不同添加物對(duì)蘇云金芽孢桿菌殺蟲活性的增效作用研究進(jìn)展

李超峰

鹽城師范學(xué)院, 江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 鹽城 224007

蘇云金芽孢桿菌(Bacilliusthuringiensis，Bt)為革蘭氏陽性昆蟲病原細(xì)菌，在Bt穩(wěn)定期后期，伴隨芽孢的形成可產(chǎn)生伴胞晶體蛋白，也可將其稱為殺蟲晶體蛋白(insecticide crystal proteins，ICPs)或δ-內(nèi)毒素。同時(shí)，代謝產(chǎn)生的外毒素、營養(yǎng)期殺蟲蛋白(vegetative insecticidal proteins，VIPs)和芽孢等都具有一定的殺蟲活性。其次，Bt具有多樣性，不同亞種產(chǎn)生的毒素種類和性質(zhì)不同，而Bt毒素又可根據(jù)晶體狀態(tài)的不同分為Cry毒素和Cyt毒素，從而表現(xiàn)出不同的殺蟲特異性。因此，Bt制劑已被廣泛用于農(nóng)林業(yè)、貯藏和公共衛(wèi)生等領(lǐng)域的害蟲防治[1]。然而，在田間施用中，Bt制劑存在速效性差、持效期短、防效不穩(wěn)定、殺蟲譜較窄等諸多缺陷。為了克服上述缺陷，人們提出了一系列提高Bt制劑毒力和防效穩(wěn)定性的策略，如篩選高毒力、強(qiáng)特異性的菌株；改良現(xiàn)有高毒力菌株的遺傳特征，以提高殺蟲毒素的活性、擴(kuò)大殺蟲譜；改進(jìn)加工技術(shù)，增強(qiáng)Bt制劑的殺蟲效果；開發(fā)各種增效物質(zhì)(劑)、因子等，以提高現(xiàn)有Bt菌株的殺蟲活性[2,3]。然而，發(fā)掘新品系需要進(jìn)行大規(guī)模的篩選，且極難獲得高毒力菌株；其次，遺傳改良菌株的穩(wěn)定性較差，在實(shí)際生產(chǎn)中難以應(yīng)用。因此，快速、穩(wěn)定、有效的增效物質(zhì)(劑)和因子等的開發(fā)和應(yīng)用倍受關(guān)注。

圖1 Cry毒素作用的孔洞模式Fig.1 Pore formation model of Cry toxin action.

為了開發(fā)安全、高效的Bt制劑，深入了解其作用機(jī)制顯得尤為重要。目前，被廣泛接受的Bt作用模型為孔洞/順序結(jié)合模式[4,5]。孔洞/順序結(jié)合模式認(rèn)為原毒素/殺蟲晶體蛋白被攝食后，在昆蟲腸道堿性環(huán)境和蛋白酶等的多重作用下，經(jīng)溶解和水解，被激活為具有活性的殺蟲毒素，可穿透圍食膜(peritrophic membrane，PM)，與中腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜囊泡(brush border membrane vesicles，BBMV)上的受體蛋白氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)及堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，ALP)結(jié)合，進(jìn)而在脂筏上大量聚集，并與鈣粘蛋白(cadherin)受體結(jié)合，使其構(gòu)象改變，寡聚化后與氨肽酶N及堿性磷酸酯酶再次結(jié)合，從而使寡聚化的毒素分子插入上皮細(xì)胞，細(xì)胞膜產(chǎn)生孔洞，隨后細(xì)胞裂解，最終導(dǎo)致昆蟲死亡(圖1)[4,5]。即ICPs實(shí)現(xiàn)殺蟲活性必須經(jīng)過攝食、溶解、水解、透膜、與受體結(jié)合、脂筏聚集、構(gòu)象改變、寡聚化、插入上皮細(xì)胞和孔洞形成等一系列過程，該過程的任何改變都將影響B(tài)t ICPs的殺蟲活性，同時(shí)，這一過程也可用于增效Bt制劑毒力的研究[2,5～23]。因此，本文就目前國內(nèi)外開展的關(guān)于不同添加物在不同作用過程中對(duì)Bt制劑殺蟲活性增效作用的研究進(jìn)行綜述，并對(duì)其應(yīng)用和開發(fā)前景進(jìn)行討論，以期為開發(fā)安全、高效的Bt制劑的增效物質(zhì)(劑)、因子提供一定的參考。

