基于高通量測(cè)序的超級(jí)稻不同生育期土壤細(xì)菌?和古菌群落動(dòng)態(tài)變化

吳朝暉，劉清術(shù)，孫繼民，周建群，李鴻波，袁隆平*

（1. 湖南雜交水稻研究中心，雜交水稻國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；3. 湖南省微生物研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410009；4. 湖南省土壤肥料研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；5. 湖南省農(nóng)業(yè)信息與工程研究所，湖南 長(zhǎng)沙410125）

我國水稻土分布廣泛，面積約占世界水稻土面積的1/4，占我國耕地面積的25%左右[1]。水稻作為最重要的糧食作物，一直被放在優(yōu)先發(fā)展地位。在水稻與土壤系統(tǒng)中，土壤微生物是維系此系統(tǒng)健康與穩(wěn)定的重要成員。水稻在不同生育期內(nèi)對(duì)養(yǎng)分的需求不同，其生長(zhǎng)過程實(shí)質(zhì)是一個(gè)土壤—微生物—水稻相互作用的過程[2-3]。水稻及其根系生長(zhǎng)代謝活動(dòng)改變土壤理化性質(zhì)，土壤性質(zhì)又影響水稻及其根系的生長(zhǎng)代謝，且兩者相互作用調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的變化[4]；土壤微生物通過分解非根際土中幾丁質(zhì)和肽聚糖，再經(jīng)菌根真菌供給作物吸收利用，從而影響作物生長(zhǎng)[5-6]。同時(shí)，水稻根系分泌的氧氣可以擴(kuò)散到根際周圍[7]，促進(jìn)微生物的氧化過程；水稻根系分泌的有機(jī)物可以為異養(yǎng)菌的繁衍提供充足的有機(jī)碳源[8-9]。水稻生長(zhǎng)旺盛時(shí)期由于根系分泌物增加，促進(jìn)微生物繁衍；同時(shí)水稻植株與微生物對(duì)養(yǎng)分產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，促使土壤微生物增強(qiáng)胞外酶的分泌，加速對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)的水解作用，從而為水稻和微生物提供更多的養(yǎng)分和能量[10]。因此，水稻—土壤—微生物相互作用維系著水稻土環(huán)境生物生長(zhǎng)的營養(yǎng)元素計(jì)量學(xué)需求[11-13]。以上研究多通過酶學(xué)等方法對(duì)水稻根系與土壤微生物關(guān)系進(jìn)行探討，而土壤胞外酶的狀況與水稻土壤微生物的種類及其生長(zhǎng)狀況有著密切關(guān)系，所以對(duì)水稻土微生物群落組成狀況的研究具有重要意義。吳朝暉和袁隆平[14]通過培養(yǎng)法對(duì)不同施氮水平根際土中微生物數(shù)量變化研究顯示超級(jí)稻根際微生物數(shù)量及活性在不同施肥處理間差異顯著。Zhu等[15]通過磷脂脂肪酸法對(duì)7個(gè)品種超級(jí)稻根際微生物群落結(jié)構(gòu)研究表明超級(jí)稻根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和活性與水稻品種的遺傳背景有關(guān)。張振興等[16]通過末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分子生物技術(shù)對(duì)水稻分蘗期根際土壤中細(xì)菌組成研究發(fā)現(xiàn)水稻根系活動(dòng)和稻田土壤水分狀況是影響細(xì)菌生態(tài)功能的重要因素。近年來高通量測(cè)序技術(shù)，以耗時(shí)少，通量高，能夠較準(zhǔn)確全面反映土壤微生物群落分布特征等優(yōu)勢(shì)，逐漸被用在環(huán)境樣品分析中[17]。目前對(duì)于超級(jí)稻不同生育期土壤微生物群落組成狀況的研究報(bào)道較少。

