二氫乳清酸脫氫酶突變對米勒綜合征患者體內(nèi)蛋白及功能的研究*

方靜嫻，陳 蕾，梁建英，錢 虹，唐 翔

(1.南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)院/廣東省口腔醫(yī)院兒童口腔科，廣州 510280；2.南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)院/廣東省口腔醫(yī)院口腔綜合科，廣州 510280；3.廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心婦科，廣州 510260)

線粒體是雙膜封閉器官，因其能量轉(zhuǎn)化功能被認為是真核細胞的能量加工廠。此外，線粒體也參與到鈣和離子儲存以及信號傳導、細胞分化、細胞凋亡、細胞周期調(diào)控和細胞生長等重要功能之中[1]。近來有研究表明，線粒體功能異常可引起一系列疾病，而線粒體功能狀態(tài)也與老齡化等問題可能存在關(guān)聯(lián)[2-3]。考慮到腺苷三磷酸(ATP)的產(chǎn)生主要依賴于氧化呼吸鏈的作用，線粒體遺傳物質(zhì)的維護對于個體維持健康狀態(tài)是相當重要的[4-5]。

核酸嘧啶的合成通過兩條途徑：從頭嘧啶合成途徑和補救途徑。二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)催化從頭嘧啶合成途徑第四步反應(yīng)，將二氫乳清酸(DHO)轉(zhuǎn)化成為乳清酸鹽[6-7]。DHODH是整個核酸嘧啶合成中惟一存在于線粒體內(nèi)膜的限速酶，而其他的限速酶均存在于細胞質(zhì)中。DHODH催化DHO氧化為乳清酸鹽，將電子傳遞給鋁氧化呼吸分子輔酶Q，通過結(jié)合酶還原共同體黃素單核苷酸[8]。因此，DHODH依賴于輔酶Q，進而將線粒體氧化呼吸鏈和核酸嘧啶生物合成從功能上聯(lián)系起來。

DHODH有兩個結(jié)合位點。其底物DHO結(jié)合于第一位點，并通過共同底物電子受體而被氧化。形成乳清酸鹽后，輔酶結(jié)合于其第二位點，并從共同底物處接收一個電子。經(jīng)DHODH合成的乳清酸鹽在尿苷-磷酸合酶(UMPS)復(fù)合體的作用下接著轉(zhuǎn)化為尿苷酸(UMP)，此即UMP合成[9-10]。

米勒綜合征是軸后面骨發(fā)育不全，通常也以Wildervanck-Smith綜合征為人所知。其臨床癥狀包括嚴重小下頜、唇裂和(或)腭裂，軸背部位如四肢發(fā)育不全或發(fā)育缺陷，眼瞼缺損以及多生乳頭[11-12]。近來發(fā)現(xiàn)米勒綜合征的致病基因是DHODH，其定位于染色體16q22[13]。從外顯子2到外顯子9，共發(fā)現(xiàn)13個突變體[13-14]。然而這些突變體是如何導致米勒綜合征的發(fā)生卻尚待研究。

小鼠體內(nèi)，通過運用DHODH抑制劑來氟米特(Leflunomide/LFN)作用于懷孕小鼠，可引起一系列四肢及頜面發(fā)育缺陷，最主要的共同表現(xiàn)包括露腦畸形、腭裂和眼瞼無法閉合[15]。因此，DHODH突變引起米勒綜合征的發(fā)現(xiàn)揭示了DHODH在頜面和四肢發(fā)育過程中尚待發(fā)現(xiàn)的新作用。本研究中，觀察3種與米勒綜合征相關(guān)DHODH突變體在線粒體中的蛋白穩(wěn)定性、定位和DHO-依賴酶活性，以期了解DHODH在米勒綜合征中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1抗體和試劑 抗-DHODH、抗HA和抗TFAM(線粒體轉(zhuǎn)錄因子A)抗體由九州大學臨床檢查部分子檢查室提供?？笲AP37購于美國SantaCruz生物科技公司?？?β-actin抗體購于美國Sigma公司。MitoTrackerRed購于美國Invitrogen公司。L-DHO購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液(美國Sigma-Aldrich)以及10%牛胚胎失活血清(FBS)。細胞系維持培養(yǎng)于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.2表達載體 DHODH cDNA表達構(gòu)建采用標準方法。野生和突變型DHODH cDNA通過BamHⅠ/XhoⅠ酶切位點加入載體pcDNA(Invitrogen)。DHODH cDNA包括推測的第一個甲硫氨酸位點通過人宮頸癌HeLa細胞的cDNA文庫得以擴增，通過配對引物，即：5′-CAG AGT CTT CTG CCT CCC TG-3′和5′-AGG CAG AAG ACT CTG-3′。然后BamHⅠ和XhoⅠ位點分別通過二次PCR加入到5′和3′端，通過引物5′-GCG TGG AGA CAC CTG AAA AAG C-3′和5-CGA GTC ACC TCC GAT GAT CTG CTC C-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切。pcDNA5/FRT載體(美國Invitrogen)經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切后的片段同編碼HA標記的DNA片段結(jié)合在一起，形成編碼DHODH的DNA片段，該載體命名為pDHODH-HA。

