CRISPR/Cas基因編輯技術及其在作物育種中的應用

鄭紅艷, 王 磊

中國農業(yè)科學院生物技術研究所, 北京 100081

培育高產優(yōu)質且抗逆性強的農作物品種一直是育種家追求的育種目標，而傳統(tǒng)育種方法具有育種周期長、選育針對性差等缺點，難以實現(xiàn)快速育種的目標。CRISPR/Cas核酸酶技術是近年來發(fā)展起來的對基因組進行精準定點編輯的技術，具有操作簡單、周期短、效率高等優(yōu)點，利用該技術可以對基因組中的目的基因進行定向敲除、插入或定點突變，從而精確引入目標性狀，為作物育種工作提供新的途徑。

1 CRISPR/Cas基因編輯技術簡介及發(fā)展

CRISPR/Cas基因編輯技術(genome editing)是植物基因功能研究和育種改良的熱點技術，其由小分子RNA介導，且主要依賴于核酸內切酶在目標位置產生雙鏈斷裂(double strand breaks, DSBs)，DSBs可以通過非同源末端連接(NHEJ)和同源重組(HDR)兩種方式進行修復，通過NHEJ的修復容易發(fā)生錯誤，使斷裂位置產生小片段的缺失或插入，從而導致基因突變；在有供體DNA存在的情況下，有可能通過HDR進行斷裂位置的修復，產生精準的基因插入或替換。

CRISPR-Cas系統(tǒng)包括Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三種類型，其中Ⅰ型和Ⅲ型需要多種蛋白參與才能形成具有功能的Cas蛋白復合體[1]，而來自于化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的Ⅱ型系統(tǒng)僅需要一種Cas蛋白就能夠發(fā)揮作用[2]。在Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)中，入侵的外源核酸序列整合到前導序列與第一段重復序列之間，并轉錄成長鏈的CRISPR RNAs(crRNA)前體物，與反式激活tracrRNA(trans-activating crRNA)互補結合，然后在Cas9/RNAseⅢ加工下形成成熟的tracrRNA: crRNA復合物，通過crRNA與入侵DNA上原間隔序列互補配對，從而激活并誘導Cas9蛋白到原間隔序列的區(qū)域進行剪切，該過程需要在靶標DNA上有一段保守的PAM(protospacer adjacent motif)序列。Cas9蛋白包括兩個區(qū)域，其中HNH結構域切割與crRNA互補的DNA鏈，RuvC-like域則剪切非互補的DNA鏈，從而形成DSBs，降解入侵片段[1]?？茖W家利用上述原理，通過將crRNA和tracrRNA序列相連構成一個嵌合的sgRNA(small guide RNA)分子，實現(xiàn)對靶標的識別，并利用Cas蛋白進行定點剪切形成DSBs，隨后通過體內NHEJ或HDR方式進行修復[3]。近來，新一代CRISPR基因編輯工具CRISPR/Cpf1、單堿基突變及無外源DNA污染編輯的出現(xiàn)，標志著CRISPR基因編輯技術又取得了突破性進展。

1.1 新一代CRISPR基因編輯工具CRISPR/Cpf1

2015年，張鋒團隊首先發(fā)現(xiàn)了Ⅱ類CRISPR系統(tǒng)第5亞家族的成員Cpf1核酸內切酶，并證實了來自氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、弗朗西斯氏菌屬(Franisellanovicida)和毛螺科菌屬(Lachnospiraceae)的AsCpf1、LbCpf1和FnCpf1都具有RNA引導的DNA內切酶活性，且AsCpf1和LbCpf1用于動物的基因組編輯效率與CRISPR/Cas9系統(tǒng)相似，但其與Cas9相比卻具有更多優(yōu)勢：①Cpf1蛋白因更小而更容易進入組織和細胞；②Cpf1同時具有DNA和RNA內切酶活性；③Cpf1的初級轉錄產物pre-crRNA由Cpf1自身加工，不需要tracrRNA的參與；④Cpf1識別位于靶序列5′端富含胸腺嘧啶(T)的PAM序列，擴大了基因組編輯的靶點范圍；⑤Cpf1的切割位點離PAM序列較遠，便于對同一位點進行多輪基因編輯；⑥Cpf1剪切后形成黏性末端，讓DNA插入更可控。目前CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)已被用于水稻、擬南芥等物種的基因組編輯，朱健康團隊[4]利用該技術對水稻中RLK和CYP81A家族的4個基因進行同時編輯，各位點的敲除效率達到40%～75%。近期，中國農業(yè)科學院作物科學研究所夏蘭琴團隊與華中農業(yè)大學趙云德團隊合作，利用能夠識別“TYCV”序列的LbCpf1(RR)和LbCpf1(RVR)變體，以水稻OsPDS和OsSBEIIb基因為靶標基因，LbCpf1(RR)編輯效率達51%左右，該研究擴展了CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在植物基因組中的編輯范圍[5]。

