IL-8在子癇前期患者血清及胎盤中的表達及意義

郝彥蘭 毛東偉 郭瑞軍 郝秋亞

子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠期婦女特有疾病，也是造成孕產婦和圍生兒發(fā)病和死亡的主要原因之一，嚴重威脅母嬰健康[1]，其但病因及發(fā)病機制尚未明確。近年來隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，細胞因子作為重要的炎癥介質和免疫調節(jié)因子在子癇前期的發(fā)生發(fā)展中起著越來越廣泛的生物學作用[2]。Sharma等研究表明白介素-6 (interleukin-6,IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 作為炎癥與內皮細胞損傷標志與妊娠期高血壓疾病的關系密切相關[3-4]，另有研究也發(fā)現(xiàn)IL-8及C-反應蛋白(C-reactive protein ，CRP)的表達水平在子癇前期孕婦中明顯升高[5]。這些研究的發(fā)現(xiàn)為IL-8在胎盤血管病的炎性應答中所起的作用提供了很好的依據(jù)。本研究通過檢測白介素-8在子癇前期患者血清及胎盤組織中的表達情況，探討其與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展及疾病的嚴重程度的關系。

對象與方法

1.對象：選取于2014年10月—2015年12月，在我院產科分娩的子癇前期患者，孕婦年齡約在20～42歲，平均(29.3±3.7)歲。孕周34～40周，平均(37.2±3.2)周。并根據(jù)病情分為子癇前期組(輕度20例、重度40例)，選擇無并發(fā)癥足月妊娠的孕婦20例為正常妊娠組，孕婦年齡18～36歲，平均(28.15±3.2)歲；孕周37～41周，平均(38.5±1.0)周，各組孕婦年齡以及分娩時孕周比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。所有孕婦既往均無心、肝、腎疾病及高血壓病史，無其他產科并發(fā)癥，均以社會因素剖宮產終止妊娠。子癇前期的診斷標準及分類按照謝幸主編的第8版《婦產科學》[6]。

2.標本處理和檢測

(1)標本的獲取及儲存：子癇前期組在未治療前及正常妊娠組產前均抽取靜脈血3 mL,靜置30 min，以 3000 r/min離心10 min,分離血清，-80 ℃保存待測。

(2)血清IL-8檢測：采用 ELISA法測定，試劑盒購自上海博士德生物科技公司，嚴格按照說明書進行相關實驗。

(3)胎盤取材：分娩后取胎盤組織1 cm(應避免鈣化及出血區(qū))，用生理鹽水沖洗后，用中性甲醛固定48小時，然后脫水包埋。

(4)胎盤中IL-8檢測：取各組組織切片,用免疫組織化學的方法分別對IL-8表達進行檢測。 將包埋的石蠟切片經脫蠟、脫苯、水化后進行檸檬酸鈉緩沖液修復抗原，滴3%H2O2甲醇溶液滅活酶，10%正常山羊血清室溫封閉，滴加1：200稀釋IL-8一抗，37℃溫盒孵育2小時。PBS洗掉后分別滴加通用型IgG/HRP二抗，37℃溫盒孵育30分鐘，即用DAB顯色，加DAB顯色液，光鏡下觀察3～8分鐘，自來水沖洗，然后，蘇木素復染，自來水沖洗；酒精梯度脫水，二甲苯脫酒精后，封片鏡檢。結果判定：①按陽性細胞率評分：陽性細胞數(shù)占11%～50%為2分；51%～80%為3分；>80%為4分。②按顯色程度評分：染色弱1分；中等染色2分；強染色3分。將兩種評分標準結合起來分為3級：無論染色強度如何，細胞陽性率<10%為陰性(-)；評分3～5為弱陽性(+)；評分6～7分為強陽性(++)。

結果

1.各組血清中IL-8水平：結果提示IL-8在子癇前期重度組的表達明顯高于正常妊娠組(t=3.48,P<0.01)，而輕度子癇前期組的表達低于重度子癇前期組(t=2.03 ,P<0.05)，由結果推測，子癇前期患者血清中IL-8的濃度明顯升高，且隨著疾病的嚴重程度增加其含量也增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：P<0.01，CON為正常對照組，M-PE為子癇前期輕度，S-PE為子癇前期重度圖1 子癇前期患者與正常對照組血清中IL-8濃度的比較

2.各組胎盤組織中IL-8的表達：免疫組化方法檢測胎盤組織中IL-8的表達結果顯示胎盤組織中均可見IL-8表達,主要表達于細胞質上皮細胞，腺上皮，細胞間質血管內皮細胞和血管周圍間質細胞中。各組IL-8在胎盤組織檢測結果如圖2所示(圖中棕色顆粒為IL-8的陽性表達)，IL-8在輕度子癇前期患者組及重度子癇前期患者組中的陽性表達率分別為80%、87.5%；而在正常對照組中陽性表達率僅有35%。兩組患者與正常對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而輕度子癇前期組與重度子癇前期組差異不顯著(P=0.701)，見表1。

表1 各組胎盤組織切片中IL-8表達的比較n(%)

注:*與對照組比，P<0.05

討論

子癇前期是妊娠期特有的疾病之一，占整個妊娠的3～5%，臨床以血壓升高和蛋白尿為主要表現(xiàn)，隨著病情的進展可引起全身多器官損害、抽搐、腦出血、凝血功能障礙、HELLP綜合癥、昏迷等癥狀，可導致胎兒窘迫、胎兒宮內生長受限、羊水過少、早產等[1]，雖然對子癇前期的研究不斷增多，但其病因及發(fā)病機制仍未明確，隨著PE的發(fā)病率逐步升高及對母嬰越來越嚴重的影響，對于子癇前期的病因及發(fā)病機制的研究仍是目前探究的難題。

