HERV-HLTR相關(guān)蛋白2在肝癌中的表達(dá)及其臨床意義*

李 國，張曉峰，太云翔，代亞海,湯旭東，陳 琨

(1.四川省涼山彝族自治州第一人民醫(yī)院肝膽外科 615000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶 400038；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400016)

原發(fā)性肝癌是我國最為常見的腫瘤之一，在我國腫瘤相關(guān)死亡原因中居第三位。機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能狀況與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，一旦肝細(xì)胞癌變，機(jī)體免疫系統(tǒng)能通過多種免疫監(jiān)視機(jī)制將癌變細(xì)胞清除，但由于肝癌細(xì)胞能夠通過多種機(jī)制逃逸免疫系統(tǒng)的攻擊而發(fā)病。既往的研究表明，共刺激/共抑制(Co-stimulatory/Co-inhibitory)B7家族是惟一能從抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APC)單向傳送信號(hào)給T細(xì)胞的分子。在T細(xì)胞的活化過程中，B7家族與CD28家族以配體-受體結(jié)合的形式在T細(xì)胞活化過程中提供正負(fù)雙重信號(hào)。HERV-HLTR相關(guān)蛋白2(HERV-HLTR-associating protein 2,HHLA2)是最新發(fā)現(xiàn)的B7家族成員。新近的研究表明，HHLA2與T細(xì)胞上可能的受體結(jié)合后，可以抑制CD4和CD8+T細(xì)胞的增殖和活化，負(fù)性調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答過程[1]。在多種不同器官、組織來源的腫瘤細(xì)胞中，HHLA2均呈高水平表達(dá)。目前的研究表明，在結(jié)腸癌、食道癌、腎癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、 卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌及黑色素瘤中HHLA2均為過表達(dá)[2-3]。目前國內(nèi)外少見文獻(xiàn)報(bào)道HHLA2在肝癌中的表達(dá)情況，本研究擬采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)四川省涼山州彝族自治州第一人民醫(yī)院肝細(xì)胞癌患者腫瘤及癌旁組織中HHLA2的表達(dá)水平，探討HHLA2在患者肝癌組織表達(dá)的水平及其在肝癌患者預(yù)后中的作用。

A：陰性細(xì)胞切片對(duì)照；B：弱陽性細(xì)胞對(duì)照；C：強(qiáng)陽性細(xì)胞對(duì)照；D：高分化肝癌中HHLA2的表達(dá)；E：中分化肝癌中HHLA2的表達(dá)；F：低分化肝癌HHLA2的表達(dá)

圖1不同病理分級(jí)肝癌組織中HHLA2的表達(dá)(×400)

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2006-2016年在四川省涼山州彝族自治州第一人民醫(yī)院病理科存檔的150例患者肝細(xì)胞癌石蠟標(biāo)本。其中男113例，女37例，年齡27～76歲，中位年齡58歲，所有患者標(biāo)本均經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色，由病理科醫(yī)師讀片，確認(rèn)為肝細(xì)胞癌患者。所有患者均在該院接受手術(shù)切除治療，采集新鮮肝癌組織和癌旁肝臟組織標(biāo)本，按照病理檢查結(jié)果分為高、中、低分化，其中高分化患者58例，中分化患者67例，低分化患者25例。150例患者中，121例患者為HBV感染者。所有患者均未接受化療、放療及生物免疫治療，并且不合并其他自身免疫性疾病及其他器官腫瘤。同時(shí)收集在該院消化內(nèi)科住院，并接受肝組織活檢的10例患者正常肝組織作為對(duì)照。本研究對(duì)病例資料的收集獲得該院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1免疫組化檢測(cè) 所有臨床標(biāo)本均用4%甲醛溶液浸泡固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋后切片，切片厚度為5 μm；切好的病理片用60 °C烤箱融化石蠟，依次經(jīng)二甲苯脫蠟，并置于100%、90%、80%、70%乙醇內(nèi)水化；然后將切片置0.3% H2O2中浸泡10 min以去除內(nèi)源性抗原；然后將切片置于抗原修復(fù)溶液中(DAKO,S1700,USA)，微波爐加熱2 min后將切片置于蒸鍋中蒸30 min進(jìn)行熱修復(fù)；然后加入小鼠抗人HHLA2單克隆抗體(RnD，USA，Clone # 907812)，1∶200稀釋，于37 °C孵育50 min；加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗鼠二抗[DAKO ENVISION+HRP,anti-mouse(K4000),丹麥]，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，染色完成后，分別在70%、80%、95%、100%乙醇中脫水各3 min，中性樹脂封片。陰性對(duì)照為磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，陽性對(duì)照為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人HHLA2的小鼠3T3成纖維細(xì)胞組織膠石蠟切片。

