miRNA-203聯(lián)合TSGF、CEA檢測在胃癌診斷中的應(yīng)用

殷立奎，徐廣曉，朱新興，李守勇

(山東省東營市人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.手術(shù)室 257091)

胃癌的發(fā)病率與病死率在全球范圍內(nèi)居于第3位，表現(xiàn)為三高(發(fā)病率高、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、病死率高)與三低(早診率低、根治切除率低、5年生存率低)的特點，成為最為常見的消化道惡性腫瘤[1-2]。胃癌的發(fā)現(xiàn)及治療效果，均可以通過腫瘤標(biāo)志物(TM)來快速診斷。隨著細(xì)胞分子生物學(xué)的進(jìn)步，TM的檢測使早發(fā)現(xiàn)、早診斷腫瘤成為了可能。血清TM的異常通常早于影像學(xué)。胃癌早期患者無明顯的臨床癥狀，任何一項特異和敏感的TM出現(xiàn)異常都有一定指導(dǎo)價值[3-4]。但單一TM檢測對胃癌診斷存在一定的局限性。故本文針對性地選擇腫瘤生長因子(TSGF)、微小核糖核酸(miRNA)-203、癌胚抗原(CEA)3種具有較高特異度與敏感度的TM來檢測胃癌患者與健康人群血清中的表達(dá)情況，通過比較3種TM對胃癌檢測及預(yù)后的診斷價值，以期為臨床提供一定的參考指標(biāo)。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年7月至2016年7月來本院就診的胃癌患者40例納入觀察組，以上患者均未進(jìn)行放化療與免疫治療，且經(jīng)病理學(xué)檢查證實。觀察組男23例，女17例；平均年齡(48.37±4.78)歲；依據(jù)2010版國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(IUICC/AJCC)制定的腫瘤(TNM)分期標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅰ～Ⅳ期，其中Ⅰ期8例，Ⅱ期12例，Ⅲ期12例，Ⅳ期8例。同時選擇同期健康志愿者30例為對照組，男20例，女10例，平均年齡(46.79±5.46)歲。兩組研究對象性別、年齡等一般性資料對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器與試劑 儀器為德國羅氏公司生產(chǎn)的全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀E-170，測定試劑盒及質(zhì)控品為儀器配套；日本Hitachi公司生產(chǎn)的全自動生化分析儀7080；湖南新大陸公司生產(chǎn)TSGF、CEA定量測定試劑盒與質(zhì)控品。

1.3方法 單核細(xì)胞分離提?。翰杉芯繉ο? mL空腹靜脈血(采入乙二胺四乙酸抗凝管)，3 h后使用Ficoll液分離，洗滌離心5次，棄上清液，保存于-80 ℃冰箱中備用。血漿RNA提?。阂勒誘rizol試劑盒標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格實施每一步，經(jīng)所得RNA A260/280調(diào)節(jié)在1.8～2.1。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：依照Access RT-PCR System嚴(yán)格操作，并依據(jù)GenBank設(shè)計對應(yīng)序列引物(a為正義引物，b為反義引物)：miR-203-Fa GTG AAA TGT TTA GGA CCA CTA GAA，miR-203-Rb GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT，U6 RNA-Fa CGC TTC GGC AGC ACA TAT AC，U6 RNA-Rb TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT。其中，總反應(yīng)體系為50 μL：28 μL 無核酸酶水，10 μL AMV /Tfl 5X反應(yīng)緩沖液，1 μL dNTP混合液(10 mmol/ L)，1 μL下游引物，1 μL 上游引物，2 μL 25 mmol/L硫酸鎂，1 μL AMV反轉(zhuǎn)錄酶，1 μL Tfl DNA聚合物，5 μL RNA。反應(yīng)條件： 45 ℃ 45 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，68 ℃ 2 min，68 ℃ 7 min，4 ℃ ∞。以上循環(huán)進(jìn)行40次。血清CEA水平、miRNA-203相對表達(dá)量、TSGF水平檢測均嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。參考值CEA為0.00～5.00 ng/mL，TSGF為0.00～64.00 U/mL。

