孕期和哺乳期暴露PM2.5對子代小鼠生長發(fā)育的影響及維生素C和槲皮素的干預(yù)研究

張敏佳 劉偉 周雅琳 李雍 馮金秋 范愛琴 許雅君

近年來，中國多次爆發(fā)大面積的霧霾事件，我國許多省份霧霾天氣頻發(fā)。顆粒物污染與霧霾天氣的形成密切相關(guān)。高濃度的細顆粒物(空氣動力學(xué)直徑小于或等于2.5μm 的顆粒物，簡稱PM2.5) 是主要的污染物，同時也是大氣環(huán)境中危害最大的污染物之一[1,2]。PM2.5由于其表面積大，易攜帶大量有毒有害物質(zhì)經(jīng)呼吸道進入人體肺部深處及血液循環(huán)，被認為相對于大的顆粒物來說對人體產(chǎn)生的危害更大[3,4]。PM2.5不僅對呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等產(chǎn)生不良影響，對妊娠及后代的影響也受到國內(nèi)外關(guān)注。已有流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，孕期過量PM2.5 暴露是諸多不良妊娠結(jié)局，包括流產(chǎn)、死產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、低出生體重、早產(chǎn)、出生缺陷等的重要危險因素[5-7]。動物研究也觀察到了PM2.5對后代體重、胚胎發(fā)育的不利影響[8-10]。PM2.5對機體細胞的主要毒性機制之一涉及氧化損傷，因此我們推測，抗氧化活性物質(zhì)可能對于PM2.5的毒性具有一定的拮抗作用。維生素 C(Vitamin C，VC)是一種在臨床上廣泛應(yīng)用的抗氧化劑，研究[11]表明，VC可以清除胞內(nèi)外自由基，有助于體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的穩(wěn)定。槲皮素(quercetin)是植物界分布最廣的黃酮類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜以及一些中草藥中，是人類飲食中最主要的生物類黃酮，研究[12]表明，槲皮素可有效清除自由基，抑制ROS生成酶，并預(yù)防氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。

目前國內(nèi)外的研究中，流行病學(xué)調(diào)查多為PM2.5對妊娠結(jié)局的影響，動物實驗集中于PM2.5對胎鼠的影響，而缺少對后代長期影響的研究，更無膳食干預(yù)方面的研究。本研究建立不同劑量PM2.5染毒的動物模型，研究孕期及哺乳期PM2.5暴露對子代小鼠生長發(fā)育的影響，并選擇VC、槲皮素兩種抗氧化活性物質(zhì)，探索其對PM2.5的這一發(fā)育毒性是否具有改善作用，為PM2.5對人類的發(fā)育毒性提供膳食干預(yù)思路。

材料與方法

一、材料

1. PM2.5采集和制備：采用TH-150C型號智能中流量(TSP)采樣器(天虹智能儀器表廠，武漢)進行PM2.5采集，采樣時間為2016年9月15日—2016年11月14日，采樣地點為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院六層平臺，采樣儀器距離地面15米，采樣流量設(shè)置為0.1 m3/min，顆粒物采集于石英濾膜上，每天采集22 h。石英濾膜在采樣前和采樣后分別恒溫干燥24 h，稱重，4℃避光保存。用滅菌手術(shù)剪將載有顆粒物的石英濾膜剪成1 cm × 4 cm大小后放入潔凈燒杯中，加入超純水，并用保鮮膜封口。水浴超聲震蕩20分鐘，加冰保持水溫在20 ℃以下，重復(fù)三次，收集洗脫液，并用6層滅菌紗布過濾。真空冷凍干燥后，用無菌PBS配制成不同濃度貯備液，-20℃避光保存?？瞻讓φ战M的滴注液直接用干凈的濾膜進行上述洗脫操作。

2.實驗動物與分組：健康成年SPF級雌性ICR小鼠，體重(30±2)g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供[SCXK(京)2015-0015]。動物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境，溫度控制在(22±2)℃，相對濕度50%～60%，晝夜照明時間為12 h:12 h。實驗期間動物自由飲水和進食。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按體重隨機分為6組：空白對照組(A)，PM2.5低、中、高劑量組(B、C、D)，VC干預(yù)組和槲皮素干預(yù)組(E、F)，每組12只。

二、方法

1. 實驗操作：雌鼠隨機分組后，每天晚上18:00將雌鼠與健康性成熟雄鼠1∶1合籠，第2天早上7:00分籠并檢查陰栓，見栓即認為受孕，當(dāng)天定為孕期第0天( gestational day 0，GD 0)。已確定懷孕的雌鼠單籠飼養(yǎng)，并飼喂繁殖期飼料，每天觀察孕鼠有無嗜睡、煩躁、行動不便、陰道流血等異常情況出現(xiàn)。

