實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)流感嗜血桿菌感染實(shí)驗(yàn)室診斷方法的建立

蔚 然，王良玉，高 琦，胡文娟，竇海偉，向 莉，辛德莉，郭東星△

(1．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院/北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所,北京100050 ；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院，北京100050)

流感嗜血桿菌(Hi)為革蘭陰性菌，是人類呼吸道黏膜的常見定植細(xì)菌。流行病學(xué)調(diào)查顯示北京地區(qū)5歲以下急性呼吸道感染患兒2000-2002年呼吸道Hi攜帶率為26.1%，隨著疫苗的應(yīng)用Hi攜帶率有所下降，但2010-2012年仍高達(dá)16.3%[1]。Hi是兒童時(shí)期細(xì)菌性腦膜炎、肺炎和菌血癥的重要病原菌之一，還可導(dǎo)致兒童中耳炎、上頜竇炎、急性會(huì)厭炎、化膿性關(guān)節(jié)炎和眼內(nèi)炎等[2]，給兒童健康造成很大威脅。由于Hi毒力較強(qiáng)，病情變化快，其導(dǎo)致的小兒肺炎屬于較嚴(yán)重的一種類型，病死率沒有得到有效控制，各地的診治方法也無(wú)標(biāo)準(zhǔn)，常有漏診、誤診情況[3]。Hi的早期、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)，對(duì)疾病的早期治療、疾病的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后起到非常重要的作用?，F(xiàn)有診斷方法，如分離培養(yǎng)、血清學(xué)診斷等不能滿足臨床需要，需不斷探索早期、快速診斷Hi感染的新方法。近年來(lái)，分子生物學(xué)診斷正逐漸成為研究的熱點(diǎn)。本研究擬建立一種SYBR-Green染料法實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)Hi感染的方法，以期實(shí)現(xiàn)Hi的臨床早期、快速、準(zhǔn)確診斷?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 采集2014年9-12月就診于北京兒童醫(yī)院的患兒咽拭子標(biāo)本226份。本研究通過倫理審查，患兒家屬均知情同意。菌株：肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株M129菌株(ATCC29342)、人型支原體標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC15488)、陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC700323)、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25922)、肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC1705)和大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25922)，含有Hi fucK基因質(zhì)粒的大腸埃希菌凍存于本研究室。

1.2儀器與試劑 ABI公司Prism@7500型熒光定量PCR儀；高純度質(zhì)粒小提試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號(hào)CW0500S，生產(chǎn)批號(hào)20121)；通用型柱式基因組提取試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號(hào)CW2298S，生產(chǎn)批號(hào)40137)；PCR熒光染料為ULtra SYBR Mixture(康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號(hào)CW2601M，生產(chǎn)批號(hào)10209)。

1.3方法

1.3.1構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品 復(fù)蘇凍存于-80 ℃冰箱的含有Hi fucK基因的大腸埃希菌，構(gòu)建質(zhì)粒，采用康為世紀(jì)高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)操作參考產(chǎn)品說(shuō)明書。對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行定量分析，10倍稀釋構(gòu)建水平為108、107、106、105、104、103、102、10 copy/μL的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2設(shè)計(jì)并合成引物 針對(duì)Hi的fucK基因設(shè)計(jì)引物Hi-F/Hi-R，引物序列Hi-F：ATGGCGGGAACATCAATGA；Hi-R：ACGCATAGGAGGGAAATGGTT。引物由美國(guó)Invitrogen公司合成，經(jīng)HPLC方式純化。

1.3.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 以標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行染料法熒光定量PCR，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×Taqman緩沖液10 μL，引物Hi-F/Hi-R各0.3 μL， DNA 模板2.0 μL，ddH2O 8.0 μL，總體積20.0 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用ABI公司7500型熒光定量PCR儀的SDS軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4方法學(xué)驗(yàn)證 (1)敏感度：將構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為107、106、105、104、103、102、10 copy/μL，采用和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，檢測(cè)新建的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感度。(2)特異度：以本實(shí)驗(yàn)室保存的肺炎支原體、人型支原體、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的DNA作為檢測(cè)模板，驗(yàn)證新建的實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異度。(3)檢驗(yàn)臨床標(biāo)本：采集的226份兒科患兒的咽拭子標(biāo)本，均采用通用型柱式基因組提取試劑盒提取DNA，實(shí)驗(yàn)操作參考產(chǎn)品說(shuō)明書。用新建的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Hi的感染情況，反應(yīng)體系和條件均參照構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)采用的體系和條件。根據(jù)標(biāo)本擴(kuò)增的Ct值≤38、Tm值與標(biāo)準(zhǔn)品相符，且結(jié)合擴(kuò)增曲線、溶解曲線，判定為陰陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線 10倍梯度稀釋用標(biāo)準(zhǔn)株提取的質(zhì)粒，108、107、106、105、104、103、102、10 copy/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，用Hi-F/Hi-R引物分別擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品水平為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，采用SDS軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=-3.335 976X+35.492 149(R2=0.999)；模板量與Ct值具有良好的相關(guān)性，能夠?qū)δ０宥?。見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2敏感度 10倍梯度稀釋用標(biāo)準(zhǔn)株提取的質(zhì)粒，108、107、106、105、104、103、102、10 copy/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，用Hi-F/Hi-R引物分別擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品，檢驗(yàn)新建熒光定量PCR的敏感度。新建實(shí)時(shí)熒光定量PCR可檢測(cè)拷貝數(shù)為10 copy的基因模板。見圖2。