2 結(jié) 果

2.1miRNA-203相對表達(dá)量，TSGF、CEA表達(dá)水平及陽性率比較 觀察組患者miRNA-203相對表達(dá)量為(0.26±0.16)U/mL,明顯低于對照組(P<0.05)；觀察組TSGF、CEA表達(dá)水平及陽性率明顯高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2不同分期胃癌患者miRNA-203相對表達(dá)量，TSGF、CEA表達(dá)水平及陽性率比較 miRNA-203相對表達(dá)量隨分期遞增而降低(F=5.60，P=0.007 5)。TSGF、CEA表達(dá)水平及陽性率隨分期遞增而增加，不同分期的TSGF、CEA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同分期CEA陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而不同分期TSGF陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 兩組miRNA-203相對表達(dá)量，TSGF、CEA表達(dá)水平及陽性率比較

2.3miRNA-203、TSGF、CEA對胃癌患者的診斷價值 miRNA-203+TSGF+CEA檢測的敏感度為95.00%，明顯高于miRNA-203、TSGF、CEA單項或者miRNA-203+CEA、TSGF+CEA、miRNA-203+CEA的敏感度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miRNA-203+TSGF+CEA檢測的診斷符合率為97.50%，特異度為90.00%，優(yōu)于單項或者兩項指標(biāo)聯(lián)合檢測結(jié)果(P<0.05)。見表3。

表2 不同分期胃癌患者miRNA-203相對表達(dá)量，TSGF、CEA表達(dá)水平及陽性率比較

表3 miRNA-203、TSGF、CEA對胃癌患者的診斷價值比較[(%)n/n]

3 討 論

胃癌是惡性腫瘤中最為常見的一種，其發(fā)病率在不同地區(qū)和國家存在較大差異，其中芬蘭、日本是高發(fā)國家，而新西蘭、澳大利亞等國家的發(fā)病率較低[5]。在我國，胃癌占城市病死率的第2位，其中中南與西南地區(qū)最低，內(nèi)蒙古自治區(qū)及東北較高，西北地區(qū)最高，占農(nóng)村病死率的第1位。據(jù)有關(guān)調(diào)查顯示，每年胃癌死亡人數(shù)約17萬，與此同時每年有超過2萬患者被確診為胃癌。胃癌已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病之一，也是各大醫(yī)療機構(gòu)重點攻克的難題[6-7]，盡早診治有著重要臨床價值。

多數(shù)胃癌患者在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是中晚期，嚴(yán)重影響患者的康復(fù)。為了提高胃癌的早發(fā)現(xiàn)率，提高患者生存率，找到行之有效的TM極為關(guān)鍵。TM主要指機體對新生物發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)入到體液、組織的物質(zhì)，或者是癌細(xì)胞異常分泌或脫落的物質(zhì)。隨著細(xì)胞基因水平的發(fā)展，胃癌患者采用TM診斷使早發(fā)現(xiàn)、早診斷腫瘤在臨床成為可能[8]。TM檢測異常血清指標(biāo)變化也為臨床預(yù)估患者病情程度提供了指導(dǎo)。不同種類的癌癥其TM會產(chǎn)生不同類型的癌細(xì)胞，而同一種癌細(xì)胞也會產(chǎn)生多種TM[9]。