(1)PM2.5染毒：各組母代小鼠分別于GD3、GD6、GD9、GD12、GD15和哺乳期第5天(lactation day5, LD5)、LD10和LD15日上午，在3%異氟烷短效氣體麻醉下進行氣管滴注，空白對照組給予1 ml/kg干凈石英濾膜洗脫液滴注，其余各組按照1 ml/kg的體積滴注PM2.5溶液，PM2.5低、中、高劑量組分別給予3.75、7.5、15 mg/kg PM2.5溶液，VC和槲皮素干預(yù)組給予15 mg/kg PM2.5溶液。

(2)灌胃：母代小鼠在孕期和哺乳期每日灌胃?？瞻讓φ战M和PM2.5低、中、高劑量組給予0.15%羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃，VC和槲皮素干預(yù)組分別給予100 mg/kg VC或槲皮素灌胃，VC和槲皮素均以0.15% 羧甲基纖維素鈉溶液作為分散系。

2. 動物體重及進食量監(jiān)測：每周監(jiān)測母鼠孕期體重變化值和飼料消耗量，計算食物利用率，母鼠孕期體重變化值(g)=母鼠臨產(chǎn)前體重(g)-母鼠受孕當(dāng)天體重(g)；母鼠孕期食物利用率(×10-2)=母鼠孕期體重變化值(g)/ 母鼠孕期攝食量(g)。各組孕鼠自然分娩，記錄分娩情況，稱量仔鼠體重，計算母鼠孕期凈增重，母鼠孕期凈增重(g)=母鼠孕期體重變化值(g)-仔鼠總體重(g)。子代小鼠出生當(dāng)天記為出生后第0天(postnatal day 0, PND0)，于出生后第4天調(diào)整窩大小，每窩保留6只子代小鼠，雌雄各半。哺乳期間，每周分別以窩為單位記錄雌性、雄性子代小鼠體重，子代小鼠斷乳后，雌雄分籠飼養(yǎng)，每周記錄雌性和雄性子代小鼠的體重、飼料消耗量，并計算食物利用率。

3. 子代生理發(fā)育和神經(jīng)反射指標(biāo)監(jiān)測[13, 14]：母代小鼠分娩后，每天觀察所有子代仔鼠，記錄每窩仔鼠生理發(fā)育指標(biāo)(耳廓分離、門齒萌出、睜眼、睪丸下降和陰道開放)和神經(jīng)反射指標(biāo)(平面翻正、空中翻正、懸崖躲避和負向地性)達標(biāo)的時間。將整窩仔鼠全部完成該生理指標(biāo)發(fā)育的時間確定為該指標(biāo)達標(biāo)時間。所有指標(biāo)均按照統(tǒng)一標(biāo)準由固定人員觀察。

結(jié) 果

一、分娩情況及孕期母代小鼠體重和食物利用率

如表1所示，各組活產(chǎn)只數(shù)、母鼠孕期凈增重、進食量及食物利用率均無顯著差異(P> 0.05)，每只孕鼠約產(chǎn)12～13只活胎。

表1 分娩情況及孕期母代小鼠體重和食物利用率

二、子代小鼠體重變化及食物利用率

子代小鼠體重變化見圖1-a、1-b。出生后第14天，與空白對照組相比，PM2.5高劑量組子代雄性、雌性小鼠平均體重均有不同程度的降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。出生后第4周，與空白對照組相比，PM2.5高劑量組子代雄性小鼠平均體重顯著降低(P<0.05)。與PM2.5高劑量組相比，VC干預(yù)組雌性小鼠平均體重高于PM2.5高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。子代小鼠斷乳后食物利用率見圖2-a、2-b，各組動物食物利用率均無明顯差異(P>0.05)。

三、子代小鼠生理發(fā)育指標(biāo)

子代雄性、雌性小鼠生理發(fā)育指標(biāo)達標(biāo)時間見表2。子代雄性小鼠生理發(fā)育指標(biāo)監(jiān)測結(jié)果與空白對照組相比，PM2.5中、高劑量組門齒萌出(下)和PM2.5高劑量組睪丸下降達標(biāo)時間明顯延遲(P<0.05)。與PM2.5高劑量組相比，槲皮素干預(yù)組門齒萌出(下)達標(biāo)時間有明顯改善(P<0.05)，與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。子代雌性小鼠生理發(fā)育指標(biāo)監(jiān)測結(jié)果與空白對照組相比，PM2.5低、中、高劑量組門齒萌出(上)達標(biāo)時間明顯延遲(P<0.01)，PM2.5中、高劑量組門齒萌出(下)達標(biāo)時間有不同程度的延遲(P<0.05)。

四、子代小鼠神經(jīng)反射指標(biāo)