1.2.3構(gòu)建突變DHODH蛋白質(zhì)粒 DHODH突變體G202、R346W和R135C由pDHODH-HA產(chǎn)生，突變由PCR位點導向誘變產(chǎn)生[16]。所有PCR產(chǎn)生片段經(jīng)插入至pGEMT載體(美國Promega)后測序確認，表達載體與pcDNA5/FRT共同構(gòu)建。

為構(gòu)建可穩(wěn)定表達細胞系，按照生產(chǎn)商說明書HeLa Flp-InTMT-RexTMcells(美國Invitrogen)經(jīng)LipofectamineTM2000 (Invitrogen)共轉(zhuǎn)染于包含DHODH 和 pOG44的pcDNA5/FRT/TO。轉(zhuǎn)染后，細胞培養(yǎng)于含有潮霉素B (200 μg/mL)和滅瘟素S (10 μg/mL，美國Invitrogen)的DMEM培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4周后,挑選獨立菌株,轉(zhuǎn)移培養(yǎng)于獨立培養(yǎng)皿，并用抗HA抗體檢測表達。當加入DOX(doxycycline;1 μg/mL)于培養(yǎng)液時，可在指定時期誘導相應(yīng)蛋白的表達。

1.2.4蛋白免疫印記檢測 HeLa細胞裂解于TNE裂解液(50 mmol/L Tris/HCl，pH 7.5,1 mmol/L EDTA,150 mmol/L NaCl和0.5% Nonidet P40)。將20 μg提取蛋白上樣于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離，并用下文所提及的具體抗體進行免疫印跡檢測。檢測信號通過辣根過氧化物酶(HRP)-標記抗兔免疫球蛋白G(IgG)和增強化學發(fā)光(ECL)試劑(GE Healthcare)顯影。化學發(fā)光結(jié)果通過預(yù)冷電荷耦合設(shè)置(CCD)相機(LAS1000plus;Fuji Photo Film)進行記錄和定量分析。

1.2.5亞線粒體定位 細胞收集器將HeLa細胞(1×108個)收集后懸浮于PBS溶液,經(jīng)離心后沉淀，并用同質(zhì)化緩存液清洗。上清液以10 000×g離心6 min后，將沉淀物作為原始線粒體部分。取20 μg線粒體處理于低滲液(10 mmol/L Hepes/KOH,pH 7.4 和1 mmol/L EDTA)于 4 ℃裂解線粒體外膜。經(jīng)過低滲處理后，10 000×g離心6 min以獲得純化線粒體。將該線粒體組分懸浮于低滲緩沖液并用200 μg/mL蛋白酶K(含或不含1% Triton X-100)于冰上消化20 min。加入15% 三氯乙酸沉淀蛋白。沉淀溶于樣品緩沖液(6% SDS,150 mmol/L氨基甲烷,10 mmol/L EDTA 和 25%甘油后經(jīng)SDS/SPS-PAGE電泳和印跡分析檢測。

1.2.6HeLa細胞免疫熒光成像 HeLa細胞經(jīng)含500 nmol/L MitoTracker?Red (Invitrogen)處理20 min(按生產(chǎn)廠商說明書)。細胞固定滲透處理后，處理于1∶200稀釋含抗HA和抗DHODH血清的1% BSA/PBS溶液1 h。處理后的樣本置于Superfrost(Matsunami)。熒光圖像經(jīng)熒光顯微鏡(Biorevo,KEYENCE)獲取分析。