1.2.2結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化染色的切片分別由2名資深病理科醫(yī)師雙盲獨(dú)立觀察評(píng)估，以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色至棕褐色顆粒判定為陽性染色。首先在低倍鏡觀察切片，并隨機(jī)選取腫瘤細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)的5個(gè)高倍視野(×400)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按細(xì)胞染色強(qiáng)度分級(jí)：無著色計(jì)0分，淡黃色著色計(jì)1分，棕黃色著色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；染色陽性細(xì)胞密度百分比分級(jí)：陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，10%<陽性細(xì)胞數(shù)≤50%為2分，陽性細(xì)胞數(shù)>50%為3分；以上2項(xiàng)積分相乘結(jié)果≥3分為陽性表達(dá)。腫瘤細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)內(nèi)任一項(xiàng)陽性均認(rèn)定為陽性表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1不同病理分化肝癌組織中HHLA2的表達(dá)及分布 HHLA2在肝癌組織中的表達(dá)均增強(qiáng)(染色為黃色以上，1分以上)，主要表達(dá)于肝癌的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色至棕褐色顆粒、團(tuán)塊狀，呈多區(qū)域分布，HHLA2在肝癌患者中的表達(dá)陽性率為75.3%(113/150)；而HHLA2在癌旁組織中陽性率為8.6%(13/150)，而正常肝臟組織中HHLA2不表達(dá)。肝癌組織中HHLA2陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織和正常組織(P<0.05)。并且，在不同的病理分化程度肝癌組織中，HHLA2的表達(dá)強(qiáng)度亦不相同，病理分化程度低的肝癌中，HHLA2的表達(dá)更高，HHLA2在高分化組、中分化組、低分化組及對(duì)照組中的表達(dá)情況，見圖1、表1。

表1 不同病理分級(jí)肝癌組織中HHLA2的陽性表達(dá)率

a：P<0.05，與高分化組比較；b：P<0.05，與中分化組比較；c：P<0.05，與低分化組比較

2.2不同年齡分組HHLA2的表達(dá) 按患者年齡≥50歲與小于50歲分組，≥50歲患者HHLA2的陽性表達(dá)率為(41.610±1.733)%，<50歲患者HHLA2的陽性表達(dá)率為(44.480±1.600)%，兩組間HHLA2的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.218，P=0.225 1)。

2.3不同肝功能Child-Pugh分級(jí)患者肝癌組織中HHLA2的表達(dá)及分布 在Child-Pugh分級(jí)為A級(jí)的患者HHLA2陽性表達(dá)率明顯低于肝功能B級(jí)及C級(jí)患者，肝功能B級(jí)患者與肝功能C級(jí)患者肝癌組織中HHLA2的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同肝功能Child-Pugh分級(jí)患者肝癌組織HHLA2的陽性表達(dá)率

a：P<0.01，與A級(jí)比較

2.4不同肝癌分期患者肝癌組織中HHLA2的表達(dá)率 肝癌分期采用巴塞羅那(BCLC)分期，不同分期肝癌患者癌組織中HHLA2的表達(dá)率隨著腫瘤分期的進(jìn)展逐漸升高，以巴塞羅那分期D期患者肝癌組織中的HHLA2表達(dá)率最高，A期與B期比較、 B期與C期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C期與D期比較HHLA2表達(dá)率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 HHLA2在不同BCLC分期肝癌組織中的陽性表達(dá)率

a：P<0.05，與A期比較;b：P<0.05,與B期比較

2.5不同血清甲胎蛋白(AFP)水平組患者肝癌組織HHLA2的陽性表達(dá)率 以血清AFP作為分組標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為AFP≥400 μg/L組與AFP<400 μg/L組，AFP≥400μg/L組HHLA2的陽性表達(dá)率為(45.440±2.561)%，AFP<400μg/L組為(42.250±1.339)%，兩組患者肝癌組織中HHLA2的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.00，P>0.05)。

