響應面法優(yōu)化玫瑰茄粗多糖提取工藝及其抗氧化活性的研究

鄭大恒, 王 未, 李 倩, 陳 瑤, 張偉杰, 趙 婷, 仰榴青*

1.紹興文理學院生命科學學院, 浙江 紹興 312000; 2.江蘇大學食品與生物工程學院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 3.江蘇大學環(huán)境與安全工程學院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013;4.江蘇大學化學化工學院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013

玫瑰茄(HibiscussabdariffaL.)為錦葵科木槿屬一年生草本植物，原產(chǎn)于東南亞、南美和非洲等熱帶國家和地區(qū)，目前，我國浙江、福建、云南、廣東、廣西等地已有大面積種植[1,2]。玫瑰茄作為傳統(tǒng)的藥食同源植物，富含多酚、花青素和類黃酮等物質(zhì)，具有降血壓、提高免疫力、防治心腦血管疾病以及抗腫瘤等功效[3～6]。多糖作為一種生物活性成分，近年研究發(fā)現(xiàn)其具有清除體內(nèi)自由基、抗氧化作用[7]。

活性氧自由基如超氧陰離子自由基和羥基自由基，對人體或動物是一種必需物質(zhì)，但過量的自由基可導致DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷，大量證據(jù)表明，人類的許多疾病，如癌癥、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病，都是自由基氧化損傷的結(jié)果[8]。玫瑰茄花萼中也含有多糖，然而關(guān)于玫瑰茄多糖的研究報道卻很少。

響應面分析法(response surface techodology)是利用合理的試驗設(shè)計方案，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析、優(yōu)化工藝參數(shù)預測響應值的一種統(tǒng)計方法。響應面分析法目前已成為降低成本、優(yōu)化加工條件的一種有效方法，廣泛地應用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化學等領(lǐng)域[9]。因此，本文在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以粗多糖得率為考察指標，采用響應面分析法對玫瑰茄粗多糖的提取工藝進行優(yōu)化，并考察了其抗氧化活性，以期為玫瑰茄多糖的進一步研究、開發(fā)和應用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玫瑰茄采自江蘇省丹陽市，經(jīng)鎮(zhèn)江食品藥品監(jiān)督管理局鑒定為錦葵科(Malvaceae)木槿屬(Hibiscus)玫瑰茄(HibiscussabdariffaL.)；恒溫電熱鼓風干燥箱(上海一恒儀器有限公司)；數(shù)控恒溫水浴鍋(常州華冠儀器制造有限公司)；R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士Büchi公司)；UV2501紫外可見光分光光度計(島津儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1原料預處理 取石油醚，將粉碎的玫瑰茄干花萼反復回流脫脂，抽濾，室溫晾干。向脫脂后的玫瑰茄花萼粉末中加入3倍體積的75%乙醇浸泡過夜，以除去黃酮、色素、單糖等小分子物質(zhì)。抽濾，晾干，得到預處理后的玫瑰茄粉末，備用。

1.2.2玫瑰茄粗多糖的提取 采用水提醇沉法提取玫瑰茄粗多糖。稱取預處理后的玫瑰茄粉末5 g，置于圓底燒瓶中，按一定料液比、水浴溫度、浸提時間在熱水浴中回流浸提數(shù)次，冷卻后將所得水提液抽濾，去除雜質(zhì)，合并上清液，上清液經(jīng)減壓濃縮，按張斌濤等[10]的方法除去蛋白后，加入一定量無水乙醇至終濃度為80%，充分攪拌，放入4℃冰箱，靜置12 h，3 000 r/min離心10 min，收集沉淀；蒸餾水復溶，于透析袋中(截留分子量3 500 Da)透析72 h，透析后的樣品經(jīng)冷凍干燥，即得玫瑰茄粗多糖。由以下公式計算多糖得率(Y)：

粗多糖得率(Y)= 粗多糖質(zhì)量(g)/樣品質(zhì)量(g)×100%

1.2.3單因素實驗 ①料液比單因素實驗。設(shè)定固定提取時間為3 h，溫度為90℃，設(shè)計料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30(g/mL)，每組實驗重復3次，確定料液比對玫瑰茄粗多糖得率的影響。②提取時間單因素實驗。 設(shè)定固定料液比為1∶25(g/mL)，提取溫度為90℃，分別提取1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，每組實驗重復3次，確定不同提取時間對玫瑰茄粗多糖得率的影響。③提取溫度單因素實驗。 設(shè)定固定料液比1∶25(g/mL)，提取時間為3 h，分別在60℃、70℃、80℃、90℃和100℃提取，每組實驗重復3次，確定不同提取溫度對玫瑰茄粗多糖得率的影響。