1 化學(xué)添加劑對(duì)蘇云金芽孢桿菌殺蟲活性的增效作用

在Bt制劑添加劑的探索中，無機(jī)化合物和有機(jī)化合物都曾被嘗試用于提高Bt制劑的殺蟲活性。K2CO3、CaCl2、MgSO4、Fe2(SO4)3、MgCl2、CaCl2、ZnCl2和硼酸等無機(jī)化合物可通過增強(qiáng)昆蟲中腸堿性或激活、增強(qiáng)敏感昆蟲中腸蛋白酶活性，加速ICPs的活化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同亞種Bt殺滅不同齡期的小菜蛾(Plutellaxylostella)、印度谷斑螟(Plodiainterpunctella)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)、蓓帶夜蛾(Mamestraconfigurata)、家蠶(Bombyxmori)、菜青蟲(Pierisrapae)和棉葉夜蛾(Spodopteralittoralis)等的增效作用，但增效強(qiáng)弱程度不同。其中，MgSO4可使Btkurstaki對(duì)4齡蓓帶夜蛾(M.configurata)的半數(shù)致死濃度(LC50)和95%致死濃度(LC95)分別降低3.5倍和3.9倍，而CaCO3僅使BtkurstakiHD-1對(duì)印度谷斑螟(P.interpunctella)的毒力提高2.5倍[1,2,4,5,24～26]。此外，NaCl、KCl、CaCO3、CuSO4等無機(jī)化合物對(duì)Bt制劑的殺蟲活性無改善作用[1]，而ZnSO4(濃度>1 g/L)對(duì)Bt制劑防治3齡菜青蟲(P.rapae)甚至表現(xiàn)出顯著的拮抗作用[26]。

甲酸、檸檬酸、馬來酸、丹寧酸、巰基乙醇、巰基乙酸鈉、硫代乙醇鈉、乙酰胺、磷酸甘油二鈉鹽、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)和尿素等有機(jī)化合物可通過增強(qiáng)敏感昆蟲中腸液的還原性，促進(jìn)ICPs的溶解；或通過改變血淋巴的組成，影響昆蟲的正常生理過程，以提高昆蟲對(duì)病原微生物的敏感性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同亞種Bt殺滅不同齡期的小菜蛾(P.xylostella)、印度谷斑螟(P.interpunctella)、銅綠麗金龜(A.corpulenta)、蓓帶夜蛾(M.configurata)、家蠶(B.mori)、菜青蟲(P.rapae)和棉葉夜蛾(S.littoralis)等不同程度的增效作用。如EDTA可使BtkurstakiHD-1對(duì)印度谷斑螟(P.interpunctella)的毒力提高100倍；丙氨酸僅使Bt制劑對(duì)印度谷斑螟(P.interpunctella)的毒力提高1.3倍；二甲苯和甲醛反而使Bt制劑對(duì)3齡小菜蛾(P.xylostella)的毒力顯著下降[1,2,4,5,24～26]。

由上述可知，不同化學(xué)添加劑(包括種類和濃度的差異)與Bt制劑混用對(duì)殺滅不同害蟲(包括敏感性和齡期的差異)的增效作用不同。此外，農(nóng)乳600和二甲苯與Bt制劑混合后在室溫下存放5個(gè)月，其毒力呈現(xiàn)出不同程度的降低；存放1年，毒力均呈明顯下降[26]。這表明，Bt制劑與化學(xué)添加劑混合使用時(shí)，最好在使用前分開存放，使用時(shí)再混合，以減少化學(xué)添加劑對(duì)Bt毒素的影響[26]。因此，在選擇Bt制劑的化學(xué)添加劑時(shí)，除充分考慮化學(xué)添加劑對(duì)人畜、環(huán)境有無危害外，混合使用的穩(wěn)定性和保質(zhì)期也需充分掌握。即在選擇化學(xué)添加劑作為Bt制劑的增效劑時(shí)，必須注意種類的選擇、濃度的確定和配制方式的采用(如現(xiàn)用現(xiàn)配或其他方式)。