我國水稻育種和栽培技術(shù)在國際上取得了很有影響力的成果。半高稈超級(jí)雜交稻是袁隆平院士2012年提出來的新概念，其特點(diǎn)是產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)明顯，生物量大，具有強(qiáng)大的根系。因此研究高產(chǎn)和低產(chǎn)生態(tài)區(qū)半高稈超級(jí)稻不同生育期土壤微生物的群落組成和豐度特征及微生物變化的主要影響因子，對(duì)闡明超級(jí)稻高產(chǎn)的適宜土壤環(huán)境條件，揭示其高產(chǎn)機(jī)制有重要科學(xué)意義。本研究以大田條件下半高稈超級(jí)雜交稻稻田土壤為研究材料，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)，分析高產(chǎn)生態(tài)區(qū)和低產(chǎn)生態(tài)區(qū)高產(chǎn)條件下超級(jí)稻不同生育期對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性與豐度的影響，揭示半高稈超級(jí)雜交稻不同生育期土壤微生物動(dòng)態(tài)變化及其影響因素，為探究超級(jí)稻高產(chǎn)機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況與供試材料

試驗(yàn)區(qū)位于湖南水稻高產(chǎn)區(qū)（HLW）隆回王化永村（110°56′E，27°27′N）和低產(chǎn)區(qū)（LNX）寧鄉(xiāng)（112°16′E，28°08′N），土壤類型為潮土，栽種前土壤耕作層（0～20 cm）的基本理化性狀見表1。供試水稻品種為超級(jí)稻“Y兩優(yōu)900”，由湖南雜交水稻研究中心提供。2014年5月移栽，10月收獲，水肥等栽培條件和管理措施按常規(guī)進(jìn)行。其中隆回試驗(yàn)區(qū)于5月1日施基肥鮮雞糞6 000 kg/hm2，復(fù)合肥750 kg/hm2；5月14日追施尿素135 kg/hm2，復(fù)合肥112.5 kg/hm2；5月22日追施尿素75 kg/hm2，氯化鉀112.5 kg/hm2；7月5日追施尿素60 kg/hm2，氯化鉀150 kg/hm2，分別于8月8日和16日噴施0.5%氨基酸葉面肥1 800 L/hm2。寧鄉(xiāng)試驗(yàn)區(qū)于5月25施基肥過磷酸鈣600 kg/hm2，氯化鉀90 kg/hm2，復(fù)合肥450 kg/hm2，6月5日追施尿素120 kg/hm2，6月15日追施尿素90 kg/hm2，氯化鉀150 kg/hm2，復(fù)合肥225 kg/hm2，7月20日追施尿素60 kg/hm2，氯化鉀135 kg/hm2，復(fù)合肥75 kg/hm2，分別于8月8日和16日噴施0.5%氨基酸葉面肥1 800 L/hm2。

表1 不同產(chǎn)區(qū)土壤化學(xué)性質(zhì)Table 1 Chemical properties of the soils in different areas

1.2 樣品采集

分別于超級(jí)稻移栽前（4月29日）、分蘗期（6月14日）、抽穗期（8月15日）和成熟期（9月24日），按“S”形采集表層0～20 cm土壤樣品，每個(gè)重復(fù)區(qū)取10～15個(gè)點(diǎn)混合，混合后的樣品立即分成2份，一份包入無菌錫箔紙放入液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后保存在-80 ℃冰箱中用于微生物群落分析，另一份裝入封口聚乙烯袋，帶回風(fēng)干處理，用于理化指標(biāo)分析。每個(gè)生態(tài)區(qū)采集3個(gè)重復(fù)樣品。

1.3 樣品測(cè)定與分析

pH用酸度計(jì)法測(cè)定（土水比1∶2.5）；全氮用凱氏定氮法測(cè)定；有效磷用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測(cè)定；速效鉀用乙酸銨浸提—原子吸收火焰光度法測(cè)定；有機(jī)質(zhì)用重鉻酸鉀容量法測(cè)定[18]。

土壤微生物基因組 DNA 采用MOBIO土壤微生物提取試劑盒（PowerSoil?DNA Isolation kit）進(jìn)行提取，提取的DNA采用NanoDrop分光光度計(jì)（Thermo Fisher）進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測(cè)。