1.2.7氧化呼吸鏈活性生化檢測 分光光度法(U-3210，日立)檢測DHODH依賴氧化呼吸酶活性。穩(wěn)定表達DHODH的HeLa細胞冰浴15 min裂解于低滲緩沖液(2.5 mmol/L Tris/HCl,pH 7.5 和 2.5 mmol/L MgCl2)，然后超聲裂解15 s，樣板用于檢測氧化呼吸鏈復(fù)合物活性。

標準反應(yīng)緩沖液包含50 mmol/L磷酸鉀，5 mg/mL BSA和2.5 mmol/L MgCl2。檢測不同復(fù)合體用不同的反應(yīng)底物(電子供體及電子受體)，每組反應(yīng)都由受檢測的特殊氧化呼吸鏈復(fù)合體的對應(yīng)抑制劑來終止。每組參與反應(yīng)的蛋白濃度通過二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測法(Thermo Scientific)確定。每組復(fù)合體的活力通過每分鐘每毫克底物氧化或還原率的改變來計算。檢測每組復(fù)合體活力時加入其余氧化還原復(fù)合體的抑制劑，以確保所檢測活力僅反映所檢測酶復(fù)合體活力。每組數(shù)據(jù)檢測于同一日，在相同條件下，重復(fù)3次。

1.2.7.1DHO-泛琨氧化還原酶活性 DHODH活力在37 ℃時通過分光光度法檢測600 nm還原2，6-二氯靛酚(2,6-dichlorophenol-indophenol,DCPIP;用作虛擬電子受體)吸光度的降低程度?？偟恼f來，反應(yīng)由1 mL標準反應(yīng)緩存液中的20 mmol/L DHO和50 μmol/L DCPIP啟動，并包含2 μg的rotenone(復(fù)合體Ⅰ抑制劑)，2 μg的抗霉素A(復(fù)合體Ⅲ抑制劑)，5 mmol/L的NaN3(復(fù)合體Ⅳ抑制劑)及0.1 mg全細胞溶液。檢測結(jié)果顯示為nmol/μg蛋白。反應(yīng)體系通過加入2 μg的來氟米特(leflunomide,LFN)終止。

1.2.7.2琥珀酸脫氫酶(氧化體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ)活力 琥珀酸脫氫酶(復(fù)合體Ⅱ)活力通過分光光度法檢測于37 ℃。反應(yīng)由含50 μmol/L DCPIP和20 mmol/L琥珀酸，2 μg的rotenone，2 μg的抗霉素A，5 mmol/L NaN3和0.1 mg全細胞液的1 mL標準反應(yīng)緩存液發(fā)起。檢測結(jié)果顯示為nmol/μg蛋白。

1.2.7.3細胞色素C還原酶(復(fù)合體Ⅲ)活性 細胞色素C還原酶(復(fù)合體Ⅲ)活力通過分光光度法于37 ℃檢測。通過檢測細胞色素C于550 nm吸光度的降低程度來檢測。反應(yīng)由含5 mmol/L癸基泛醌和2 μg的魚藤酮，5 mmol/L的NaN3,60 μmol/L細胞色素C和0.1 mg全細胞液的1 mL標準反應(yīng)緩存液發(fā)起。反應(yīng)通過加入2 μg的抗霉素A終止，檢測結(jié)果顯示為nmol/μg蛋白。

1.2.7.4細胞色素酶C氧化還原酶活性 DHO:細胞色素酶C氧化還原酶活性評估方法與1.2.7.3細胞色素酶C還原酶活性評估方法相似。檢測環(huán)境與條件也與復(fù)合體Ⅲ相近，但將20 mmol/L DHO作為供體底物，并通過加入2 μg的抗霉素A終止反應(yīng)。

1.2.8蛋白穩(wěn)定性分析 野生型和突變型DHODH-HA經(jīng)DOX誘導24 h產(chǎn)生后，分別在次日0、2、4、8 h后加入50 μg/mL放線菌酮(CHX)，并收集細胞。提取總蛋白以進行蛋白免疫印跡檢測，使用多克隆抗DHODH和抗HA抗體。檢測分析條帶信號。