2 化學(xué)殺蟲劑對(duì)蘇云金芽孢桿菌殺蟲活性的增效作用

化學(xué)殺蟲劑以其高效、經(jīng)濟(jì)、方便、適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)在病蟲害防控、保障農(nóng)林業(yè)豐收等方面曾有著不可代替的作用。相對(duì)于化學(xué)殺蟲劑，Bt制劑速效性差、殘效期短、殺蟲譜窄，但其與化學(xué)殺蟲劑間無交互抗性，且與低劑量的化學(xué)殺蟲劑混用，不僅能提高殺蟲效果，還能改善其速效性、延緩抗藥性的產(chǎn)生，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)增效作用[27]。因此，Bt制劑與化學(xué)殺蟲劑混用、輪用等措施是一項(xiàng)切實(shí)可行的策略[2]，且化學(xué)殺蟲劑作為增效劑在國內(nèi)外已有嘗試。

辛硫磷、毒死蜱、敵敵畏、敵百蟲、氧化氯果、三唑磷和乙酰甲胺磷等有機(jī)磷類化學(xué)殺蟲劑與茚蟲威和滅多威等氨基甲酸酯類殺蟲劑可通過抑制昆蟲膽堿酯酶、多功能氧化酶、羧酸酯酶(carboxylesterase，CarE)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases，GSTs)等解毒酯酶的活性，阻斷昆蟲的神經(jīng)傳導(dǎo)等，使其中毒，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)Bt制劑防治小菜蛾(P.xylostella)、大袋蛾(Claniavartegata)、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、斜紋夜蛾(Prodenialitura)和菜青蟲(P.rapae)等的增效作用，但增效強(qiáng)弱程度不同[28,29]。Bt制劑與毒死蜱(0.8%Bt粉劑與10.0%毒死蜱混配，即10.8%毒·蘇可濕性粉劑)混合對(duì)防治斜紋夜蛾(P.litura)有顯著的增效作用，且共毒系數(shù)高達(dá)184[28]；Bt WG-001與茚蟲威(有效成分比為100.10∶0.72)混合防治小菜蛾(P.xylostella)3齡幼蟲的共毒系數(shù)為178.05，且田間給藥7 d，500倍液的平均防效為84.88%，顯著優(yōu)于兩者單用的毒力；但Bt WG-001與巴丹混合表現(xiàn)為相加或拮抗作用[29]。

溴氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯等擬除蟲菊酯類殺蟲劑可通過影響機(jī)體細(xì)胞色素c及電子傳遞系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)Bt制劑防治棉鈴蟲(H.armigera)、小菜蛾(P.xylostella)、大袋蛾(C.vartegata)、美國白蛾(Hyphantriacunea)、桃小食心蟲(Carposinaniponensis)和果樹食葉蟲等的增效作用，甚至延長持效期[24,28,30]。

殺蟲單、殺蟲雙和氟蟲腈等沙蠶毒素類殺蟲劑可通過作用于膽堿能突觸，阻遏神經(jīng)正常傳遞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Bt制劑防治小菜蛾(P.xylostella)、水稻二化螟(Chilosuppressalis)、水稻三化螟(Tryporyzaincertulas)、稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)和菜青蟲(P.rapae)等的增效作用[28,29]。然而，每公頃施用525 g和675 g 46%殺蟲單·蘇可濕性粉劑(Bt制劑與殺蟲單混劑)防治水稻二化螟(C.suppressalis)，施用7 d時(shí)，稻田蜘蛛減退率分別達(dá)到23.4%和24.1%。因此，從生態(tài)環(huán)境等角度出發(fā)，化學(xué)殺蟲劑與Bt制劑混用還應(yīng)充分考慮其藥物殘留和環(huán)境兼容性[28]。

氟鈴脲、氟啶脲、氟蟲脲、丁醚脲、除蟲脲、滅幼脲、滅幼脲3號(hào)和蟲酰肼等昆蟲生長調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑可通過抑制昆蟲幾丁質(zhì)的生物合成，損傷或破壞內(nèi)分泌及腺體，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)增效Bt制劑對(duì)棉鈴蟲(H.armigera)、小菜蛾(P.xylostella)、美國白蛾(H.cunea)和甜菜夜蛾(Spodoperaexigua)等的毒力，并使其速效性得以改善[7,31]。

另一方面，不同化學(xué)殺蟲劑與Bt制劑混用的防效穩(wěn)定性不同。在常用劑量下，2.5%溴氰菊酯乳油、48%毒死蜱乳油對(duì)Bt ICPs無影響；高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、滅多威和辛硫磷在30 d內(nèi)對(duì)Bt芽孢及ICPs無明顯影響[6]。當(dāng)濃度超過1‰時(shí)，溴氰菊酯、氯氰菊酯對(duì)Btkurstaki的殺蟲活性可產(chǎn)生明顯的抑制作用，而滅幼腺3號(hào)和辛硫磷卻有促進(jìn)作用[31]。