1.2.4響應面法優(yōu)化玫瑰茄粗多糖的提取工藝 根據(jù)Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計原理，綜合單因素實驗結(jié)果，采用3因素3水平響應面分析法對玫瑰茄中粗多糖的提取條件進行優(yōu)化，并對優(yōu)化條件進行驗證。實驗因素和水平見表1。

表1 響應面分析因素及水平表Table 1 Factors and levels used in response surface methodology.

1.2.5玫瑰茄粗多糖清除自由基能力的測定

①對DPPH自由基清除能力的測定。取玫瑰茄粗多糖，分別配制濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6 mg/mL、1.8 mg/mL和2.0 mg/mL的多糖樣品。取不同濃度的多糖樣品1 mL和0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液2 mL，混勻，暗處反應30 min，于517 nm處測定吸光度值(Ai)，用蒸餾水替代樣品測得的吸光度值作為A0，用乙醇替代DPPH-乙醇溶液測得的吸光度值作為Aj，按以下公式計算玫瑰茄粗多糖對DPPH自由基的清除率[11]。同時以抗壞血酸(Vc)作為陽性對照，每個樣品重復3次，求平均值。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

②對羥基自由基清除能力的測定。取9 mmol/L硫酸亞鐵1 mL，加入9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，加入不同濃度(0.2～2.0 mg/mL)的多糖樣品1 mL，加入8.8 mmol/L的H2O21 mL，搖勻，在37℃的恒溫水浴鍋中反應30 min，于波長510 nm處測定吸光光度值(Ai)，用蒸餾水替代樣品測得的吸光度值作為A0，用蒸餾水替代H2O2測得的吸光度值作為Aj，按以下公式計算玫瑰茄粗多糖對羥基自由基的清除率[12]。同時以抗壞血酸(Vc)作為陽性對照，每個樣品重復3次，求平均值。

羥基自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

③對超氧陰離子自由基清除能力的測定。取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)4.5mL，25℃水浴中預熱20 min，分別加入不同濃度(0.2～2.0 mg/mL)的多糖樣品1.0 mL和0.4 mmol/L的鄰苯三酚1.0 mL，混勻后于25℃恒溫水浴鍋中反應5 min，然后立即滴加2滴8 mol/L HCl終止反應，并在波長為325 nm處測定吸光光度值(Ai)，用蒸餾水替代樣品測得的吸光度值作為A0，用蒸餾水替代鄰苯三酚測得的吸光度值作為Aj，按以下公式計算玫瑰茄粗多糖對超氧陰離子自由基的清除率[13]。同時以抗壞血酸(Vc)作為陽性對照，每個樣品重復3次，求平均值。

超氧陰離子自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行分析，單因素方差分析組間差異的顯著性，結(jié)果采用 Mean±SD 表示，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各單因素對玫瑰茄粗多糖得率的影響

2.1.1料液比的影響 圖1為浸提溫度為90℃，浸提時間3 h時，料液比對玫瑰茄粗多糖得率的影響。在料液比低于1∶25時，玫瑰茄粗多糖的得率隨料液比的增大而增加。在料液比為1∶25(g/mL)時多糖得率達到最高值，但料液比超過1∶25(g/mL)后，多糖的得率略有下降。其可能的原因是溶劑水的用量較小時，原料中的多糖不能夠充分轉(zhuǎn)移到水中，造成提取不完全、得率較低，水用量過大時，多糖溶出量已達到飽和，初始加水量過大會使后續(xù)濃縮工序能耗增加，因此最優(yōu)料液比選擇1∶25(g/mL)為宜。

圖1 料液比對粗多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-liqiud ratio on the yield of polysaccharide.