2 結(jié) 果

2.1建立穩(wěn)定表達DHODH蛋白的HeLa細胞系 構(gòu)建載體轉(zhuǎn)入細胞后，建立了在DOX誘導下可穩(wěn)定表達包含DHODH-HA組合蛋白的細胞系(DHODH蛋白C末端包含HA標記)。經(jīng)DOX誘導24 h后，同非誘導細胞系相比，組合DHODH-HA的表達量翻了5倍(圖1A)。DHODH-HA蛋白經(jīng)HA抗體染色后誘導效果(圖1B)及誘導前未經(jīng)HA抗體染色的蛋白表達情況顯示內(nèi)、外源性DHODH均準確定位于線粒體。

A:HA標記野生型DHODH蛋白印跡結(jié)果;B：融合DHODH蛋白細胞免疫熒光染色結(jié)果

圖1野生型DHODH蛋白表達和定位

2.2米勒綜合征相關(guān)聯(lián)DHODH-HA的表達和定位 為觀察米勒綜合征中發(fā)現(xiàn)的突變蛋白的處理、定位和功能，將G152R、R346W和R135C突變引入DHODH cDNA(圖2A)。經(jīng)DOX誘導24 h后，同非誘導細胞系相比，組合DHODH-HA的表達量翻了5倍(圖2B)。經(jīng)免疫熒光染色檢測，R135C-突變型DHODH顯示了正常的細胞內(nèi)定位?？笻A抗體顯示其存在于HeLa細胞中的線粒體內(nèi)(圖2C)。而G202A和R346W突變型則顯示弱染色，雖然同樣定位于線粒體內(nèi)。R346W型構(gòu)建體顯示在線粒體外有弱溶解(圖2C)。

2.3突變DHODH蛋白在線粒體內(nèi)的定位 經(jīng)低滲處理后，野生型和所有的DHODH突變蛋白均可被蛋白酶k剪切消化(圖2D，第4列)。當線粒體內(nèi)膜經(jīng)非離子洗滌劑TritonX-100處理后，TFAM和DHODH都被蛋白酶k消化(圖2D，第5列)。實驗中構(gòu)建的3種突變DHODH蛋白均準確存在于線粒體內(nèi)膜空間內(nèi)或內(nèi)膜內(nèi)(圖2D，第2、3、4行)。

A：DHODH及米勒綜合征相關(guān)突變結(jié)構(gòu)圖示；B：HA標記野生型DHODH蛋白誘導后的表達情況；C：融合突變型DHODH免疫熒光染色結(jié)果；D：外源性野生型和突變型DHODH蛋白在線粒體內(nèi)的亞定位；1：完整線粒體；2.線粒體外膜經(jīng)蛋白酶處理后；3、4：線粒體外膜經(jīng)低滲法裂解后；5：線粒體經(jīng)裂解及蛋白酶處理后

圖2米勒綜合征相關(guān)突變蛋白的表達和定位

2.4R346W和G202A突變DHODH的蛋白穩(wěn)定性減低 經(jīng)DOX誘導后用CHX抑制新蛋白的表達。DHODH蛋白總量經(jīng)CHX處理0、2、4、8 h后收集后檢測。野生型和R135C型DHODH蛋白水平8 h處理后相對一致(圖3)，突變蛋白自身降解加快。而在實驗中，并未觀察到β-actin的不穩(wěn)定性(圖3A)。

2.5突變DHODH蛋白的DHO依賴泛醌和細胞色素C氧化還原酶活性 通過檢測野生型和兩株可穩(wěn)定表達突變型R135C DHODH的細胞檢測氧化呼吸復(fù)合體的酶活性，發(fā)現(xiàn)在HeLa細胞轉(zhuǎn)染體中，誘導后的野生型DHODH蛋白的DHO依賴酶活性較突變型增加了5倍；而在突變型R135C中，誘導后相應(yīng)蛋白表達量增加了5倍，但其DHO依賴酶活性卻沒有明顯的變化(圖1A和圖4A)。經(jīng)DOX誘導后，G202A和R346W型DHODH的DHO依賴酶活性增加了2倍，與其蛋白表達量的增加幅度相對應(yīng)，即G202A和R346W型DHODH蛋白的功能酶活性存在，而其蛋白穩(wěn)定性減低(圖4B)。而R135C和野生型DHODH兩組中復(fù)合體Ⅱ、復(fù)合體Ⅲ和復(fù)合體Ⅱ～Ⅲ聯(lián)合體的多項都沒有差別(圖4C)。