近年來，臨床較多把TM用來檢測多種類型腫瘤，但單一TM檢測存在特異度或敏感度較低的問題，故臨床上逐漸采用多種TM聯(lián)合檢測來診斷癌癥。最新研究報道顯示，miRNA-203和胃癌的發(fā)生存在顯著的相關(guān)性[10]。隨著腫瘤患者病情的進(jìn)展，血清miRNA-203出現(xiàn)明顯的異常表達(dá)。miRNA-203為19～22堿基長度的內(nèi)源性非編碼RNA，幾乎參與機體全部的基本信號傳輸路徑，并調(diào)控約1/3的人類基因水平表達(dá)，對許多基因的調(diào)控發(fā)揮關(guān)鍵作用。同時，miRNA-203還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡及一些腫瘤相關(guān)基因表達(dá)等代謝過程[11-12]。CEA也是廣譜性TM，主要成分是多糖蛋白復(fù)合物質(zhì)，在內(nèi)胚葉起源的胃癌、胰腺癌等消化系統(tǒng)腫瘤中大量存在。TSGF是與癌細(xì)胞增殖過程相關(guān)的多種糖類物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的總稱，主要是惡性癌細(xì)胞與組織附近毛細(xì)血管發(fā)生大量增生而關(guān)聯(lián)的內(nèi)皮生長因子[13]。本研究結(jié)果顯示，miRNA聯(lián)合TSGF、CEA檢測的敏感度為95.00%，明顯高于miRNA-203、TSGF、CEA單項或者miRNA-203+CEA、TSGF+CEA及miRNA-203+CEA的敏感度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；miRNA-203聯(lián)合TSGF、CEA檢測的診斷符合率為97.50%，特異度為90.00%，優(yōu)于單項或者兩項指標(biāo)聯(lián)合檢測結(jié)果。這是由于CEA自身特異度低，而敏感度較高，對腫瘤早期診斷有明顯輔助作用。同時TSCF為廣譜血清TM，其指標(biāo)變化僅對腫瘤增生有明顯反應(yīng)，對非惡性血管增生幾乎不會出現(xiàn)變化，故TSGF對胃癌患者血清指標(biāo)變化有明顯的高度特異性。而miRNA-203可以作為特異性的TM，可以提高胃癌的準(zhǔn)確診斷性。這也表明多種TM聯(lián)合檢測不僅能夠增強診斷的敏感度，也對早期診斷與病情監(jiān)測有指導(dǎo)作用，為臨床胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)提供方向[14-15]。

在腫瘤細(xì)胞的生長進(jìn)程中，miRNA-203可以調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究報道顯示，miRNA-203可對腫瘤進(jìn)行診斷、分期，不同程度的miRNA-203相對表達(dá)量和胃癌有明確聯(lián)系[16]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-203相對表達(dá)量隨分期遞增而增加，可以推測其在胃癌診斷及轉(zhuǎn)歸預(yù)測中的作用。而TSGF、CEA表達(dá)水平及陽性率隨分期遞增而增加。大多數(shù)患者腫瘤分泌血清CEA位于胃腸道、泌尿道等空腔臟器。在一般情況下，血清CEA通過胃腸道進(jìn)行代謝，發(fā)生腫瘤時，CEA會通過循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入血液和淋巴中，導(dǎo)致機體血清CEA出現(xiàn)異常上升。而患者機體腫瘤的分期與CEA水平高低相一致，這就為腫瘤的診斷與病情預(yù)判提供了價值。通常，腫瘤分期越晚或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等情況，血清CEA檢測的敏感度就越高?；颊呶赴┑念A(yù)后、進(jìn)展以及分化程度與血清CEA水平密切相關(guān)，同時其也和腫瘤大小、轉(zhuǎn)移以及浸潤情況緊密相關(guān)，故可以結(jié)合其他指標(biāo)來預(yù)估胃癌患者的放化療治療效果。若血清CEA水平降幅大于50%，抑或低于正常水平且維持時間大于4周，可以認(rèn)為治療是有效的；若出現(xiàn)治療后CEA水平持續(xù)上升，則表明預(yù)后效果不良。

進(jìn)一步分析顯示，胃癌患者血清miRNA-203相對表達(dá)量為(0.26±0.16)U/mL，明顯低于健康人群；TSGF、CEA表達(dá)水平及陽性率明顯高于健康人群。這也表明以上3種TM對于診斷胃癌有較高的特異度與敏感度，在臨床檢測中有較高的指導(dǎo)價值[17]。進(jìn)一步揭示聯(lián)合以上指標(biāo)檢測可顯著提高胃癌診斷準(zhǔn)確度，也顯示多種TM聯(lián)合檢測具有互補性，可彌補單項TM診斷存在陽性率降低的缺點，為胃癌診斷與預(yù)后提供指導(dǎo)價值。

綜上所述，采用miRNA-203聯(lián)合TSGF、CEA檢測，可以及時、準(zhǔn)確診斷胃癌，具有較高的特異度與診斷符合率，在臨床上有較高的診斷價值。

[1]步召德，季加孚，曾紅梅.早期胃癌診斷及治療爭議性問題淺議[J].中國普通外科雜志，2015，24(10)：1351-1353.