1.2 單堿基突變編輯

在農作物遺傳改良方面，少部分可以通過完全破壞基因功能來獲得育種材料，但更多的是需要置換單個或數(shù)個堿基來改變基因的功能，從而實現(xiàn)定向改良作物農藝性狀的目的，而利用CRISPR/Cas9定點修飾主要是依賴于效率低下的同源重組機制。2016年，哈佛大學David Liu團隊[6]發(fā)現(xiàn)了一種新的基因編輯工具——單堿基編輯系統(tǒng)。單堿基編輯技術通過將Cas9切口酶(Cas9 nikase, Cas9n)或無核酸酶活性的Cas9(nuclease dead Cas9, dCas9)與胞嘧啶脫氨酶(APOBEC1)形成融合蛋白，并通過sgRNA(單鏈向導RNA)將融合蛋白引導至靶位點，在不引起DNA雙鏈斷裂的情況下對靶位點附近的單個堿基進行由C/G到T/A的精確置換，目前該技術已在植物、動物以及人細胞中實現(xiàn)了高效的定點突變。朱健康團隊[7]利用單堿基編輯系統(tǒng)APOBEC1-XTEN-Cas9(D10A)，率先實現(xiàn)了對水稻氮轉運蛋白家族NRT1.1B和DELLA家族SLR1的堿基替換，隨后高彩霞團隊[8]通過改進，成功地將此系統(tǒng)運用到三大重要農作物小麥、水稻和玉米的性狀改良上，為作物品種改良帶來了新的途徑。

1.3 無外源DNA污染編輯

目前常用的CRISPR/Cas9基因編輯技術主要是通過基因槍或農桿菌侵染的方法將DNA表達框整合到植物基因組中，此種方法一般需通過后代分離才能獲得無CRISPR/Cas9 DNA的突變體材料。DNA-free基因組編輯技術的建立，大大降低了外源DNA的整合率，為CRISPR/Cas9技術用于農作物品種改良提供了新思路。DNA-free基因組編輯是通過將CRISPR/Cas9蛋白與gRNA在體外組裝成核糖蛋白體(RNP)，實現(xiàn)無外源DNA的基因編輯體系，避免外源DNA整合到基因組中產生潛在風險，從而推動作物基因編輯育種的發(fā)展。此技術已經(jīng)在擬南芥、煙草、生菜等模式植物[9]和水稻、玉米、小麥等主要糧食作物[10,11]中得到了成功應用。高彩霞團隊[12]以小麥為研究對象，對此方法步驟做了詳細總結，為其廣泛應用提供了有力的技術支持。最近，瑞典科學家利用RNP方法成功實現(xiàn)了馬鈴薯的DNA-free基因組編輯，編輯效率達9%～25%[13]。