因此，Bt制劑與化學(xué)殺蟲劑的復(fù)合制劑的使用應(yīng)依據(jù)昆蟲類型、齡期與化學(xué)殺蟲劑的種類，同時(shí)還需兼顧二者比例、混合相容性、防效穩(wěn)定性、制劑劑型和施用方式(如預(yù)先混合、現(xiàn)用現(xiàn)混或不能混合等)等，采用差異化復(fù)配方式。此外，化學(xué)殺蟲劑的殘留和環(huán)境兼容性等，也需充分考慮。

3 生物殺蟲劑對(duì)蘇云金芽孢桿菌殺蟲活性的增效作用

3.1 蘇云金芽孢桿菌毒素間的增效作用

不同亞種Bt可產(chǎn)生不同的ICPs，而不同ICPs的殺蟲活性不同。此外，α-外毒素、β-外毒素、γ-外毒素和VIPs等都具有殺蟲活性，因此，Bt不同毒素間殺蟲活性的相互影響也逐漸引起研究人員的重視。Bruce首先提出了不同毒素間的協(xié)同作用，并確定了Btisraelensis(Bti) 27 kDa CytA和130 kDa或65 kDa Cry4毒素對(duì)殺滅埃及伊蚊(Aedesaegypti)的增效作用；而Bti Cyt1Aa毒素對(duì)Cry4Aa、Cry11Aa、Cry4Ba，以及Cry4Ba和Cry2Aa2毒素等防治埃及伊蚊(A.gypti)和蚋屬(Simuliumspp.)幼蟲，對(duì)Cry1Fa、Cry2Ab、Cry1Ca和Cry9Aa毒素防治棉鈴蟲(H.armigera)等不僅具有增效作用，還可使其速效性得到顯著改善[8～11,32,33]。Bt Cyt2Aa2對(duì)Cry4Ba毒素防治2日齡埃及伊蚊(A.gypti)幼蟲具有顯著的增效作用，且研究表明與Cry4Ba β2-β3環(huán)Thr328、Tyr332和β4-β5環(huán)Thr369、Phe364上的殘基有關(guān)[12]。Bt Cry10Aa毒素對(duì)Cry4B、Cry11Aa毒素防治蚋屬(Simuliumspp.)幼蟲，Cry1Ac毒素對(duì)Cry1Ca毒素防治棉鈴蟲(H.armigera)均具有顯著的增效作用[32,33]。BtisraelensisCyt1A98毒素通過為Cry4BLB提供額外的結(jié)合位點(diǎn)并促進(jìn)其寡聚體結(jié)構(gòu)的形成，以1%比例實(shí)現(xiàn)對(duì)Cry4BLB毒素防治埃及伊蚊(A.aegypti)的顯著增效作用[9]。同樣，共表達(dá)的BtisraelensisCry4Ba毒素和BtdarmstadiensisCyt2Aa2毒素對(duì)殺死埃及伊蚊(A.aegypti)和致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)也表現(xiàn)出高度的增效活性。其中，大腸桿菌表達(dá)的Cry4Ba對(duì)埃及伊蚊(A.aegypti)的LC50為140 ng/mL，對(duì)致倦庫蚊(C.quinquefasciatus)沒有毒性；而Cyt2A2對(duì)2種蚊種的LC50分別為350 ng/mL和250 ng/mL。但2種毒素共同表達(dá)的LC50分別為7 ng/mL和20 ng/mL，實(shí)現(xiàn)了二者的協(xié)同增效作用[10,34]。重組表達(dá)Cry3A毒素和人類免疫缺陷病毒調(diào)節(jié)基因編碼的反式激活蛋白(trans-activating protein，TAT)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain，PTD)-Cry3Aa包涵體初提物對(duì)殺滅甘薯小象甲(Cylasformicarius)幼蟲和成蟲表現(xiàn)出具有差異性的增效作用，且增效程度隨著昆蟲齡期的增加而降低[35]。但值得注意的是，也有研究表明不同毒素間的增效作用與評(píng)價(jià)方法有關(guān)[32]。