A：經(jīng)CHX處理0、2、4、8 h后野生型和突變型DHODH蛋白表達情況；B：圖A相關(guān)圖像資料量化結(jié)果

圖3突變型DHODH蛋白穩(wěn)定性檢測結(jié)果

A：R135C型DHODH轉(zhuǎn)染細胞中降低的DHO依賴酶活性；B：表達G202C和R346W型DHODH蛋白細胞中DHO依賴還原酶活性檢測；C：表達R135C和野生型DHODH的細胞中線粒體復(fù)合體Ⅱ和Ⅲ活性檢測結(jié)果。a：P<0.05,與對照組比較

圖4米勒綜合征相關(guān)DHODH突變蛋白酶活性檢測

3 討 論

米勒綜合征以常染色體隱性異?；驈?fù)合雜合子模式遺傳[13]。米勒綜合征阻斷了第一和第二鰓弓的發(fā)育。DHODH基因突變時如何導致鰓弓的異常發(fā)育目前尚不清楚。但需要指出的是DHODH是從頭嘧啶合成6個限速酶中的第4個[8]，該途徑中的其余5個酶分別組成兩個不同的酶復(fù)合體，并均存在于細胞質(zhì)中。前3個酶形成了多重酶復(fù)合體CAD(氨基甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨基甲酰酶和二氫乳清酸酶)，而第5和第6個酶形成了UMPS。

UMPS基因編碼具有乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶雙重功能的酶[17]。UMPS基因復(fù)合雜合子突變引起乳清酸尿癥，一種較少見的常染色體隱性遺傳。其臨床表現(xiàn)包括了巨幼紅細胞性貧血癥和乳清酸結(jié)晶尿，并常伴有智力和身體發(fā)育上的遲緩[18]。然而，作為UMPS突變并不會引起與米勒綜合征相似的發(fā)育異常。這提示，米勒綜合征中的嘧啶或嘌呤缺乏并不是導致頜面發(fā)育異常的原因。

WHITE等[19]曾報道LFN(一種DHODH抑制劑)，可引起斑馬魚神經(jīng)嵴發(fā)育的完全停止以及哺乳動物神經(jīng)嵴干細胞自我更新的減緩。LFN發(fā)揮這些作用是通過抑制神經(jīng)嵴發(fā)育所需基因的轉(zhuǎn)錄延長來實現(xiàn)的[17]。神經(jīng)嵴細胞的特殊發(fā)育途徑對黑素瘤的形成有直接關(guān)系，提示了DHODH也參與了神經(jīng)嵴細胞的增殖和發(fā)育。

甲氨蝶呤是一種從頭嘌呤生物合成的抑制劑，而其抗增殖作用通常被認為是由其對二氫葉酸還原酶(DHFR)的抑制作用而產(chǎn)生的。嬰幼兒中甲氨蝶呤最常導致的發(fā)育異常胚胎疾病包括：發(fā)育缺陷、顱縫早閉、小頜以及骨骼異常，而這些癥狀與米勒綜合征個體所表現(xiàn)的個體癥狀相類似[20]。然而，DHFR自身突變并不會導致頜面異常?？紤]到米勒綜合征部分程度上是由于線粒體功能異常，甲氨蝶呤有可能不僅僅作用于DHFR，也作用于神經(jīng)嵴細胞的線粒體。

許多出生缺陷，例如米勒綜合征和甲氨蝶呤所致胚胎病，都與頜面發(fā)育異常相關(guān)。這些數(shù)據(jù)說明神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育涉及頜面發(fā)育[23]。而米勒綜合征患者所表現(xiàn)臨床癥狀有可能是由于DHODH功能缺失所引起的神經(jīng)嵴細胞發(fā)育缺陷所致。