以提取的土壤微生物基因組DNA為模板，采用16S rDNA通用引物515F（5’-GTGCCAGCMGCC GCGGTAA-3’）和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3’）擴(kuò)增細(xì)菌和古菌的16S rRNA V4高變區(qū)，擴(kuò)增體系和條件參考Caporaso等[19]的研究，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，并將純化產(chǎn)物送至中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)所得測(cè)序結(jié)果進(jìn)行加工和去雜（使用軟件FLSAH），去除前后引物，獲得首尾整齊的高質(zhì)量序列，然后用軟件Mothur（http://www.mothur.org/wiki/Download_mothur）對(duì)這些序列數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以97%相似性劃分OTU（Operational Taxonomic Unit），并采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)各OTU代表的序列進(jìn)行分類學(xué)分析（Release 11.1, http://rdp.cme.msu.edu/），從而獲得細(xì)菌和古菌組成和多樣性數(shù)據(jù)。采用SPSS19.0雙尾ANOVA分析，以及CANOCO4.5進(jìn)行RDA冗余分析，以獲取細(xì)菌和古菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的耦合關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤基本理化性質(zhì)

從超級(jí)稻栽種前土壤理化性質(zhì)分析看，高產(chǎn)區(qū)（隆回）土壤偏堿性（7.23），低產(chǎn)區(qū)（寧鄉(xiāng)）土壤偏酸性（5.50）；高產(chǎn)區(qū)養(yǎng)分全量均大于低產(chǎn)區(qū)，其中有機(jī)質(zhì)和全氮的差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），全磷、全鉀無顯著差異（P＞0.05）（表1）。土壤速效養(yǎng)分含量在兩個(gè)產(chǎn)區(qū)均隨著超級(jí)稻生育期的變化有下降的趨勢(shì)，其中堿解氮下降最明顯，速效鉀在兩個(gè)產(chǎn)區(qū)均沒有顯著變化，速效磷只在高產(chǎn)區(qū)有顯著變化趨勢(shì)（表2）。

2.2 超級(jí)稻不同生育期土壤細(xì)菌和古菌群落高通量文庫分析

通過對(duì)微生物16S rRNA的V4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，本研究中高產(chǎn)生態(tài)區(qū)和低產(chǎn)生態(tài)區(qū)24個(gè)樣品共獲得383 286條有效序列，其中細(xì)菌序列占91.7%～98.9%，古菌占1.1%～8.3%。以97%相似水平為劃分依據(jù)，高產(chǎn)和低產(chǎn)生態(tài)區(qū)各時(shí)期獲得3 243～4 154個(gè)OTU（表3），高產(chǎn)區(qū)水稻移栽前OTU數(shù)量顯著低于生育期（P＜0.05），而低產(chǎn)區(qū)水稻移栽前和生育期微生物OTU數(shù)量沒有顯著變化（P＞0.05）；高產(chǎn)生態(tài)區(qū)微生物OTU數(shù)量大于低產(chǎn)區(qū)，在分蘗期和抽穗期達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

三種多樣性指數(shù)分析顯示，生育期土壤中微生物多樣性大于移栽前，其中低產(chǎn)田各時(shí)期微生物多樣性差異不顯著（表4），Chao指數(shù)顯示高產(chǎn)區(qū)微生物多樣性在生育期顯著大于移栽前期（P＜0.05）。

高產(chǎn)區(qū)微生物多樣性大于低產(chǎn)區(qū)，其中Chao指數(shù)分析顯示在分蘗期和抽穗期達(dá)到顯著水平（P＜0.05），Shannon指數(shù)顯示在分蘗期、抽穗期和成熟期均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），Simpson 指數(shù)在4個(gè)時(shí)期均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

表2 土壤速效養(yǎng)分隨超級(jí)稻生育期的變化Table 2 Dynamics of soil available nutrients during the super rice cultivation stages

表3 土壤細(xì)菌和古菌群落高通量測(cè)序文庫質(zhì)量分析Table 3 Information of high-throughput DNA sequencing libraries of bacterial and archaeal communities in the tested soils

2.3 超級(jí)稻不同生育期土壤細(xì)菌和古菌群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)分析