[2]WANG G,QIN Y,ZHANG J,et al.Nipple discharge of CA15-3,CA125,CEA and TSGF as a new biomarker panel for breast cancer[J].Int J Mol Sci,2014,15(6):9546-9565.

[3]趙連爽，云科，董西華．胃癌患者血清中CA72-4、CEA和CA19-9水平及其與病理特征的相關(guān)性[J]．中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，43(3)：259-262．

[4]馬玉，馬雅靜，李旭哲，等.健康體檢人群腫瘤標(biāo)志物的異常狀態(tài):分子水平腫瘤早期篩查的臨床意義[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志，2017，33(1)：12-17.

[5]龐再林，白鍊，溫澤霖，等．兩種方法沖洗胃癌腹腔網(wǎng)膜囊囊壁組織的病理診斷檢出率對比[J]．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2014，36(14)：1515-1518．

[6]梁佳，董稚明，李宏，等．MicroRNA-203在人食管鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及其基因的甲基化狀態(tài)[J]．中國腫瘤生物治療雜志，2014，21(4)：376-382．

[7]CHEN Y,GAO S G,CHEN J M,et al.Serum CA242,CA199,CA125,CEA,and TSGF are biomarkers for the Efficacy and prognosis of cryoablation in pancreatic cancer patients[J].Cell Biochem Biophys,2014,71(3):1287-1291.

[8]謝海濤．腫瘤標(biāo)志物CA724、CA199、CA242、CEA聯(lián)合檢測在老年胃癌診斷中的應(yīng)用[J]．中國老年學(xué)雜志，2017，37(1)：127-129．

[9]蔣顯勇，易艷軍，梁莊嚴(yán)，等．血清HER-2/neu、TPS、CA15-3和TSGF聯(lián)合檢測在乳腺癌診斷中的價值[J]．實用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32(24)：4115-4117．

[10]ARNER P,KULYT A.MicroRNA regulatory networks in human adipose tissue and obesity[J].Nat Rev Endocrinol,2015,11(5):276-288.

[11]宋雅琴，溫旺榮.胃癌患者血清miR-101與miR-25的動態(tài)變化及其診斷價值[J].暨南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版)，2016，37(3)：259-266.

[12]張志棟，李勇，檀碧波，等．胃癌患者癌組織膜聯(lián)蛋白A2的表達(dá)與血清膜聯(lián)蛋白A2及癌胚抗原水平測定[J]．鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2016，51(1)：76-79．

[13]ZHAO F L,DOU Y C,WANG X F,et al.Serum microRNA-195 is down-regulated in breast cancer:a potential marker for the diagnosis of breast cancer[J].Mol Biol Rep,2014,41(9):5913-5922.

[14]程鵬．胃癌診斷中腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9、CA125的水平變化及臨床意義[J]．中國老年學(xué)雜志，2014，34(20)：5679-5681．

[15]覃仕鋒．血清腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測在老年食管癌早期診斷中的價值[J]．中國老年學(xué)雜志，2014，34(4)：930-931．

[16]YIN L K,SUN X Q,MOU D Z.Value of combined detection of serum CEA,CA72-4,CA19-9 and TSGF in the diagnosis of gastric cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev,2015,16(9):3867-3870.

[17]MACHA M A,SESHACHARYULU P,KRISHN S R,et al.MicroRNAs(miRNAs) as biomarker(s) for prognosis and diagnosis of gastrointestinal(GI) cancers[J].Curr Pharm Des,2014,20(33):5287-5297.