除內(nèi)毒素外，芽孢、外毒素和鈣粘蛋白等對(duì)Bt制劑的殺蟲活性也有增效作用。BtkurstakiHD-1芽孢可提高Cry1Ab或Cry1C毒素對(duì)印度谷螟(P.interpunctella)敏感系(增效35～50倍)和抗性系(增效25～44倍)的毒力和速效性，而且經(jīng)紫外線(UV)照射后，芽孢衣蛋白仍有增效作用[36]。而Bt VIP3和Cyt毒素共表達(dá)可顯著提高對(duì)棉鈴蟲(H.armigera)和甜菜夜蛾(S.exigua)的毒力，且比單劑分別提高了3.35倍和4.34倍，但對(duì)防治搖蚊(Chironomustepperi)和棉鈴蟲(H.armigera)無協(xié)同作用，對(duì)防治致乏庫蚊(C.quinquefasciatus)反而有拮抗作用[37]。Bt VIP3對(duì)Cry毒素防治甜菜夜蛾(S.exigua)、蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)和歐洲松毛蟲(Dendrolimuspini.)等農(nóng)林害蟲具有顯著的增效作用[38]。VIP3Aa7與Cry9Ca毒素蛋白N端鏈接重組形成的嵌合蛋白V3AC9C通過改善其溶解性使其對(duì)小菜蛾(P.xylostella)3齡幼蟲的毒力顯著優(yōu)于單一毒素，且比VIP3Aa7和Cry9Ca毒素混合物(質(zhì)量比為1∶1)的毒力高3.2倍，其增效系數(shù)為4.79，而質(zhì)量比為1∶1的VIP3Aa7和Cry9Ca毒素組成的混合物的增效系數(shù)僅為1.46[39]。同樣，重組表達(dá)的西方玉米根蟲(Diabroticavirgifera)鈣粘蛋白DvCad1可增強(qiáng)Cry3Aa、Cry3Bb和Cry8Ca毒素對(duì)小黃粉(Alphitobiusdiaperinus)幼蟲的毒力，且增效3.30～5.93倍[40]。而甜菜夜蛾(S.exigua)類鈣粘蛋白能夠增強(qiáng)Bt Cry1B和Cry1C毒素對(duì)鱗翅目昆蟲的毒力[41]。

3.2 其他病原微生物對(duì)蘇云金芽孢桿菌殺蟲活性的增效作用

昆蟲病毒具有不產(chǎn)生抗性、專一性強(qiáng)、對(duì)非目標(biāo)影響小、持效期長以及極易在種群內(nèi)引發(fā)流行病而起長期控制的作用(即可垂直傳播)等優(yōu)點(diǎn)，因此，也常用于增效Bt制劑毒力的研究。在棉鈴蟲(H.armigera)防治過程中，Btkurstaki和棉鈴蟲單粒核型多角體病毒(Helicoverpaarmigerasingle nuclear polyhedrosis virus，HaSNPV)包涵體混合物對(duì)小菜蛾(P.xylostella)2齡幼蟲具有顯著的增效作用，且可使其生長發(fā)育速率降低，化蛹率、蛹重和成蟲率降低，同時(shí)其半數(shù)致死時(shí)間(LT50)與其濃度呈負(fù)相關(guān)[42]。對(duì)Bt有較強(qiáng)耐受性的茶尺蠖(Ectropisobliquehypulina)，Bt制劑與茶尺蠖核型多角體病毒復(fù)配可明顯提高其死亡率，加快其死亡速度[43]。茶毛蟲核型多角體病毒可顯著增強(qiáng)Bt制劑對(duì)茶毛蟲(Euproctispseudoconspersa)的毒力，且以1.0×105PIB/μL∶2.0×103IU/μL比例增效最為明顯，以1 500 mL/hm2施用7 d，茶毛蟲死亡率為79.80%～92.84%，14 d為94.99%～95.80%[44]。與Bt制劑單獨(dú)使用相比，美國白蛾核型多角體病毒(Hyphantriacuneanuclear polyhedrosis virus, HcNPV)與其復(fù)合可提高其對(duì)美國白蛾(H.cunea)的毒力，縮短幼蟲死亡時(shí)間，并將LT50減少0.5～2.1 d[45]。而不同劑量的稻縱卷葉螟顆粒體病毒(Cnaphalocrocismedinalisgranulovirus，CmGV)與Bt制劑復(fù)配對(duì)防治稻縱卷葉螟(C.medinalis)2齡幼蟲具有顯著增效作用，共毒系數(shù)介于124.92～160.47，較單獨(dú)施用CmGV相比，將田間試驗(yàn)初始感染死亡時(shí)間縮短3 d，感染死亡率提高20.23%，且持效期在30 d以上；其次，CmGV(1×105OB/mg)與Bt(16 000 U/mg)混合給藥3 d的殺蟲率為62.68%～75.16%、保葉率為65.27%～71.19%；給藥7 d的殺蟲率為82.63%～89.3%、保葉率為79.53%～85.12%；給藥14 d的殺蟲率為80.41%～87.01%、保葉率為78.26%～83.49%[46]。Bt制劑與一定數(shù)量的舞毒蛾核型多角體病毒(Lymantriadisparnuclear polyhedrosis virus, LdNPV)混用對(duì)防治舞毒蛾(Lymantriadispar)具有協(xié)同增效作用，且使死亡率和速效性都得以提高，同時(shí)蟲口密度降低率以混合處理為最高，為38.67%[47]。然而，Bt制劑和昆蟲病毒間并不總是產(chǎn)生協(xié)同增效作用，因飼喂復(fù)方配劑的順序、劑量和配比等的不同，還可產(chǎn)生相加作用或拮抗作用[48]。