本研究獲得的微生物序列可分為28～32個(gè)門，73～81個(gè)綱，101～120個(gè)目，160～211個(gè)科，251～399個(gè)屬。2.3.1 超級(jí)稻不同生育期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與豐度分析根據(jù)相對(duì)豐度在0.1%以下的為稀有微生物的劃分標(biāo)準(zhǔn)[20]，將各樣品中相對(duì)豐度均小于0.1%的菌門舍去。所有樣品中，變形菌門（Proteobacteria，16.65%～38.92%）、酸桿菌門（Acidobacteria，12.61%～19.77%）、綠彎菌門（Chloro fl exi，4.98%～28.26%）、疣微菌門（Verrucomicrobia，2.90%～8.84%）所占比例最多，為2種生態(tài)區(qū)表層（0～20 cm）水稻土中主要細(xì)菌類群；擬桿菌門（Bacteroidetes，4.98%～9.45%）只是高產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群。樣品中檢測(cè)到的細(xì)菌還有浮霉菌門（Planctomycetes）、厚壁菌門（Firmicutes)、放 線 菌 門（Actinobacteria）、 芽 單 胞 菌 門（Gemmatimonadetes）、 藍(lán) 細(xì) 菌（Cyanobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospira）、綠菌門（Chlorobi）等。

優(yōu)勢(shì)菌群中，Chloro fl exi在低產(chǎn)區(qū)相對(duì)豐度顯著大于高產(chǎn)區(qū)（P＜0.05），Bacteroidetes和Proteobacteria的相對(duì)豐度則是在高產(chǎn)區(qū)顯著大于低產(chǎn)區(qū)（P＜0.05），Acidobacteria和Verrucomicrobia的相對(duì)豐度在2種生產(chǎn)區(qū)差異不顯著（P＞0.05）（圖1和圖2）。其它菌群中，Planctomycetes、Actinobacteria和Nitrospira在高產(chǎn)區(qū)相對(duì)豐度大于低產(chǎn)區(qū)，F(xiàn)irmicutes的相對(duì)豐度在高產(chǎn)區(qū)和低產(chǎn)區(qū)差異不顯著（P＞0.05）。

表4 超級(jí)稻不同生育期土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性Table 4 Diversity of soil bacterial and archaeal communities in different growth stages of super hybrid rice

Acidobacteria和Verrucomicrobia的相對(duì)豐度在2種生產(chǎn)區(qū)隨生育期的變化呈先減小后增大的趨勢(shì)，在收獲期相對(duì)豐度最大，并且在低產(chǎn)區(qū)變化更明顯（圖2）。Bacteroidetes和Proteobacteria的相對(duì)豐度在高產(chǎn)區(qū)隨超級(jí)稻生育期的變化呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在低產(chǎn)區(qū)總體上也呈下降趨勢(shì)，只在抽穗期有一定升高。Chloro fl exi的相對(duì)豐度在2種生產(chǎn)區(qū)均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)（圖2）。另外，Actinobacteria和Planctomycetes的相對(duì)豐度在2種生產(chǎn)區(qū)也呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)（圖1）。

圖1 超級(jí)稻不同生育期門分類水平上土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 1 Soil bacterial community structure at phylum level in different growth stages of super hybrid rice

圖3 不同生育期門分類水平上古菌群落組成Fig. 3 Soil archaeal community structure at phylum level in different growth stages

2.3.2 超級(jí)稻不同生育期土壤古菌群落結(jié)構(gòu)與豐度分析 土壤古菌在門分類水平上的群落結(jié)構(gòu)表明，高產(chǎn)區(qū)稻田表層土壤（0～20 cm）的主要優(yōu)勢(shì)菌群是廣古菌門（Euryarchaeota），占該區(qū)古菌總量的70.1%～84.2%；而低產(chǎn)區(qū)稻田表層土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群是泉古菌門（Crenarchaeota），占該區(qū)古菌總量的38.0%～62.7%，其次是廣古菌門，占30.7%～56.2%（圖3）。

低產(chǎn)區(qū)古菌數(shù)量顯著大于高產(chǎn)區(qū)，是高產(chǎn)區(qū)的2.8～5.5倍（圖3）；并且低產(chǎn)區(qū)泉古菌門豐度顯著大于高產(chǎn)區(qū)，是高產(chǎn)區(qū)的7.1～23.0倍?？傮w上，各優(yōu)勢(shì)古菌門豐度在超級(jí)稻生長(zhǎng)期呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)（圖4）。泉古菌門（Crenarchaeota）豐度在高產(chǎn)區(qū)整個(gè)生育期無顯著變化（P＞0.05）；在低產(chǎn)區(qū)，分蘗期豐度顯著降低（P＜0.05），抽穗期急劇增加（P＜0.01），收獲期略有下降，但不顯著（P＞0.05）。廣古菌門（Euryarchaeota）在高產(chǎn)區(qū)和低產(chǎn)區(qū)的變化趨勢(shì)比較一致，均是分蘗期豐度下降，之后呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)（圖4）。