人體內(nèi)DHODH蛋白主要由兩部分組成：較大的C末端(蛋氨酸78-精氨酸396)和較小的N末端(蛋氨酸30-亮氨酸68)，其間通過一個擴展環(huán)連接。較大C末端域被描述為α/β-筒折疊，其中央筒有8個平行β鏈，外圍環(huán)繞著8個ɑ螺旋。此結(jié)構(gòu)中存在一些近端還原位點，并以部分帶點或復(fù)極化鏈收尾(Gln47、Tyr356、Thr360和Arg135)。從人類到惡性瘧原蟲精氨酸135均存在于泛醌結(jié)合位點，其均表現(xiàn)出了保守性。本研究觀察了DHODH突變型R135C，該型在米勒綜合征患者中也被監(jiān)測出。該突變型具有準確的線粒體定位功能，但卻缺乏DHO依賴酶活性。由于DHODH的α-和β-筒域形成了酶活性反應(yīng)的作用位點，與α-和β-筒域相互作用的化合物可阻斷DHODH活性。G202A和R346W存在于DHODH的ɑ-筒域內(nèi)；G202A和R346W突變體可能是由于蛋白質(zhì)構(gòu)象上的改變而導致蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低。

本研究涉及實驗中，MitoTracker?Red染色的細胞與HA染色的細胞部分重疊，提示細胞中表達的野生型DHODH-HA蛋白準確表達于線粒體中。相同的染色結(jié)果可觀察于經(jīng)抗DHODH抗體處理的染色結(jié)果中(圖1B)，提示內(nèi)、外源性DHODH均準確定位于線粒體。實驗中用同樣方法成功構(gòu)建了可穩(wěn)定表達突變型DHODH的細胞株(圖2)，對突變型蛋白的定位研究結(jié)果提示突變型蛋白都主要存在于線粒體內(nèi)，盡管一小部分R346W存在于細胞質(zhì)內(nèi)。為檢測野生型和突變型DHODH-HA蛋白在線粒體內(nèi)的定位，通過低滲法裂解線粒體外膜后(圖2D，每組中第3、4列)，可觀察到BAP37(一種線粒體內(nèi)膜蛋白)，可被蛋白酶k消化；而TFAM(存在于線粒體基質(zhì)內(nèi)的蛋白)，則因受到內(nèi)膜保護而不被蛋白酶k消化(圖2D，第4列較低行)，從而說明低滲法可保持線粒體內(nèi)膜的完整性。通過低滲法完整提出線粒體對判斷突變型DHODH的定位提供了保證。

為檢測突變DHODH蛋白減少是否是由于蛋白穩(wěn)定性降低所致，本研究培養(yǎng)了可穩(wěn)定表達野生型或突變型DHODH蛋白的HeLa細胞，并在經(jīng)DOX誘導后用CHX抑制新蛋白的表達。DHODH蛋白總量經(jīng)CHX處理0、2、4、8 h后收集后檢測。野生型和R135C型DHODH蛋白水平8 h處理后相對一致(圖3)，突變蛋白自身降解加快。在實驗中，并未觀察到β-actin的不穩(wěn)定性(圖3A)。由于這些突變都存在于DHODH蛋白的α螺旋中，也有可能是突變導致了蛋白結(jié)果穩(wěn)定性的降低從而加速了蛋白的降解。R346W和G202A突變導致的DHODH蛋白穩(wěn)定性降低，從某種程度上對米勒綜合征的發(fā)生發(fā)揮了作用。

由于R135C型DHODH突變蛋白并未顯示明顯的穩(wěn)定性或內(nèi)膜空間定位功能異常，實驗接著檢測了該突變是否影響酶活性。結(jié)果顯示突變型R135C DHODH缺失其供電子功能。有研究顯示，Arg135殘基存在于DHODH蛋白的泛醌結(jié)合位點上，提示了R135C突變型有可能無法結(jié)合于泛醌發(fā)揮作用。

考慮R135C突變是否會影響其他氧化呼吸復(fù)合體的功能，研究中同時也比較了DOX誘導后的酶活性，結(jié)果顯示無差別。提示R135C DHODH并沒有直接影響其他的氧化呼吸復(fù)合體。

本研究觀察到，G202A和R346W突變型引起了蛋白穩(wěn)定性的缺失和R135C突變型底物誘導酶活性的受損，這些提示DHODH蛋白活性受損與米勒綜合征表現(xiàn)型相關(guān)。

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