VEGF、TNF-α、miR-18a和MCM7在子宮肌瘤組織中的表達(dá)及臨床意義

張冬紅，劉恩令

(河北省唐山市工人醫(yī)院婦產(chǎn)科 063000)

子宮肌瘤為女性生殖系統(tǒng)常見的一種良性腫瘤，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)疼痛、盆腔壓迫癥狀以及子宮異常出血等，對患者生育能力造成一定影響，且部分患者如不及時治療可能會發(fā)生惡性病變[1]。了解子宮肌瘤發(fā)病原因及機(jī)制有助于更好地治療本病，不過目前尚未完全清楚子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制。微小染色體維持蛋白(MCM)已被證實(shí)為機(jī)體的一種DNA復(fù)制管制復(fù)合物，MCM7為MCM家族重要成員，在多種疾病中呈高表達(dá)[2]。微小核糖核酸(miRNA)為廣泛存在于真核生物細(xì)胞中非編碼單鏈性的小分子RNA，在激素依賴性疾病、腫瘤以及自身免疫性疾病發(fā)生和發(fā)展中起到了重要作用[3]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是促血管生成因子的一種，在子宮肌瘤患者中其血清水平明顯升高[4]。同時，子宮肌瘤與炎癥有密切關(guān)系，炎癥細(xì)胞浸潤可能在子宮肌瘤發(fā)病中起到了重要促進(jìn)作用[5]。本研究分析了VEGF、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、微小核糖核酸-18a(miR-18a)和MCM7在子宮肌瘤組織中的表達(dá)及臨床意義，旨在為子宮肌瘤防治提供新的線索與依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2015年1月至2017年6月收治的43例行子宮肌瘤切除術(shù)患者的手術(shù)切除標(biāo)本作為子宮肌瘤組織，距離子宮肌瘤至少1 cm處取子宮肌層組織作為正常子宮肌層組織?；颊呷脒x標(biāo)準(zhǔn)：(1)均行子宮肌瘤切除術(shù)；(2)均經(jīng)病理學(xué)診斷為子宮肌瘤；(3)年齡在50歲以上；(4)絕經(jīng)至少1年。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入組前3個月使用過激素類藥物者；(2)伴有惡性腫瘤者；(3)合并甲狀腺疾病、糖尿病者；(4)合并子宮其他器質(zhì)性病變者；(5)合并免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病者。43例患者年齡52～78歲，平均(67.32±5.29)歲；肌瘤直徑3～14 cm，平均(7.89±2.06)cm；肌瘤數(shù)目1～5個，平均(1.83±0.45)個；肌瘤分型：漿膜下肌瘤11例，肌壁間肌瘤23例，混合型肌瘤9例。

1.2主要試劑 VEGF、TNF-α、MCM7抗體均購自英國Abcam公司，Has-miR-18a miRCURY LNA Detection probe以及地高辛標(biāo)記LNA miR-18a均購自丹麥Exiqon公司，抗原修復(fù)液、二氨基聯(lián)苯胺酶底物顯色試劑盒、SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒、Tris-HCl緩沖鹽溶液、二氨基聯(lián)苯胺、磷酸鹽緩沖液均購自大連寶生物公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集及處理 以子宮肌瘤中心和肌瘤邊緣連線的中間處選取直徑2～10 cm的子宮肌瘤組織，距離子宮肌瘤至少1 cm處取子宮肌層組織，大小為1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm；標(biāo)本采集完成之后，立即放置于10%中性甲醛溶液中內(nèi)固定12～24 h，采取石蠟包埋法并連續(xù)切片，切片厚度為3～4 μm。

1.3.2miR-18a表達(dá)測定 通過原位雜交法測定miR-18a表達(dá)情況，將石蠟包埋組織石蠟并水化，取檸檬酸鹽抗原進(jìn)行修復(fù)，溫度為49.5 ℃，取雜交緩沖液進(jìn)行預(yù)雜交，時間為2 h，然后加入地高辛標(biāo)記的miRCURY probes過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，水平為1∶200，孵育過夜，溫度為4 ℃。取Tris-HCl緩沖鹽溶液進(jìn)行沖洗，在暗室中加入染色溶液，然后孵育24 h。達(dá)到預(yù)期亮度后將載玻片轉(zhuǎn)移至終止液終止反應(yīng)，進(jìn)行蘇木復(fù)染。

1.3.3VEGF、TNF-α、MCM7、孕激素受體(PR)、雌激素受體(ER)測定 取二甲苯將石蠟包埋、切片、脫蠟至去離子化，取乙二胺四乙酸修復(fù)緩沖液進(jìn)行修復(fù)，然后打孔劑洗滌，采用3%過氧化氫進(jìn)行室溫孵育，時間為10 min，取磷酸鹽緩沖液洗滌，再分別滴加一抗，孵育過夜，溫度為4 ℃。再次取磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌，滴加二抗，孵育30 min，溫度37 ℃。磷酸鹽緩沖液洗滌后采用二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行顯色，然后沖洗，取蘇木素進(jìn)行復(fù)染，采用洗潔精、梯度乙醇及中性樹膠分別進(jìn)行洗片、脫水及封片。