圖4 門水平上優(yōu)勢(shì)古菌在不同生育期的動(dòng)態(tài)變化Fig. 4 Dynamics of the abundance of main archaea at phylum level during different growth stages

2.4 超級(jí)稻不同生育期土壤微生物群落組成的影響因素

通過方差分析顯示，超級(jí)稻耕作土壤中微生物多樣性與不同生產(chǎn)區(qū)和不同超級(jí)稻生育時(shí)期均存在顯著相關(guān)性（表5）。

表5 不同產(chǎn)區(qū)和生育期土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異性分析（雙尾方差分析）Table 5 Relationships between microbial community diversity and area or stages by two-way ANOVA

通過冗余分析法（RDA）對(duì)不同產(chǎn)區(qū)超級(jí)稻不同生育期土壤理化性質(zhì)與微生物在門水平上的關(guān)系進(jìn)行分析（圖5）?；谶@個(gè)模型，兩個(gè)排序軸共解釋了細(xì)菌和古菌菌群的94.3%的變異，其中第一排序軸解釋了80.7%的變異，而第二排序軸解釋了13.6%的變異。第一軸排序軸主要與速效鉀、全氮、速效磷、pH、全磷、有機(jī)質(zhì)、速效氮高度相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 -0.951，-0.9468，-0.942，-0.931，-0.871，-0.828和 -0.804。Bacteroidetes、Proteobacteria、 和Nitrospira與速效鉀、全氮、速效磷、pH、全磷、有機(jī)質(zhì)及速效氮正相關(guān)。對(duì)Bacteroidetes種群影響最大因素的是速效磷，對(duì)Proteobacteria影響最大的因素是有機(jī)質(zhì)。優(yōu)勢(shì)菌Acidobacteria與全鉀含量有一定正相關(guān)性，而受其它土壤理化性質(zhì)影響較小，優(yōu)勢(shì)菌Verrucomicrobia與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性也較小。Crenarchaeota、Euryarchaeota、Cyanobacteria和優(yōu)勢(shì)菌Chloro fl exi與速效鉀、全氮、速效磷、pH等理化性狀呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

通過RDA分別對(duì)兩個(gè)不同產(chǎn)區(qū)微生物群落影響因素分析表明，高產(chǎn)區(qū)微生物群落組成的主要影響因子是速效氮（0.980），其次是速效磷（0.945），然后是速效鉀（0.894）。而低產(chǎn)區(qū)的主要影響因子是速效磷（0.896）（圖6）。

圖5 不同生育期土壤性質(zhì)與細(xì)菌和古菌群落的RDA分析Fig. 5 Relationships between microbial (bacteria andarchaea) community and soil physiochemical characteristics based on redundancy analysis (RDA) in four growth stages

3 討論

高通量測(cè)序技術(shù)以其數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高的特點(diǎn)在土壤微生物物種多樣性方面得到廣泛應(yīng)用[17]，本研究利用此技術(shù)獲得較好的微生物數(shù)量（圖1）。多樣性指數(shù)分析顯示高產(chǎn)區(qū)微生物多樣性大于低產(chǎn)區(qū)（表4），這可能是高產(chǎn)區(qū)養(yǎng)分含量有機(jī)質(zhì)、全氮等顯著高于低產(chǎn)區(qū)所致（表1）。秦杰等[21]研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)質(zhì)含量高的NPK處理土壤細(xì)菌和古菌的多樣性顯著高于有機(jī)質(zhì)含量低的CK和PK處理，原因可能是有機(jī)質(zhì)含量低的土壤中細(xì)菌和古菌可利用的有機(jī)碳源減少。本研究也發(fā)現(xiàn)，超級(jí)稻生育期土壤微生物多樣性大于移栽前，可能是生育期存在水稻根系分泌的有機(jī)物促進(jìn)了微生物繁衍；Henriksen和Breland[22]、Meidute等[23]發(fā)現(xiàn)碳氮底物的可獲性和種類是微生物繁殖的重要控制因素，在水稻根系比較發(fā)達(dá)的分蘗期和抽穗期，高產(chǎn)區(qū)與低產(chǎn)區(qū)微生物多樣性差異已達(dá)到顯著水平也間接說明可利用碳氮源對(duì)微生物多樣性有影響（表1，高產(chǎn)區(qū)速效氮含量顯著大于低產(chǎn)區(qū)）。Singh等[4]和張振興等[16]研究結(jié)果顯示土壤理化性質(zhì)影響水稻根系的生理代謝，水稻根系的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)改變土壤理化性狀，兩者相互作用共同影響微生物的群落組成及多樣性。本研究方差分析顯示土壤中微生物多樣性與不同產(chǎn)區(qū)（理化性狀不同）和不同生育期（根系生長(zhǎng)代謝差異）均存在顯著相關(guān)性，也印證了土壤—植物—微生物間的關(guān)系。