3 討 論

免疫尤其是細(xì)胞免疫是機(jī)體抑制腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制，T細(xì)胞是細(xì)胞免疫最重要的角色，B7家族配體與CD28家族受體是主要的T細(xì)胞共刺激/共抑制分子。既往的研究表明，這些分子在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的影響，尤其是共抑制分子在腫瘤細(xì)胞的異位表達(dá)，共抑制分子配體與其受體結(jié)合后能抑制T細(xì)胞的活性，抑制T細(xì)胞增殖，并且誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。在腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視中具有極其重要的作用，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。B7家族成員PD-1與HHLA2相近，都是免疫抑制調(diào)節(jié)分子，腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[4-9]；阻斷PD-l/PD-L1之間的結(jié)合之后，機(jī)體針對(duì)腫瘤的免疫殺傷明顯增強(qiáng)[10-12]。因此B7家族是腫瘤免疫治療重要的靶點(diǎn)。目前PD-l/PD-L1阻斷抗體已經(jīng)上市，在臨床腫瘤免疫治療中已經(jīng)顯示出良好的治療效果，大有取代傳統(tǒng)放化療的趨勢(shì)[13]。

HHLA2是目前發(fā)現(xiàn)的最新免疫共抑制分子，HHLA2主要表達(dá)于人單核細(xì)胞，可能與T細(xì)胞上尚未發(fā)現(xiàn)的受體結(jié)合，抑制CD4+及CD8+T細(xì)胞的活化、增殖，并且還能在體外明顯降低干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-5、IL-10、IL-13、IL-17A及IL-22的分泌，在免疫抑制中具有重要的作用[1]。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，HHLA2僅低水平表達(dá)于小腸、乳腺、腎臟、膀胱及胎盤組織的上皮細(xì)胞。其中胎盤組織中HHLA2的表達(dá)較高，原因可能是為了保護(hù)胎兒不受母體免疫系統(tǒng)的攻擊[2]。在本研究中采用免疫組化分析了HHLA2在肝癌及正常癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明HHLA2在正常組織中表達(dá)水平極低、表達(dá)率僅為(1.520±0.399)%。癌組織過表達(dá)HHLA2可造成腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展[14]。既往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，HHLA2在結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中呈陽性表達(dá)[15]，但HHLA2在肝癌組織中的表達(dá)情況，尚少見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究中發(fā)現(xiàn)，HHLA2在肝癌尤其是進(jìn)展期肝癌組織中高度表達(dá)。HHLA2作為最新發(fā)現(xiàn)的免疫共抑制分子，可能在肝癌進(jìn)展中發(fā)揮重要的免疫抑制作用，以幫助腫瘤細(xì)胞免遭機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，HHLA2在高分化肝癌中的表達(dá)顯著低于中分化、低分化組，又以低分化肝癌中的表達(dá)陽性率最高，該結(jié)果提示HHLA2的表達(dá)可能與其信號(hào)通路激活有關(guān)，但目前HHLA2的受體尚未明確。

BCLC分期被認(rèn)為是目前肝癌最好的分期系統(tǒng)，在大量的臨床研究中使用。在本研究中發(fā)現(xiàn)，BCLC分期以C、D期患者HHLA2的陽性表達(dá)率高，顯著高于A、B期患者，C期與D期患者之間HHLA2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；該研究結(jié)果表明，隨著BCLC分期的進(jìn)展，HHLA2在肝癌組織中的表達(dá)也隨之增高，提示HHLA2與肝癌的生長和轉(zhuǎn)移可能存在一定的關(guān)系。并且最近的研究表明，在膠質(zhì)瘤患者中，轉(zhuǎn)移灶的HHLA2表達(dá)水平明顯高于原發(fā)灶，因此認(rèn)為，HHLA2亦可能在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定的作用。但AFP≥400 μg/L組與AFP<400 μg/L組患者HHLA2的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，不同年齡組患者之間肝癌組織HHLA2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究結(jié)果提示，HHLA2在肝癌組織中呈高表達(dá)，HHLA2可能與腫瘤的免疫逃逸有關(guān)，有研究觀察到HHLA2蛋白能夠結(jié)合到CD3陽性的T細(xì)胞表面[1]。該結(jié)果表明在T細(xì)胞表面存在HHLA2的受體，但目前HHLA2在T細(xì)胞表面的受體尚未闡明，可能HHLA2結(jié)合到 T細(xì)胞表面受體，通過抑制T細(xì)胞活化、增殖，并誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡以協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視。