2 CRISPR-Cas技術在作物育種中的應用

自CRISPR/Cas9技術被用于進行基因定點編輯以來，被廣泛應用于酵母、果蠅、斑馬魚、小鼠、人類等多個物種中。2013年8月，《Nature Biotechnology》期刊上同時刊登了3篇關于CRSPR-Cas9技術介導植物基因組定點編輯的文章，預示著該技術在植物中的廣泛應用和迅速發(fā)展。其中Nekrasov等[14]利用CRISPR-Cas技術在本生煙(Nicotianabenthamiana)中實現(xiàn)了基因組的定點突變，突變效率約為2%；Li等[15]利用CRSPR-Cas9分別對擬南芥和本生煙中的PDS基因進行定點編輯，在原生質體系統(tǒng)中，擬南芥AtPDS和本生煙NbPDS突變效率分別為5.6%和38%，而通過農桿菌浸染發(fā)現(xiàn)，在植物中AtPDS和NbPDS的突變效率相差不大(擬南芥為2.7%，本生煙為4.8%)，表明突變效率與植物基因型、生理狀態(tài)和轉化方式密切相關。該研究還在原生質體中成功實現(xiàn)了對AtPDS3的兩個不同位點和同時對兩個基因(AtRACK1b和AtRACK1c)的編輯，為植物基因編輯打開了新的思路；高彩霞團隊[16]利用基因槍技術首次在水稻中對OsPDS和OsBADH2基因進行敲除，突變效率分別為9.4%和7.1%，并獲得了T0代PDS基因敲除的水稻純合突變植株。同時，朱健康團隊[17]也利用CRISPR-Cas9技術分別在擬南芥和水稻中進行基因定點突變，突變效率分別為26%和84%；瞿禮嘉團隊[18]通過對Cas9蛋白進行優(yōu)化，使該系統(tǒng)在水稻中對OsCAO1和OsLAZY1基因的編輯效率分別高達83%和92%。CRISPR/Cas9技術在植物中，尤其是作物中的成功應用，為該技術在作物品種改良中的應用提供了有力的技術支持，隨后大量相關研究相繼開展。

2.1 在糧食作物育種中的應用

水稻是世界上最為重要的糧食作物之一，并且水稻遺傳轉化更易操作，因此近年來利用CRISPR/Cas9技術開展與水稻產量、品質及抗性相關的研究被大量報道。產量方面，王加峰等[19]利用CRISPR/Cas9技術對調控水稻產量千粒重的基因TGW6定點編輯，T0代材料中該基因突變頻率約為90%，其中純合缺失突變率高達51%，T1代純合缺失突變體千粒重顯著增加。Li等[20]利用CRISPR/Cas9技術以中花11作為轉化材料對Gn1a、DEP1、GS3及IPA1基因進行定點敲除，結果表明T0代材料中突變效率分別為42.5%、67.5%、57.5%、27.5%，T2代純合缺失突變體中植株籽粒數(shù)目及長度增加，達到增產的效果；品質方面，中國水稻研究所[21]和東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所[22]同時采用CRISPR/Cas9技術對控制水稻香味的BADH2基因進行敲除，結果表明突變體材料中香味物質顯著增加，為香稻育種提供了豐富的理論指導，加快了香稻的育種進程?？剐苑矫?，李家洋與高彩霞團隊[23]利用CRISPR/Cas9技術以NHEJ修復方式對水稻5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)進行編輯，實現(xiàn)了水稻內源EPSPS基因保守區(qū)域兩個重要氨基酸的定點置換，在T0代獲得具有草甘膦抗性的突變體材料。Wang等[24]利用CRISPR/Cas9技術修飾稻瘟病侵染效應因子基因OSERF922，以提高水稻對稻瘟病的抗性。近期，Tang等與袁隆平團隊[25]利用CRISPR/Cas9技術敲除水稻中與鎘離子吸收和積累相關的基因，獲得了抗鎘毒害的水稻品種。此外，朱健康研究組[21]利用新型腺嘌呤堿基編輯器ABE7-10對調節(jié)水稻株型的OsSPL14和SLR1進行單堿基編輯，A/T到G/C的替換效率分別為26%和12.5%，該研究推動了作物精準分子育種的發(fā)展。

玉米不僅是世界第一大糧食作物之一，也是飼料、化工和醫(yī)用等的原料。朱金潔等[26]經(jīng)過摸索，搭建了玉米基因組高效定點突變的技術平臺，并在玉米全基因組范圍內篩選高度特異的sgRNA靶標序列，為玉米品種改良提供了強有力的技術支持。杜邦先鋒公司利用CRISPR-Cas9技術，將自然存在的糯玉米性狀直接引入具有優(yōu)良性狀的雜交種中，解決了糯玉米產量低的問題，同時避免了繁雜的回交育種工作，同年，該公司利用CRISPR-Cas9技術將一個玉米內源啟動子GOS2精確插入到玉米中乙烯應答調控因子ARGOS8的5′端，獲得耐旱材料[27]。