2.1.2提取時間的影響 圖2為料液比1∶25(g/mL)，提取溫度90℃時提取時間對玫瑰茄粗多糖得率的影響。隨著提取時間的延長玫瑰茄粗多糖得率不斷增加，多糖得率在提取時間3 h時達到最大，之后隨著時間的延長得率有所下降，因此，確定提取時間為3 h。

2.1.3提取溫度的影響 圖3為料液比1∶25，提取時間為3 h時，提取溫度對玫瑰茄粗多糖得率的影響。在60～90℃溫度范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，玫瑰茄粗多糖得率逐漸增加，繼續(xù)升溫到100℃，多糖得率略有下降。因此，選擇提取溫度為90℃。

圖2 提取時間對粗多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of polysaccharide.

圖3 提取溫度對粗多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide.

2.2 響應面法優(yōu)化玫瑰茄粗多糖提取工藝

2.2.1響應面試驗設(shè)計結(jié)果及方差分析 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗原理設(shè)計17個實驗，實驗1～12為析因?qū)嶒灒?3～17為中心實驗。采用Design-Expert V 8.0.6軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見表3。

由表3可見，一次項X1、X3和交互項X1X2對玫瑰茄粗多糖的提取得率有顯著影響，一次項X2和二次項X12、X22、X32和交互項X1X3、X2X3對玫瑰茄粗多糖的提取得率影響極顯著，說明實驗因子對響應值不是簡單的線性關(guān)系。

表2 響應面分析因素設(shè)計及實驗結(jié)果Table 2 Response surface design with experimental results.

Y=14.44+0.087X1+0.16X2+0.097X3-0.12X1X2-0.17X1X3-0.54X2X3-0.29X12-0.56X22-0.61X32。

2.2.2響應面圖分析 圖4(彩圖見圖版七)為各個因子交互作用的響應面三維圖和等高線分析圖。等高線圖直觀地反映出各因素交互作用對響應值的影響，圓形表示二因素交互作用不顯著，橢圓表示二因素交互作用顯著[14]。由圖4A、B可知，當提取溫度為90℃時，玫瑰茄粗多糖得率隨料液比和提取時間的變化而變化，其變化幅度和曲線坡度均較大，可見料液比與提取時間兩個因素對多糖得率存在著較強的交互作用。當固定提取時間為3 h時，由圖4C、D可見：提取溫度曲線急劇變化，可見提取溫度對玫瑰茄粗多糖得率的影響較大，同時等高線也呈橢圓形，說明提取溫度和料液比兩個因素間的交互作用也較大。當固定料液比為1∶25時，提取溫度和提取時間兩個因素也存在顯著的交互影響，當溫度從80℃增加至90.04℃時，玫瑰茄粗多糖得率隨之顯著提高，而后當溫度繼續(xù)升高，得率有所下降，這表明玫瑰茄粗多糖得率達到最大值時，溫度為90.04℃(圖4E、F)。

表3 響應面方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance and result.

注:*表示P<0.05水平差異顯著；**表示P<0.01水平差異顯著。

2.3 最優(yōu)提取工藝驗證

通過響應面法預測玫瑰茄粗多糖最優(yōu)的提取工藝條件為最大響應值(Y)時，X1、X2、X3對應的編碼值分別為：A=0.123、B=0.129、C=0.004，與其相對應的多糖的最佳提取條件是：1∶25.62(g/mL)、時間3.13 h、溫度90.04℃，理論最佳提取率是14.46%。考慮到實際情況對上述條件進行修正，最終的優(yōu)化條件調(diào)整為液料比1∶26(g/mL)、提取時間3.1 h、提取溫度90℃，在此條件下進行3次平行實驗驗證，提取得率為14.41%，與理論預測值較接近，說明該響應面法優(yōu)化得到的模型準確可靠，適用于玫瑰茄粗多糖的提取。

2.4 玫瑰茄粗多糖對自由基的清除作用

2.4.1對DPPH自由基的清除作用 DPPH自由基被認為是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若樣品可以將其清除，則表明該樣品具有抗氧化活性。DPPH有單電子，在517 nm有最大吸收，其乙醇溶液呈深紫色，當樣品具有抗氧化活性時，它能與DPPH的單電子配對，從而使DPPH-乙醇溶液顏色變淺，其褪色程度與樣品清除自由基效率呈線性關(guān)系，因而可用此方法評價樣品的抗氧化能力[15]。由圖5可知，玫瑰茄粗多糖對DPPH自由基有一定的清除作用。當多糖濃度從0.2 mg/mL 升到2.0 mg/mL時，隨著多糖濃度的升高，對DPPH的清除作用也逐漸加強，當玫瑰茄粗多糖濃度為2 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率可達到45.89%。