綜上所述，在肝癌患者癌組織中HHLA2的表達(dá)陽性率明顯升高，其表達(dá)可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中具有一定的作用；并且，HHLA2可能作為一種腫瘤診斷、判斷預(yù)后的指標(biāo)，由于HHLA2的共抑制作用在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，因此也可能作為腫瘤抗體治療的靶標(biāo)[16-17]。

[1]ZHAO R,CHINAI J M,BUHL S,et al.HHLA2 is a member of the B7 family and inhibits human CD4 and CD8 T-cell function[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(24):9879-9884.

[2]JANAKIRAM M,CHINAI J M,FINEBERG S,et al.Expression,Clinical Significance,and Receptor Identification of the Newest B7 Family Member HHLA2 Protein[J].Clin Cancer Res,2015,21(10):2359-2366.

[3]BYERS J T,PANICCIA A,KAPLAN J,et al.Expression of the Novel Costimulatory Molecule B7-H5 in Pancreatic Cancer[J].Ann Surg Oncol,2015,22(Suppl 3):S1574-1579.

[4]MASUGI Y,NISHIHARA R,YANG J,et al.Tumour CD274(PD-L1)expression and T cells in colorectal cancer[J].Gut,2017,66(8):1463-1473.

[5]TORABI A,AMAYA C N,WIANS F H Jr,et al.PD-1 and PD-L1 expression in bone and soft tissue sarcomas[J].Pathology,2017,49(5):506-513.

[6]申媛媛,厲紅元.PD-1/PD-L1在乳腺腫瘤中的研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué),2015,44(12)：1708-1711.

[7]AJONA D,ORTIZ-ESPINOSA S,MORENO H,et al.A combined PD-1/C5a blockade synergistically protects against lung cancer growth and metastasis[J].Cancer Discov,2017,7(7):694-703.

[8]SHEN T,ZHOU L,SHEN H,et al.Prognostic value of programmed cell death protein 1 expression on CD8+T lymphocytes in pancreatic cancer[J].Sci Rep,2017,7(1):7848.

[9]李秀玉,胡波,李忠新.CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和PD-1+CD4+T細(xì)胞對(duì)宮頸內(nèi)皮細(xì)胞瘤預(yù)后的作用[J].重慶醫(yī)學(xué),2015,44(18):2477-2479.

[10]CHANG C H,WANG Y,LI R,et al.Combination therapy with bispecific antibodies and PD-1 blockade enhances the antitumor potency of T cells[J].Cancer Res,2017,77(19):5384-5394.

[11]SHI X,ZHANG X,LI J,et al.PD-1/PD-L1 blockade enhances the efficacy of SA-GM-CSF surface-modified tumor vaccine in prostate cancer[J].Cancer Lett,2017,406(1):27-35.

[12]AYERS M,LUNCEFORD J,NEBOZHYN M,et al.IFN-γ-related mRNA profile predicts clinical response to PD-1 blockade[J].J Clin Invest,2017,127(8):2930-2940.

[13]KILLOCK D.Immunotherapy:PD-1 blockade exploiting MMR deficiency[J].Nat Rev Clin Oncol,2017,14(8):459.

[14]KORIALA P,ROTH ME,GILL J,et al.HHLA2,a member of the B7 family,is expressed in human osteosarcoma and is associated with metastases and worse survival[J].Sci Rep,2016(6):31154.

[15]CHENG H,JANAKIRAM M,BORCZUK A,et al.HHLA2,a new immune checkpoint member of the B7 family,is widely expressed in human lung cancer and associated with EGFR mutational status[J].Clin Cancer Res,2017,23(3):825-832.

[16]JANAKIRAM M,PAREEK V,CHENG H,et al.Immune checkpoint blockade in human cancer therapy:lung cancer and hematologic malignancies[J].Immunotherapy,2016,8(7):809-819.

[17]JANAKIRAM M,CHINAI J M,ZHAO A,et al.HHLA2 and TMIGD2:new immunotherapeutic targets of the B7 and CD28 families[J].Oncoimmunology,2015,4(8):e1026534.