注：108、107、106、105、104、103、102、10分別代表標(biāo)準(zhǔn)品模板拷貝量

圖2標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

2.3特異度 大腸埃希菌、陰溝腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎支原體、肺炎克雷伯菌和人型支原體標(biāo)準(zhǔn)株的DNA作為檢測(cè)模板，驗(yàn)證新建實(shí)驗(yàn)室診斷方法的特異度。結(jié)果顯示以上幾種病原體DNA均為陰性，新建實(shí)驗(yàn)室診斷方法具有良好的特異度。見圖3。

注：A為Hi標(biāo)準(zhǔn)品；B為陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株；C為大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株；D為肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)品；E為金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)品；F為人型支原體標(biāo)準(zhǔn)品；G為肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株

圖3 Hi的標(biāo)準(zhǔn)品與其他菌株標(biāo)準(zhǔn)株的溶解曲線

2.4臨床標(biāo)本檢測(cè) 用新建實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)臨床標(biāo)本提取的DNA，結(jié)果顯示，226份咽拭子標(biāo)本Ct值≤38，Tm值與標(biāo)準(zhǔn)品相符；結(jié)合擴(kuò)增曲線、溶解曲線，判定為陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為40.70%。PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序(由生工生物工程股份有限公司完成)并與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)已發(fā)布的Hi菌株的基因序列比對(duì)，陽(yáng)性率為92.3%。見圖4。

注：A為溶解曲線；B為擴(kuò)增曲線

圖4臨床標(biāo)本、Hi標(biāo)準(zhǔn)品的溶解曲線與擴(kuò)增曲線

3 討 論

有研究報(bào)道，綜合192個(gè)國(guó)家的流行病學(xué)調(diào)查顯示，肺炎仍是導(dǎo)致兒童死亡的首要病因，其中由Hi引起的死亡占16.0%，我國(guó)由Hi感染引起的死亡占21.2%，高于世界平均水平[4-5]?？赡苡捎贖i感染的臨床表現(xiàn)及胸部X線征象缺乏特異性，診斷Hi感染往往需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷方法[6]。對(duì)Hi感染的早期、快速、準(zhǔn)確診斷對(duì)指導(dǎo)臨床合理規(guī)范用藥至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)被認(rèn)為是診斷Hi感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)所需時(shí)間較長(zhǎng)(36～72 h)，難以實(shí)現(xiàn)快速鑒定[7]，對(duì)臨床早期診斷的意義不大。該方法受培養(yǎng)條件、標(biāo)本保存與運(yùn)輸、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件等諸多因素影響。有報(bào)道稱，經(jīng)改良培養(yǎng)基后，Hi分離率有所提高，也僅為59.9%[8-9]。血清學(xué)診斷方法主要通過檢測(cè)血清中的特異性抗原、抗體滴度的變化等判斷病原體感染，有研究報(bào)道其敏感度高于分離培養(yǎng)[10]。但血清抗體產(chǎn)生需4～5 d,不能進(jìn)行快速檢測(cè)，且容易產(chǎn)生假陰性。因此，血清學(xué)診斷方法常用于回顧性診斷，不建議作為確診依據(jù)[11-12]。

分子生物學(xué)診斷技術(shù)自1990年首次用于Hi的鑒定后，因其快速、敏感、特異、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前已報(bào)道的分子生物學(xué)診斷Hi感染的方法有傳統(tǒng)PCR、巢式PCR、多重PCR、高分辨率溶解曲線等[13]。NAKHJAVANI等[14]將PCR用于Hi的檢測(cè)，并與常規(guī)培養(yǎng)法和血清學(xué)方法比較,PCR使檢出率明顯提高。理論上認(rèn)為實(shí)時(shí)定量PCR較傳統(tǒng)PCR更敏感，并可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，實(shí)驗(yàn)過程中即可判斷結(jié)果。實(shí)時(shí)定量PCR較巢式PCR，可以減少核酸污染問題，操作更簡(jiǎn)便。實(shí)時(shí)定量PCR相較于多重PCR，用時(shí)更短，實(shí)驗(yàn)條件更易優(yōu)化，敏感度更高。有研究顯示，以實(shí)時(shí)定量PCR為參考標(biāo)準(zhǔn)，多重PCR的敏感度、特異度分別僅為30.0%、75.0%[15]。

COUGHLAN等[16]研究證實(shí)，fucK基因是目前發(fā)現(xiàn)的Hi特異度、敏感度最高，應(yīng)用最廣的基因。本研究針對(duì)Hi的fucK基因設(shè)計(jì)引物，保障引物設(shè)計(jì)的合理性、可行性。相對(duì)于探針法，染料法不需要設(shè)計(jì)特異性探針，成本更低，更簡(jiǎn)單。熒光定量PCR相對(duì)于常規(guī)分離培養(yǎng)和血清學(xué)診斷更加快速、簡(jiǎn)易。本方法可檢測(cè)Hi基因拷貝數(shù)為10 copy的樣品，相較于商品試劑盒[17]，其具有較高的敏感度，且成本較低。采用幾種不同常見細(xì)菌DNA標(biāo)本，驗(yàn)證其特異度，本實(shí)驗(yàn)中幾種病原不存在交叉反應(yīng)，具有良好的特異度。但所選用的特異性實(shí)驗(yàn)菌種較為有限，在后續(xù)研究中，還應(yīng)選擇更多的菌種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)其特異度進(jìn)一步的驗(yàn)證。完善和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后，226份臨床標(biāo)本檢出Hi陽(yáng)性92份，陽(yáng)性率為40.70%。其PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序與NCBI已發(fā)布的HI菌株的基因序列比對(duì)，準(zhǔn)確率為92.3%。

綜上所述，本研究中建立的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Hi的實(shí)驗(yàn)室診斷方法具有早期、快速、簡(jiǎn)便、靈敏的優(yōu)勢(shì)，是Hi感染臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、混合感染判定的可行手段，具有較高的推廣應(yīng)用價(jià)值。

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