在科學(xué)界并未達(dá)成共識(shí)[46]。其安全性應(yīng)當(dāng)通過在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的大規(guī)模統(tǒng)計(jì)來進(jìn)行驗(yàn)證[47]。此外，CRISPR/Cas9的實(shí)際應(yīng)用還需要解決成本問題。例如，由于每個(gè)病人體內(nèi)發(fā)生突變的堿基可能具有特異性，尤其是特別稀有的突變，需要給每個(gè)病人設(shè)計(jì)獨(dú)特的sgRNA，導(dǎo)致其成本會(huì)特別昂貴[48]。其次就是針對(duì)每一種腫瘤需要建立其相應(yīng)的治療閾值，即需要多少基因組的編輯才可能實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的治療，而這又取決于設(shè)計(jì)sgRNA的結(jié)合效率、在體內(nèi)的運(yùn)輸效率和靶細(xì)胞的適應(yīng)程度等多種因素[49]。

4 展望

在過去的幾年內(nèi)， CRISPR/Cas9作為一種穩(wěn)定、高效且廣泛應(yīng)用的基因編輯技術(shù)出現(xiàn)，發(fā)展非常迅速。通過將目的基因精確的沉默或激活，可以研究相應(yīng)基因在生物體內(nèi)的功能[50]。在腫瘤產(chǎn)生機(jī)制的研究中，通過CRISPR/Cas9將相應(yīng)預(yù)期基因敲除后，即可研究相應(yīng)基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用。在腫瘤的缺陷基因篩選和治療中，CRISPR/Cas9也有相應(yīng)研究。目前針對(duì)病毒引發(fā)的腫瘤已經(jīng)有研究將其基因組編輯后抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。盡管面臨Cas9蛋白運(yùn)輸效率低、一定的脫靶效應(yīng)以及成本高等缺陷，CRISPR/Cas9在腫瘤研究和治療中仍然具有巨大的應(yīng)用潛力。

參 考 文 獻(xiàn)

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