1.3.4表達(dá)結(jié)果評價 按照陽性細(xì)胞的比例進(jìn)行結(jié)果判定，不染色或者陽性細(xì)胞比例在5%以下為陰性(-)；陽性細(xì)胞比例在10%～25%為弱陽性(+)；陽性細(xì)胞比例在>25%～50%為中等陽性(++)；陽性細(xì)胞比例在>50%，且染色分布呈彌散表現(xiàn)為強(qiáng)陽性(+++)。

2 結(jié) 果

2.1不同子宮組織各指標(biāo)陽性表達(dá)結(jié)果比較 子宮肌瘤組織VEGF、TNF-α、MCM7、PR、ER陽性率分別為74.42%、62.79%、67.44%、79.07%和72.09%，均明顯高于正常子宮肌層組織(P<0.05)；miR-18a陽性率為30.23%，明顯低于正常子宮肌層組織(P<0.05)。見表1。

表1 不同子宮組織各指標(biāo)陽性表達(dá)結(jié)果比較[n(%)]

2.2PR水平與VEGF、TNF-α、MCM7、miR-18a在子宮肌瘤組織中的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，PR水平與VEGF、TNF-α、MCM7均呈正相關(guān)(P<0.05)，與miR-18a呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表2。

2.3ER水平與VEGF、TNF-α、MCM7、miR-18a在子宮肌瘤組織中的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，ER水平與VEGF、TNF-α、MCM7均呈正相關(guān)(P<0.05)，與miR-18a呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表2 PR水平與VEGF、TNF-α、MCM7、miR-18a在子宮肌瘤組織中的相關(guān)性(n)

表3 ER水平與VEGF、TNF-α、MCM7、miR-18a在子宮肌瘤組織中的相關(guān)性(n)

2.4不同病例特征間VEGF、TNF-α、MCM7、PR、ER陽性率比較 肌瘤直徑>8 cm、肌瘤數(shù)目>3個的VEGF、TNF-α、MCM7陽性率明顯高于肌瘤直徑≤8 cm、肌瘤數(shù)目≤3個的陽性率；肌瘤直徑>8 cm、肌瘤數(shù)目>3個的miR-18a陽性率明顯低于肌瘤直徑≤8 cm、肌瘤數(shù)目≤3個的陽性率，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡、肌瘤分型的VEGF、TNF-α、MCM7、PR、ER陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同病例特征間VEGF、TNF-α、MCM7、PR、ER陽性率比較[n(%)]

注：組內(nèi)指標(biāo)比較，aP<0.05

3 討 論

子宮肌瘤發(fā)生及發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果，病因尚未完全明確。目前臨床相關(guān)研究顯示，該病屬于甾體激素依賴性疾病，與細(xì)胞因子、基因、遺傳、細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑異常，以及細(xì)胞增殖和凋亡等多種因素相關(guān)[6-7]。文獻(xiàn)[8]報道，孕激素可以促進(jìn)子宮肌瘤生長。孕激素和雌激素分別通過PR、ER發(fā)揮作用，由于PR、ER與孕激素和雌激素親和力較高，能夠選擇性保留高水平的孕激素和雌激素，進(jìn)而增強(qiáng)了生物學(xué)作用。本研究結(jié)果顯示，子宮肌瘤組織PR、ER陽性率分別為79.07%和72.09%，明顯高于正常子宮肌層組織，這與臨床研究結(jié)果一致[9]，提示在子宮肌瘤的發(fā)展當(dāng)中PR、ER發(fā)揮了重要作用。

VEGF屬于糖基化多肽分泌因子的一種，由2個相同亞基以二硫鍵交聯(lián)結(jié)合的形式組成。VEGF能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，增加機(jī)體血管的通透性，促進(jìn)血管生成，在多種良惡性腫瘤新血管生成、血管重塑等過程中起到了重要作用[10]。本研究結(jié)果顯示，在子宮肌瘤組織中VEGF陽性率為74.42%，明顯高于正常子宮肌層組織的39.53%，這與高英芳等[11]的研究結(jié)果一致。本研究亦發(fā)現(xiàn)，在子宮肌瘤組織中VEGF表達(dá)水平與PR、ER表達(dá)呈正相關(guān)。孕激素與雌激素可以通過VEGF受體對多種和細(xì)胞增殖有關(guān)的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，在子宮肌瘤新生血管以及內(nèi)皮增生局部因子當(dāng)中，VEGF的表達(dá)較強(qiáng)，而且VEGF提高了血管的通透性，這為多種細(xì)胞遷移提供了有利的纖維網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而促進(jìn)了肌瘤的發(fā)展[12]。