小麥屬于異源多倍體，基因組龐大，因此通過傳統(tǒng)方法育種難度很大。Zhang等[11]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對小麥粒長和粒重調控基因TaGASR7和穗密度調控基因TaDEP1進行定點編輯，獲得的TaGASR7純合突變材料粒重顯著增加，TaDEP1純合突變材料明顯變矮。高彩霞和唐定中團隊利用CRISPR/Cas9技術，獲得了同時敲除3個同源基因的突變體，該突變體對白粉病表現(xiàn)出有較強抗性[28]。

2.2 在經(jīng)濟作物育種中的應用

Cai等[29]利用CRISPR/Cas9技術對大豆光周期開花途徑關鍵基因GmFT2a進行了定向編輯，靶向大豆內源GmFT2a上的3個位點，T1代純合突變體植株花期延遲。Wang等[30]建立了適用于棉花遺傳轉化體系的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，以棉花葉綠素合成相關基因GhCLA1為靶標設計3對sgRNA，各靶標位點的編輯效率高達到66.7%～100%，為推動棉花基因組編輯工作打下了堅實基礎。Xu等[31]利用CRISPR-Cas9技術對CLV3進行了基因編輯，使得番茄果實的心室數(shù)顯著增加；Soyk等[32]采用CRISPR/Cas9技術對番茄抗成花基因SP5G進行定向編輯，突變體材料番茄開花及成熟時間提前約2周，且產量顯著增加。以上研究結果表明該技術在番茄重要農藝性狀改良方面具有巨大的應用潛力。雙孢菇(Agaricusbisporus)非常容易褐變，從而影響其品質。Waltz[33]利用CRISPR/Cas9技術對雙孢菇的1個多酚氧化酶基因PPO進行定向編輯，獲得的突變體材料中多酚氧化酶的活性降低了30%，抗褐變能力大幅提高。

3 展望

傳統(tǒng)育種需要投入大量的時間和精力，才能將相關基因的有益變異累積為最佳的品種，而通過CRISPR/Cas9技術能夠直接且有目的進行優(yōu)良性狀選擇。但CRISPR/Cas9系統(tǒng)目前還存在一些技術方面的問題，有待進一步改進和探討：①以往報道的CRISPR/Cas9技術在應用過程中會出現(xiàn)一定程度的脫靶現(xiàn)象，引起基因組非靶向位點的突變，這樣會造成研究結果的不確定性，嚴重限制了該技術的應用。提高sgRNA序列特異性和使用合適的Cas蛋白等都能夠有效降低甚至消除脫靶現(xiàn)象[34,35]。此外，2017年Rauch等[36]在細菌中發(fā)現(xiàn)了能夠阻斷CRISPR-Cas9活性的AcrllA4蛋白，該蛋白讓CRISPR-Cas9在基因編輯一段時間后“關閉其活性”，防止在不必要的位點隨意剪切造成的脫靶效應。在此基礎上，Yang和Patel[37]采用冷凍電子顯微鏡和人體細胞培養(yǎng)等方法進一步揭示了AcrIIA4主要是通過競爭Cas9蛋白上的DNA結合域發(fā)揮作用，這一發(fā)現(xiàn)為CRISPR/Cas9技術在育種中的廣泛應用提供了強有力的支持和保障。②基因編輯范圍有限。CRISPR系統(tǒng)中，DNA的精確剪切依賴于gRNA及PAM序列。目前的研究中，CRISPR/Cas9所識別的PAM位點包括經(jīng)典的“NGG”和Cas9改變后的“NGA”和“NGCG”等。CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)進一步拓寬了基因組編輯的范圍，與CRISPR/Cas9不同，CRISPR/Cpf1的PAM序列主要位于“T/A”富集區(qū)，包括LbCpf1識別的“TTTV”及LbCpf1(RR)變體識別的“TYCV”。如何有效拓展CRISPR系統(tǒng)PAM位點范圍，是該技術在育種中廣泛應用的關鍵所在。③提高同源重組(HDR)效率。目前CRISPR技術在作物育種中的應用，主要集中于依賴HNEJ途徑的基因敲除，如何通過HDR實現(xiàn)高效率的大片段插入或堿基替換仍是一個挑戰(zhàn)。Charpentier等[38]最近的研究中，通過將同源重組過程早期關鍵蛋白CtIP與Cas9蛋白融合，從而激活HDR途徑，在人類細胞、鼠受精卵細胞中將編輯效率提高2倍以上。Aird等[39]將供體DNA通過PCV共價鍵連接到Cas9/gRNA核糖核蛋白復合體上，增加DSB處供體DNA的濃度，從而提高Cas9介導的同源重組修復效率。利用HDR在靶位點插入目的基因，將是基因編輯育種的重要攻關內容之一。