除昆蟲病毒外，Bt、球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus，Bs)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus，Bc)、球孢白僵菌(Beauveriabassiana)和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcesces)等病原微生物發(fā)酵上清液對(duì)Bt都有良好的增效作用[49]。Bti K55發(fā)酵上清液和Bti K46包涵體蛋白合成的納米銀離子(silver nanoparticles，Ag NPs)對(duì)Bti細(xì)胞防治埃及伊蚊(A.aegypti)具有顯著增效作用，且協(xié)同因子分別為3.3(LC50)、10.0(LC90)與1.6(LC50)、4.2(LC90)[50]。Btkurstaki發(fā)酵上清液可增效該亞種毒素對(duì)斜紋夜蛾(S.litura)、甘藍(lán)夜蛾(Mamestrabrassicae)和甜菜夜蛾(S.exigua)的毒力，而對(duì)殺滅小菜蛾(P.xylostella)和卷葉蛾(Adoxophyeshonmai)無增效作用[51]。去除發(fā)酵上清液后，Bt-79007菌株殺滅棉鈴蟲(H.armigera)的效價(jià)為1 307×103IU/mL；而加入10%上清液的Bt-79007對(duì)棉鈴蟲的效價(jià)為前者的1.53倍[52]。同樣，Btbuibui菌株發(fā)酵上清液可顯著提高CrylAc毒素對(duì)斜紋夜蛾(S.litura)幼蟲的殺蟲活性，飼用僅含3 000 μg/g CrylAc毒素的斜紋夜蛾(S.litura)幼蟲，7 d死亡率僅為54%；而混合Btbuibui菌株發(fā)酵上清液后，7 d死亡率高達(dá)100%[52]。Bc與其發(fā)酵上清液均對(duì)舞毒蛾(L.dispar)無殺蟲活性，但發(fā)酵上清液中次生代謝物Zwittermicin A對(duì)Btkurstaki殺滅舞毒蛾(L.dispar)幼蟲具有增效作用，且舞毒蛾(L.dispar)幼蟲的死亡率與Zwittermicin A的劑量成正比[53]。球形芽孢桿菌營養(yǎng)期殺蚊毒素(mosquitocidal toxin 1，Mtx1)對(duì)BtisraelensisCyt1Aa毒素殺滅致倦庫蚊(C.quinquefasciatus)和其速效性同樣具有顯著的增效作用，Cyt1Aa和Mtx1毒素作用于致倦庫蚊(C.quinquefasciatus)3～4齡幼蟲的LC50值分別為116.5 ng/mL和45.29 ng/mL，而當(dāng)Mtx1與Cyt1Aa按1∶3比例混合后，其LC50值僅為20.19 ng/mL，而毒力是Mtx1的2.24倍；其次，Cyt1Aa和Mtx1毒素的LT50分別是7.48 h和18.02 h，混合作用的LT50減少為11.69 h，比Mtx1的LT50縮短了6.33 h，且不同比例混合情況下，LC50、LC90與LT50、LT90的協(xié)同因子均大于1，表明Cyt1Aa和Mtx1毒素之間存在協(xié)同作用，且協(xié)同效果隨Cyt1Aa毒素用量的增加而得以增強(qiáng)[14]。粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcesces)發(fā)酵上清液提高Bt CrylC毒素對(duì)斜紋夜蛾(S.litura)的殺蟲活性達(dá)8倍，但對(duì)殺滅甘藍(lán)夜蛾(M.brassicae)、小菜蛾(P.xylostella)和卷葉蛾(A.honmai)無明顯作用。Bs對(duì)Bti Cyt1A毒素防治耐Bs菌株的史氏按蚊(Anophelesstephensi)具有顯著的增效作用，且Cyt1A與Bs混合物(1∶4)的LC90比單獨(dú)使用Bs高13 200倍[34]。綜上所述，微生物發(fā)酵上清液的種類、濃度以及ICPs濃度都影響著上清液對(duì)Bt制劑的增效作用，且與上清液含增效物質(zhì)的種類與性質(zhì)有關(guān)，然而，上清液組成與具體的增效作用機(jī)制等仍需進(jìn)一步研究。