子癇前期的基本病理生理變化是血管內皮細胞損傷導致全身小血管痙攣、全身器官血流灌注銳減、局部缺血缺氧等病理變化并發(fā)生氧化應激反應[7],而且很多致病因素都與血管內皮細胞的損傷有關[2]，多數(shù)研究者認為血管內皮細胞損傷可能與母體循環(huán)中的過度炎癥反應和自由基增高及單核細胞、粒細胞的激活有關。隨著研究的不斷深入，越來越多的實驗證據(jù)表明血管內廣泛的過度炎癥反應導致的內皮細胞損傷是子癇前期的病理基礎，而內皮細胞在炎癥過程中可以產生多種致炎性細胞因子，這些細胞因子之間通過復雜的網(wǎng)絡體系，產生級聯(lián)放大反應，共同促進炎癥反應，對機體產生一定損傷。IL-8屬于CXC類趨化因子，與中性粒細胞上的受體結合后，通過Rho和Rac激酶信號通路增強平滑肌細胞收縮，在高血壓的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用[8]。而且國外有報道子癇前期孕婦血清中IL-8的表達增高[5]，提示IL-8的高表達可能與子癇前期血壓升高有關。

IL-8是1987年由Yoshimura[9]首次發(fā)現(xiàn)，其基因定位于4號染色體的q12-21，全長5191 bp，由4個外顯子和3個內含子組成[10]。IL-8在體內具有廣泛的生物活性，可由多種細胞產生，其生物學功能都是由IL-8受體介導的，IL-8主要趨化調節(jié)中性粒細胞、T細胞及嗜堿性細胞，通過細胞的趨化作用，導致組織細胞浸潤，在免疫和炎癥反應中起重要作用，與部分腫瘤和妊娠合并癥(如早產、胎膜早破)的發(fā)生和發(fā)展也密切相關[11-12]。既往實驗顯示高血壓患者中內皮細胞表達IL-8增加[13]；也有研究顯示高血壓患者隨著治療，血壓下降時其血清中IL-8的表達水平也隨之下降[14]，從而說明IL-8在高血壓的發(fā)生、發(fā)展中起著很重要的作用。根據(jù)既往的研究資料[8,13]，IL-8引起血壓升高的機理可能如下：一方面促進中性粒細胞與內皮細胞表達受體結合，從而損傷內皮細胞，使血壓升高，另一方面可使鈣離子內流，增加細胞內鈣離子的含量，平滑肌收縮加強，血管阻力增加，血壓升高。有研究指出胎盤缺血缺氧是導致內皮細胞激活和損傷的主要原因，而缺血缺氧又進一步增加炎癥性細胞因子的表達，炎性因子表達增加又進一步增加內皮細胞的通透性進一步加重內皮細胞的損傷，而內皮細胞損傷和功能障礙也可以引起胎盤缺血缺氧，反復的惡性循環(huán)，最終導致疾病的更深一步的發(fā)展[15]。而子癇前期患者顯著的臨床特征為血壓升高，故IL-8可能通過上述作用使子癇前期患者血壓升高，而血壓升高進一步引起炎癥、內皮細胞損傷、局部缺血等反應，形成惡性循環(huán)，引起全身血管痙攣缺血，進而出現(xiàn)一系列子癇前期或子癇的臨床癥狀。

Moreno-Eytimio等研究發(fā)現(xiàn)重度子癇前期患者血清中炎性因子IL-6、IL-8和TNF-α的表達明顯高于輕度子癇前期和血壓正常的孕婦組，且三個指標中IL-8的變化尤為明顯[16]，這與本實驗結果一致，在子癇前期組患者血清中IL-8的表達明顯高于健康組患者(P<0.01)，且隨著病情加重其表達水平也增高，然而在研究CRP、IL-8、IL-6、IL-10等炎癥性因子引起的早產的實驗中，早產組孕婦血清對IL-8表達的比較沒有發(fā)現(xiàn)顯著的差異，進一步說明IL-8在子癇前期患者中的高表達具有一定的特異性[17]。胎盤作為母兒物質交換的器官，在胎兒生長發(fā)育過程中起著重要作用，正常情況下，胎盤中存在大量的細胞因子，在細胞的生長分化、免疫調節(jié)及炎癥的發(fā)生有重要作用，而本實驗通過免疫組化的方法檢測胎盤中IL-8的表達顯示，IL-8在子癇前期輕度和重度孕婦胎盤中表達的陽性率分別80%、87.5%；而在正常對照組中陽性表達率僅有35%，而且隨著胎盤娩出后孕婦有關子癇前期的臨床癥狀逐漸消失，因此推測子癇前期的發(fā)生與子宮和胎兒關系不大，子癇前期患者的胎盤可能是炎癥性細胞因子IL-8的來源；此外IL-8的強陽性表達在子癇前期輕度和重度患者分別為45%和60%，總的來說，IL-8在胎盤中的表達與子癇前期嚴重程度呈正相關。本實驗結果表明IL-8在子癇前期患者中的表達明顯增高，而且在胎盤及血清中水平變化有一定相關性，推測IL-8在子癇前期的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但具體作用機制尚未能明確。因此，進一步研究IL-8分子基因水平上的作用機制以及胎盤在產生IL-8等炎性細胞因子的過程中的作用，更好地了解胎盤產生炎性因子的具體通徑，使IL-8成為子癇前期臨床檢測指標，通過檢測IL-8的水平及減少其釋放，可能成為預防和治療子癇前期的新路徑。

(圖2)

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