子代雄性、雌性小鼠神經(jīng)反射指標(biāo)達標(biāo)時間見表3。子代雄性小鼠神經(jīng)反射指標(biāo)監(jiān)測結(jié)果與空白對照組相比，PM2.5高劑量組平面翻正、負向地性、懸崖回避達標(biāo)時間明顯延遲(P<0.05)，PM2.5中劑量組懸崖回避達標(biāo)時間明顯延遲(P<0.05)。與PM2.5高劑量組相比，VC干預(yù)組和槲皮素干預(yù)組平面翻正、懸崖回避達標(biāo)時間均有明顯改善(P<0.05)。子代雌性小鼠神經(jīng)反射指標(biāo)監(jiān)測結(jié)果與空白對照組相比，PM2.5高劑量組負向地性、懸崖回避、空中翻正達標(biāo)時間有不同程度的明顯延遲(P<0.05)，PM2.5中劑量組懸崖回避達標(biāo)時間明顯延遲(P<0.01)。與PM2.5高劑量組相比，VC干預(yù)組懸崖回避、空中翻正達標(biāo)時間均有明顯改善(P<0.01)，槲皮素干預(yù)組懸崖回避、空中翻正達標(biāo)時間均有明顯改善(P<0.05)。

表2 子代雄性、雌性小鼠生理發(fā)育指標(biāo)達標(biāo)時間Table 2 Target time of physiology development in male and female offspring

GroupTargettime(day)Pinnadetachment♂♀Upperincisorseruption♂♀Lowerincisorseruption♂♀eyesopening♂♀Hairgrowth♂♀Testiculardescent/Vaginalopening♂♀A43±0442±04112±05110±02108±05108±03140±05140±0446±0446±04237±12240±08B44±0645±06112±05115±02??109±05110±04143±04143±0447±0548±05245±14245±14C46±0645±05113±04116±05??112±04?112±04?142±06144±0549±0650±05244±13243±09D45±0445±04115±05114±05??113±05?113±06??143±07144±0545±0546±05247±08?246±10E41±0342±03112±03112±03110±04111±02140±05142±0543±0445±04245±07245±08F42±0342±04114±03113±03109±02△111±03144±05144±0644±0647±08242±06246±06

Note：*P<0.05，vs. A；**P<0.01，vs. A；△P<0.05，vs. D.

表3 子代雄性、雌性小鼠神經(jīng)反射指標(biāo)達標(biāo)時間

Note：*P<0.05，vs. A；**P<0.01，vs. A；△P<0.05，vs. D；△△P<0.01，vs. D.

討 論

多哈學(xué)說(Developmental Origins of Health and Disease，DOHaD)強調(diào)了孕期宮內(nèi)環(huán)境對于胎兒長期甚至多代健康的影響[15]，孕期顆粒物暴露的影響可以通過宮內(nèi)壞境和胎盤功能的改變傳遞給胎兒[16]，同時顆粒物中的有些成分可以透過胎盤屏障[17]，影響胎兒的生長發(fā)育。

PM2.5的化學(xué)成分對毒性有顯著影響，已有研究[18]表明，與本研究同一地區(qū)收集的PM2.5富含O，Si，C，F(xiàn)e，Ca，Mg，Al，K等。本研究所用PM2.5制備和染毒方法已在多項研究[8, 19]中被使用，可用來建立PM2.5染毒動物模型。本研究結(jié)果顯示，孕期暴露一定劑量PM2.5對子代小鼠體重、生長發(fā)育指標(biāo)和神經(jīng)反射指標(biāo)產(chǎn)生不良影響，PM2.5與不良影響間未發(fā)現(xiàn)嚴格的劑量反應(yīng)關(guān)系，但結(jié)果顯示PM2.5低、中、高劑量組與空白對照組相比，有統(tǒng)計學(xué)差異的指標(biāo)依次增多，提示隨著PM2.5劑量升高，其對子代的生長發(fā)育影響亦增大。

PM2.5高劑量組出生后第14天及第4周體重下降，提示孕期和哺乳期暴露一定劑量的PM2.5影響子代小鼠的生理發(fā)育。Hougaard[20]等研究產(chǎn)前暴露于柴油機尾氣顆粒的子代小鼠發(fā)現(xiàn)，暴露組子代小鼠PND9～PND22體重增加顯著降低，與本研究吻合。Hougaard[20]等推測這種長期影響可能是由于潛在暴露如污染物通過乳汁傳遞給胎兒、污染物沉積于胎盤緩慢釋放給胎兒等原因?qū)е?，本實驗用到的大氣PM2.5樣品在中國北方大城市非采暖期采集，機動車尾氣是組成此時期大氣PM2.5的主要成分之一[21]，故此研究有一定的參考意義，但PM2.5是否可以通過乳汁和胎盤尚需更多實驗證據(jù)支持。