3.3 其他生物殺蟲劑對(duì)蘇云金芽孢桿菌殺蟲活性的增效作用

除Bt制劑外，其他生物殺蟲劑同樣存在防效不穩(wěn)定、速效性差和持效期短等諸多缺陷，因此，不同生物殺蟲劑間混用以互補(bǔ)增效，也是促進(jìn)生物殺蟲劑發(fā)展的有效途徑。除病毒、細(xì)菌類生物殺蟲劑外，阿維菌素、印楝素、多殺霉素/多殺菌素和甲維鹽等生物殺蟲劑對(duì)Bt制劑防治稻縱卷葉螟(C.medinalis)、黃野螟(Heortiavitessoides)和小菜蛾(P.xylostella)也具有顯著的增效作用[54～56]。阿維菌素和Bt制劑對(duì)稻縱卷葉螟(C.medinalis)3齡初期幼蟲的LC50分別為0.217 8 μg/mL和372.73 μg/mL，二者混合物(0.1%阿維菌素·1.00×1010活芽孢/g)的LC50為93.17 μg/mL，且共毒系數(shù)為147.73[54]；對(duì)5齡黃野螟(H.vitessoides)的LC50分別為1.599×10-7mg/L和6.94×10-4μg/mL，二者混合物(阿維菌素:Bt制劑=1∶9)毒效比為1.77[55]；對(duì)小菜蛾(P.xylostella)的LC50分別為3.8 μg/mL和464.8 IU/mg，二者混合物(阿維菌素:Bt=2∶3)的LC50為66.47 μg/mL，即三者均表現(xiàn)出對(duì)Bt制劑的顯著增效作用[56]。同樣，甲維鹽對(duì)Bt制劑防治黃野螟(H.vitessoides)具有顯著增效作用，且兩者以重量比為8∶2、7∶3和6∶4混配時(shí)，增效作用最為顯著[57]。

4 其他添加物對(duì)蘇云金芽孢桿菌殺蟲活性的增效作用

動(dòng)植物和微生物等在發(fā)育過程中都會(huì)產(chǎn)生次生代謝物，以防御病蟲害的侵入和感染等。水溶性植物丹寧、沒食子酸和間苯二酚可引發(fā)棉鈴蟲腸道破損[15,16]，L-刀豆酸可改變煙草天蛾(Manducasexta)中腸膜的透性和主動(dòng)運(yùn)輸方式[17]，幾丁質(zhì)酶則通過抑制幾丁質(zhì)的合成，阻止昆蟲正常蛻皮和變態(tài)，上述方式均可增強(qiáng)Bt制劑的殺蟲活性[18～20]。1.63 mg/mL Bt制劑僅使10%粉紋夜蛾(Trichoplusiani)死亡，加入0.025‰～0.5‰丹寧酸可將其毒力提高47%～65%，但速效性有所降低[16]。酚糖酐、苯丙烯酸、對(duì)羥基苯丙烯酸、氯原酸、多酚氧化酶和川楝素等都可提高ICPs的毒性，且對(duì)幼蟲生長發(fā)育及變態(tài)、化蛹和蛹發(fā)育等具有明顯的抑制作用[15]。Bt HD-1菌株Cry毒素與幾丁質(zhì)分解芽孢桿菌(次生代謝產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶)混合防治小菜蛾(P.xylostella)和棉鈴蟲(H.armigera)的死亡率接近100%[18]，Bt Cry21Aa毒素復(fù)配銅綠假單胞菌幾丁質(zhì)酶可將秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的死亡率提高6.3倍，且加劇其角質(zhì)層、甲殼和腸的退化[20]。