TNF-α屬于促炎因子的一種，能夠促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥因子，進(jìn)而誘發(fā)炎性反應(yīng)。吞噬細(xì)胞在活化之后可以分泌大量的TNF-α，從而加劇了局部平滑肌組織的損傷，進(jìn)而形成了炎癥病理損傷。同時，TNF-α還能夠通過對VEGF表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而間接發(fā)揮促進(jìn)血管形成的作用[13]。唐恩燕等[5]的研究指出，在子宮肌瘤組織中TNF-α表達(dá)量明顯高于正常子宮肌層組織，這可能與炎癥產(chǎn)物對單核吞噬細(xì)胞進(jìn)行刺激，進(jìn)而導(dǎo)致TNF-α分泌量增加，以及子宮肌瘤細(xì)胞自身分泌TNF-α等有關(guān)。本研究結(jié)果與以上研究一致，子宮肌瘤組織中TNF-α陽性率為62.79%，明顯高于子宮肌層組織的25.58%，同時TNF-α表達(dá)水平與PR、ER亦呈顯著正相關(guān)。

miRNA被包裹在凋亡小體、微小體或者外泌體之中，它們與血漿中小分子物質(zhì)在化學(xué)修飾作用下形成囊泡及蛋白復(fù)合體，而膜性結(jié)構(gòu)可避免miRNA在機(jī)體內(nèi)被降解，形成的復(fù)合物進(jìn)入機(jī)體后被轉(zhuǎn)運(yùn)至受體細(xì)胞，然后通過內(nèi)吞、膜融合、受體結(jié)合等方式發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[14]。近年來，隨著臨床基因組學(xué)研究逐步深入，人們對于miRNA與肌瘤的關(guān)系有了全新的認(rèn)識，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，子宮肌瘤與miRNA有著密切關(guān)系，多種miRNA如miR-21、miR-197、miR-29b以及l(fā)et-7等在子宮肌瘤組織中出現(xiàn)明顯的異常表達(dá)現(xiàn)象，它們通過作用于不同的靶基因，進(jìn)而在子宮肌瘤發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15]。ER包括兩種亞型，分別為ERα和ERβ。在廖治等[16]的研究中指出，miR-18a表達(dá)降低，而ERα表達(dá)升高，二者呈負(fù)相關(guān)，并指出miR-18a的靶基因可能為ERα。本研究結(jié)果顯示，子宮肌瘤組織中miR-18a陽性率為30.23%，明顯低于子宮肌層組織的83.72%，且與PR、ER表達(dá)均呈明顯負(fù)相關(guān)。其表達(dá)失調(diào)可能促進(jìn)了子宮肌瘤細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)了子宮肌瘤進(jìn)展。

腫瘤與細(xì)胞周期之間有著密切關(guān)系，細(xì)胞周期和DNA復(fù)制調(diào)控有關(guān)。MCM為一組與細(xì)胞增殖和DNA復(fù)制有關(guān)的蛋白家族，在基因組、染色體重構(gòu)及DNA復(fù)制中起到了重要作用。在細(xì)胞中MCM蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)周期性的表現(xiàn)，當(dāng)處于G1/S轉(zhuǎn)換時MCM蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值，而當(dāng)細(xì)胞G0期或者分化期時，MCM蛋白表達(dá)量明顯降低，甚至不表達(dá)。因此，MCM蛋白可以作為細(xì)胞增生狀態(tài)評估的一個重要特異性標(biāo)志物[17]。MCM7是MCM家族重要成員，在確保DNA復(fù)制起始過程穩(wěn)定中起重要作用，能夠保證在一個周期之中DNA復(fù)制僅有1次，因此MCM7表達(dá)水平提高說明細(xì)胞增生、增殖明顯進(jìn)展[18]。本研究中，子宮肌瘤組織MCM7陽性率為67.44%，明顯高于的瘤旁組織的16.28%，而且與PR、ER高表達(dá)相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在子宮肌瘤組織中，肌瘤直徑>8 cm、肌瘤數(shù)目>3個的VEGF、TNF-α、MCM7陽性率明顯高于肌瘤直徑≤8 cm、肌瘤數(shù)目≤3個的陽性率，而miR-18a陽性率明顯低于肌瘤直徑≤8 cm、肌瘤數(shù)目≤3個的陽性率，可見不同肌瘤大小、數(shù)目之間VEGF、TNF-α、MCM7、miR-18a陽性率存在明顯差異。隨著腫瘤大小增加，以及腫瘤數(shù)目增多，VEGF、TNF-α、MCM7陽性率逐漸升高，而miR-18a陽性率逐漸降低，提示VEGF、TNF-α、MCM7高表達(dá)及miR-18a低表達(dá)與子宮肌瘤發(fā)生及發(fā)展可能存在密切關(guān)系。

綜上所述，在子宮肌瘤組織中VEGF、TNF-α、MCM7均呈高表達(dá)，miR-18a呈低表達(dá)，其異常表達(dá)與子宮肌瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。VEGF、TNF-α、MCM7、miR-18a異常表達(dá)可以篩檢子宮肌瘤的高危人群。不過本研究的樣本量偏少，應(yīng)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。

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