總之，雖然目前基因編輯技術還存在很多不足，但其相對傳統(tǒng)育種的優(yōu)勢顯而易見，因此其具有廣闊的發(fā)展和應用前景，相信在不久的將來，經(jīng)過優(yōu)化和改良的基因編輯技術將成為培育作物新品種的主要手段之一。

參 考 文 獻

[1] Liu L, Fan X D. CRISPR-Cas system: A powerful tool for genome engineering[J]. Plant Mol. Biol., 2014, 85(3): 209-218.

[2] Zhang F, Wen Y, Guo X. CRISPR/Cas9 for genome editing: Progress, implications and challenges[J]. Human Mol. Genet., 2014, 23(R1): 40-46.

[3] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I,etal.. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science, 2012, 337(6096): 816-821.

[4] Wang M, Mao Y, Lu Y,etal.. Multiplex gene editing in rice using the CRISPR-Cpf1 system[J]. Mol. Plant, 2017, 10(7): 1011-1013.

[5] Zhong Z Y, You Q, Tang X,etal.. Plant genome editing using FnCpf1 and LbCpf1 nucleases at redefined and altered PAM sites[J]. Mol. Plant, 2018, doi: 10.1016/j.molp.2018.03.008.

[6] Komor A C, Badran A H, Liu D R. CRISPR-based technologies for the manipulation of eukaryotic genomes[J]. Cell, 2017, 168(1-2): 20-36.

[7] Lu Y, Zhu J K. Precise editing of a target base in the rice genome using a modified CRISPR/Cas9 system[J]. Mol. Plant, 2017, 10(3): 523-525.

[8] Zong Y, Wang Y, Li C,etal.. Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion[J]. Nat. Biotechnol., 2017, 35(5): 438.

[9] Woo J W, Kim J, Il Kwon S,etal.. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins[J]. Nat. Biotechnol., 2015, 33(11): 1162-1156.

[10] Svitashev S, Schwartz C, Lenderts B,etal.. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes[J]. Nat. Commun., 2016, 7: 13274.

[11] Zhang Y, Liang Z, Zong Y,etal.. Efficient and transgene-free genome editing in wheat through transient expression of CRISPR/Cas9 DNA or RNA[J]. Nat. Commun., 2016, 7: 12617.

[12] Liang Z, Chen K, Zhang Y,etal.. Genome editing of bread wheat using biolistic delivery of CRISPR/Cas9 & ITin vitro & IT transcripts or ribonucleoproteins[J]. Nat. Protocols, 2018, 13(3): 413-430.

[13] Andersson M, Turesson H, Arrivault S,etal.. Inhibition of plastid PPase and NTT leads to major changes in starch and tuber formation in potato[J]. J. Exp. Bot., 2018, 69(8): 1913-1924.

[14] Nekrasov V, Staskawicz B, Weigel D,etal.. Targeted mutagenesis in the model plantNicotianabenthamianausing Cas9 RNA-guided endonuclease[J]. Nat. Biotechnol., 2013, 31(8): 691-693.

[15] Li J F, Norville J E, Aach J,etal.. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing inArabidopsisandNicotianabenthamianausing guide RNA and Cas9[J]. Nat. Biotechnol., 2013, 31(8): 688-691.

[16] Shao G, Xie L, Jiao G,etal.. CRISPR/CAS9-mediated editing of the fragrant gene Badh2 in rice[J]. Chin. J. Rice Sci., 2017, 31(2): 216-222.

[17] Feng Z, Zhang B, Ding W,etal.. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system[J]. Cell Res., 2013, 23(10): 1229-1232.