2.4.2對羥基自由基的清除作用 羥基是一種活性氧自由基，毒性極強，可造成生物膜損傷，導致多種疾病發(fā)生，清除體內(nèi)羥基自由基是保證機體健康必不可少的需求[16]。

由圖6可知玫瑰茄粗多糖對羥基自由基的清除作用與多糖的濃度成正相關(guān)，當多糖濃度為0.2 mg/mL 時，對羥基自由基的清除率可達10.23%，當多糖濃度為2 mg/mL 時，對羥基自由基的清除率可達61.42%，隨著玫瑰茄粗多糖濃度的增加，對羥基自由基的清除率也隨之升高。

圖4 液料比、提取時間和提取溫度對玫瑰茄粗多糖得率的響應面(A、C、E)和等高線分析圖(B、D、F)Fig.4 Response surface(A、C、E) and contour plots (B、D、F) results of solid-liquid ratio, extraction time and extraction temperature effects on the yield of polysaccharide. (彩圖見圖版七)

2.4.3對超氧陰離子自由基的清除作用 超氧陰離子自由基是人體內(nèi)產(chǎn)生的一種活性氧自由基，能引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，加快肌體的衰老，誘發(fā)癌癥、心血管疾病，嚴重危害人體健康[17]。玫瑰茄粗多糖對超氧陰離子自由基具有一定的清除作用，如圖7所示，隨著粗多糖濃度的增加，清除作用逐漸增強。當多糖濃度為2 mg/mL 時，對超氧陰離子自由基的清除率達到81.42%。

圖5 玫瑰茄粗多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effect of polysaccharide on DPPH free radical.

圖6 玫瑰茄粗多糖對羥基自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of polysaccharide on hydroxyl free radical.

圖7 玫瑰茄粗多糖對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of polysaccharide on superoxidant free radical.

3 討論

張文莉[18]采用水提醇沉法提取玫瑰茄干花萼中的粗多糖，提取得率為9.78%；Müller等[19]也采用該法提取玫瑰茄粗多糖，但多糖得率僅為5.3%。本實驗采用響應面分析法優(yōu)化玫瑰茄粗多糖的提取工藝條件，實驗結(jié)果表明當液料比1∶26(g/mL)、提取時間3.1 h、提取溫度90℃時，粗多糖的實際提取得率達到14.41%，該工藝條件提升了水提醇沉法提取玫瑰茄粗多糖的產(chǎn)量。響應面分析法作為試驗設(shè)計與優(yōu)化方法，它是將體系的響應值作為一個或多個因素的函數(shù)，運用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來，此方法不僅能全面地展示不同因素對響應值的影響，而且能分析各因素間的交互作用，從而有利于提取工藝的優(yōu)化。本實驗利用響應面分析法優(yōu)化玫瑰茄干花萼中粗多糖的提取工藝，玫瑰茄粗多糖的實際得率與模型中預測得率誤差小，說明該方法合理可行，優(yōu)化的工藝條件可用于玫瑰茄粗多糖的提取。

自由基是指具有不成對電子的原子或基團，它們普遍存在于人體內(nèi)。一定數(shù)量的自由基對人體是有益的，它們既可以參與免疫和信號傳導過程，又可以用來殺滅體內(nèi)的細菌和寄生蟲。但是當人體內(nèi)的自由基超過一定數(shù)量，便會失去控制，導致人體正常細胞和組織的損壞，從而引起多種疾病，因此開發(fā)高效無毒的天然抗氧化劑作為自由基清除劑，清除體內(nèi)多余自由基從而預防和治療某些疾病，已成為當今科學研究的熱點。本研究發(fā)現(xiàn)玫瑰茄粗多糖對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基都具有清除作用，清除率分別為45.89%、61.42%、81.42%，這說明本實驗制備的玫瑰茄粗多糖具有抗氧化作用，可以作為潛在的自由基清除劑。然而本研究只在體外對3種自由基的清除效果進行了研究，在生物體內(nèi)玫瑰茄粗多糖是否具有抗氧化作用還有待于進一步研究。

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