由于拒食、高溫、光照和輻射等環(huán)境因素的影響，Bt毒素蛋白三維結(jié)構(gòu)極易被破壞而使活性降低，甚至喪失，因此，取食刺激劑和光保護(hù)劑等也被嘗試用于提高Bt制劑的毒力[2,21～23,43,58]。除了成功開發(fā)的取食刺激劑Coax和Entice，糖類、脂類、氨基酸、玉米、棉花葉和棉籽等也被用于改善Bt制劑對(duì)害蟲的適口性，以實(shí)現(xiàn)其增效作用[58]。此外，剛果紅、葉酸和對(duì)氨基苯甲酸可使Bt HD-1防治歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)的持效期得以延長，且以剛果紅效果最好[2]。而熒光增白劑M2R不僅可提高Bt制劑殺滅草地螟(Loxostegesticticalis)的速效性，降低其使用濃度，而且還可顯著提高其防治效果[43]。除M2R外，熒光增白劑Tinopal LPW、VBL和JD-3都可增強(qiáng)Bt制劑對(duì)棉鈴蟲(H.armigera)的毒力，協(xié)同因子分別為1.23、1.49和2.00，且VBL+Bt經(jīng)紫外線照射8 h后，殺蟲率仍高于70%[21]。與不產(chǎn)生黑色素的Bt相比，產(chǎn)黑色素的Bt對(duì)小菜蛾(P.xylostella)具有更強(qiáng)的毒力[58]，且隨著黑色素濃度增加，殺蟲活性提高，這是由于黑色素可有效保護(hù)Bt晶體毒素蛋白免于經(jīng)紫外線照射而降解[22]。研究表明，δ-內(nèi)毒素經(jīng)紫外線照射7 h，其殺蟲活性幾乎完全喪失，而δ-內(nèi)毒素與11 μg/mL黑色素復(fù)配后經(jīng)紫外線照射7 h，仍可使2齡小菜蛾的死亡率超過80%[23]。

5 展望

在農(nóng)林業(yè)實(shí)際生產(chǎn)中，高投入和集約化種植提高了生產(chǎn)力水平，但也導(dǎo)致病害蟲的大范圍爆發(fā)與惡化。過度依賴和濫用化學(xué)殺蟲劑防治病蟲害已使環(huán)境惡化、人類健康受到不良影響。而Bt制劑以其專一、高效和對(duì)人畜環(huán)境友好等優(yōu)勢，為防治病蟲害提供了新選擇。然而，Bt毒素的缺陷限制了其推廣與應(yīng)用，究其原因，Bt制劑主要活性成分是蛋白質(zhì)，極易受到高溫、輻射、光照、適口性和生物防御等因素的影響，使其活性降低，甚至喪失。通過改善Bt制劑在生產(chǎn)、保存和施用中的不利條件，提高Bt毒素被攝食后的溶解、酶解、透膜、與受體結(jié)合、脂筏聚集、構(gòu)象改變、寡聚化、插入上皮細(xì)胞和孔洞形成等諸多環(huán)節(jié)上的作用效率，克服病蟲害自身產(chǎn)生的抗性，是實(shí)現(xiàn)增效Bt制劑毒力的關(guān)鍵。

開發(fā)速效性快、持效期長、特異性強(qiáng)和廣譜的生物殺蟲劑，從而逐步降低、甚至完全替代化學(xué)殺蟲劑的使用，將是農(nóng)林業(yè)病蟲害綜合治理的發(fā)展趨勢。因此，發(fā)掘快速、穩(wěn)定、高效和環(huán)境友好型的增效物質(zhì)(劑)和因子，以彌補(bǔ)Bt制劑使用的諸多缺陷，可為復(fù)合新型Bt制劑的研制提供廣泛的理論依據(jù)。然而，Bt毒素的氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)及殺蟲譜具有多樣性，毒力發(fā)揮也需多種因素的協(xié)同作用，是多步驟的作用結(jié)果，且各步驟都可能受到環(huán)境因素的影響，因此，增效物質(zhì)(劑)、因子的合理使用必須依據(jù)其作用機(jī)制及增效機(jī)制而進(jìn)行。此外，還應(yīng)充分考慮增效物質(zhì)(劑)和因子殘留、毒性、對(duì)非目標(biāo)昆蟲(尤其是有益生物等)的影響，以及目標(biāo)害蟲的種類、齡期和敏感性等。

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