[18] Miao J, Guo D, Zhang J,etal.. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system[J]. Cell Res., 2013, 23(10): 1233-1236.

[19] 王加峰, 鄭才敏, 劉 維,等. 基于 CRISPR/Cas9 技術的水稻千粒重基因tgw6突變體的創(chuàng)建[J]. 作物學報, 2016, 8: 1160-1167.

[20] Li M, Li X, Zhou Z,etal.. Reassessment of the four yield-related genes Gn1a, DEP1, GS3, and IPA1 in rice using a CRISPR/Cas9 system[J]. Front. Plant Sci., 2016, 7: 377.

[21] Hua K, Tao X P, Yuan F T,etal.. Precise A.T to G.C base editing in the rice genome[J]. Mol. Plant, 2018, 11(4): 627-630.

[22] 周文甲, 田曉杰, 任月坤, 等. 利用 CRISPR/Cas9 創(chuàng)造早熟香味水稻[J]. 土壤與作物, 2017, 6(2): 146-152.

[23] Li J, Meng X, Zong Y,etal.. Gene replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR-Cas9[J]. Nat. Plants, 2016, 2(10): 16139.

[24] Wang F, Wang C, Liu P,etal.. Enhanced rice blast resistance by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the ERF transcription factor gene OsERF922[J]. PLoS ONE, 2016, 11(4): e0154027.

[25] Tang L, Mao B, Li Y,etal.. Knockout of OsNramp5 using the CRISPR/Cas9 system produces low Cd-accumulating indica rice without compromising yield[J]. Sci. Rep., 2017, 7(1): 14438.

[26] Zhu J, Song N, Sun S,etal.. Efficiency and inheritance of targeted mutagenesis in maize using CRISPR-Cas9[J]. J. Genet. Genom., 2016, 43(1): 25-36.

[27] Shi J, Gao H, Wang H,etal.. ARGOS8 variants generated by CRISPR-Cas9 improve maize grain yield under field drought stress conditions[J]. Plant Biotechnol. J., 2017, 15(2): 207-216.

[28] Zhang Y, Bai Y, Wu G,etal.. Simultaneous modification of three homoeologs of TaEDR1 by genome editing enhances powdery mildew resistance in wheat[J]. Plant J., 2017, 91(4): 714-724.

[29] Cai Y, Chen L, Liu X,etal.. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis of GmFT2a delays flowering time in soya bean[J]. Plant Biotechnol. J., 2018, 16(1): 176-185.

[30] Wang P, Zhang J, Sun L,etal.. High efficient multisites genome editing in allotetraploid cotton (Gossypiumhirsutum) using CRISPR/Cas9 system[J]. Plant Biotechnol. J., 2018, 16(1): 137-150.

[31] Xu C, Liberatore K L, MacAlister C A,etal.. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato[J]. Nat. Genet., 2015, 47(7): 784.

[32] Soyk S, Mueller N A, Park S J,etal.. Variation in the flowering gene SELF PRUNING 5G promotes day-neutrality and early yield in tomato[J]. Nat. Genet., 2017, 49(1): 162-168.

[33] Waltz E. Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation[J]. Nature, 2016, 532(7599): 293-293.

[34] Cho S W, Kim S, Kim Y,etal.. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases[J]. Genome Res., 2014, 24(1): 132-141.

[35] Fu Y, Sander J D, Reyon D,etal.. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs[J]. Nat. Biotechnol., 2014, 32(3): 279-284.

[36] Rauch B J, Silvis M R, Hultquist J F,etal.. Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins[J]. Cell, 2017, 168(1-2): 150.

[37] Yang H, Patel D J. Inhibition mechanism of an anti-CRISPR suppressor AcrIIA4 targeting SpyCas9[J]. Mol. Cell, 2017, 67(1): 117.

[38] Charpentier M, Khedher A H Y, Menoret S,etal.. CtIP fusion to Cas9 enhances transgene integration by homology-dependent repair[J]. Nat. Commun., 2018, 9(1): 1133.

[39] Aird E J, Lovendahl K N, Martin A S,etal.. Increasing Cas9-mediated homology-directed repair efficiency through covalent tethering of DNA repair template[J]. BioRxiv, 2017, doi: org/10.1101/231035.