PM2.5的毒性與其復(fù)雜的成分密切相關(guān)，PM2.5主要由無機成分、有機成分和無機碳等組成，重金屬是其重要的組成部分，容易對人體產(chǎn)生不良影響。呂京等[22]的研究顯示，宮內(nèi)鉛暴露引起子代大鼠門齒萌出指標(biāo)發(fā)育遲緩。劉繼文等[23]研究表明母代大鼠孕前8周低鉛染毒至斷乳，子代大鼠門齒萌出率明顯低于對照組(P<0.05)。王雙青等[24]研究了50對孕婦—新生兒，發(fā)現(xiàn)市區(qū)PM2.5濃度明顯高于郊區(qū)(P<0.01)，市區(qū)新生兒血鉛水平明顯高于郊區(qū)(P<0.05)，大氣PM2.5 濃度對新生兒生長發(fā)育具有抑制作用，推測孕期暴露于高PM2.5濃度環(huán)境可能通過升高新生兒血中鉛水平而抑制新生兒生長發(fā)育。本研究中雄性小鼠中、高劑量組門齒萌出(下)時間延緩，雌性小鼠低、中、高劑量組門齒萌出(上)時間延緩，中、高劑量組門齒萌出(下)時間延緩，推測PM2.5樣品中來源于汽車尾氣中的鉛可能參與了這一作用，具體原因尚需進一步證實。

研究顯示，PM2.5可攜帶多種環(huán)境毒物如微量元素和多環(huán)芳烴(PAHs)等，已有研究[25, 26]表明，在胎兒發(fā)育和產(chǎn)后早期暴露于環(huán)境毒物可導(dǎo)致雄性后代生殖功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，孕期和哺乳期高劑量PM2.5暴露引起雄性后代睪丸下降延遲，PM2.5樣品中攜帶的多環(huán)芳烴類物質(zhì)可能參與了這一損傷作用的形成。

神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展是一個非常復(fù)雜的過程，受遺傳因素和外部因素共同決定，腦結(jié)構(gòu)和功能受損可能產(chǎn)生嚴重和長期的后果，可導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙(neurodevelopmental disorders，NDDs)。胎兒期是神經(jīng)發(fā)育的重要時期，對不良宮內(nèi)環(huán)境的影響非常敏感。已有資料[27-29]顯示孕期暴露于空氣污染影響子代神經(jīng)發(fā)育，主要影響其行為和認知功能。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，孕期和哺乳期暴露一定劑量的PM2.5暴露對后代神經(jīng)反射發(fā)育的多個指標(biāo)有所影響，提示PM2.5的神經(jīng)發(fā)育毒性作用。

此外，實驗結(jié)果顯示，孕期和哺乳期PM2.5暴露對子代雄性、雌性在體重、門齒萌出、生殖器官發(fā)育、平面翻正、空中翻正等指標(biāo)的影響不完全一致，提示PM2.5對子代的影響可能存在性別差異。許多研究[30-32]發(fā)現(xiàn)，空氣污染對后代的影響與性別有關(guān)。這種差異可能是PM2.5中的內(nèi)分泌干擾物與性激素相互作用的結(jié)果，其具體影響及產(chǎn)生差異的機制還需更深入的研究。

目前，PM2.5的發(fā)育毒性作用機制尚未闡明，氧化應(yīng)激反應(yīng)是研究最多的機制，VC和槲皮素是廣泛存在于蔬菜水果中的抗氧化物質(zhì)，我們的實驗結(jié)果提示氧化損傷可能是PM2.5的毒性作用機制之一。馮金秋等[8]研究孕期每三天滴注15 mg/kg PM2.5的小鼠發(fā)現(xiàn)，母鼠血清中抗氧化活性物質(zhì)含量下降，VC干預(yù)組和三個槲皮素干預(yù)組較PM2.5模型組有所改善，印證了這一推測。此外，有研究[33]顯示，孕期暴露PM2.5使母代大鼠胎盤IL-6水平顯著增高(P<0.01)，引起胎盤炎癥，而槲皮素可以抑制炎癥反應(yīng)，下調(diào)IL-6等表達[34]。因此推測，除抗氧化機制外，槲皮素還可能通過抑制炎癥反應(yīng)修復(fù)胎盤炎癥，從而改善PM2.5引起的發(fā)育毒性。

綜上提示，孕期和哺乳期暴露一定劑量的PM2.5可影響子代小鼠生長發(fā)育，在本實驗所用劑量下，VC和槲皮素干預(yù)可在一定程度上改善其不良影響，其機制可能與VC和槲皮素的抗氧化活性有關(guān)，但具體機制及適宜劑量還需進一步研究。空氣污染的治理尚難在短期內(nèi)完成，因此，盡快開展個體干預(yù)措施研究非常重要，我們的研究成果為PM2.5發(fā)育毒性的膳食干預(yù)提供了思路。

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