圖6 高產(chǎn)區(qū)和低產(chǎn)區(qū)土壤速效養(yǎng)分與細(xì)菌和古菌群落的RDA分析Fig. 6 Relationships between microbial (bacteria and archaea) community and soil available nutrients in high-yield area and low-yield area based on redundancy analysis (RDA).

有研究表明，土壤養(yǎng)分含量不同，使土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌各門、綱的相對(duì)豐度不同，土壤營養(yǎng)元素含量的變化導(dǎo)致土壤微生物組成及群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[24-26]。本研究顯示優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的分布存在差異，Bacteroidetes和Proteobacteria的相對(duì)豐度在高產(chǎn)區(qū)顯著大于低產(chǎn)區(qū)，而Chloro fl exi在低產(chǎn)區(qū)相對(duì)豐度顯著大于高產(chǎn)區(qū)。從RDA分析可見，土壤速效磷含量是影響B(tài)acteroidetes豐度的最主要因子，Proteobacteria也與土壤有機(jī)質(zhì)和速效氮高度正相關(guān)，而Chloro fl exi與土壤養(yǎng)分呈負(fù)相關(guān)，這可能是這3類優(yōu)勢(shì)菌在兩個(gè)產(chǎn)區(qū)形成差異的主要原因。其它常見菌群中，Planctomycetes、Actinobacteria和Nitrospira在高產(chǎn)區(qū)相對(duì)豐度大于低產(chǎn)區(qū)，可能受土壤堿解氮和有機(jī)質(zhì)的影響（圖6）；其中參與硝化作用的硝化螺旋菌門Nitrospira受土壤速效氮素影響最大。如已有研究報(bào)道，古菌耐受性較強(qiáng)，適宜在養(yǎng)分含量較低的環(huán)境中生長(zhǎng)[27-29]，本研究得出類似結(jié)論，低產(chǎn)區(qū)古菌數(shù)量顯著大于高產(chǎn)區(qū)，RDA分析發(fā)現(xiàn)古菌與土壤養(yǎng)分含量，特別是速效氮和有機(jī)質(zhì)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。通過分析微生物組成與土壤養(yǎng)分含量關(guān)系，可以得出Bacteroidetes、Proteobacteria、Planctomycetes、Actinobacteria和Nitrospira喜好營養(yǎng)豐富的土壤環(huán)境，Chloro fl exi、Crenarchaeota和Euryarchaeota在較低營養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)更好。

大量研究表明土壤微生物群落組成與土壤pH密切相關(guān)[30-34]。陳孟立等[24]和Liu等[25]研究報(bào)道Proteobacteria為堿性土壤中的主要優(yōu)勢(shì)菌群，本研究雖顯示在堿性水稻土中其豐度顯著大于偏酸性水稻土，但最大影響因素是土壤有機(jī)質(zhì)和速效氮含量，差異存在原因可能是前者研究對(duì)象是旱地土壤環(huán)境，本研究是水稻土環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn)Acidobacteria的數(shù)量與組成受pH的影響較大[35-37]，而本研究顯示pH對(duì)Acidobacteria的影響不大，并且與土壤養(yǎng)分含量的關(guān)系也不大，這與袁紅朝等[38]和Pankratov等[39]研究結(jié)果不一致。

在門分類水平上，高產(chǎn)區(qū)和低產(chǎn)區(qū)在超級(jí)稻不同生育期微生物組成存在差異。Acidobacteria和Verrucomicrobia的相對(duì)豐度在2種生產(chǎn)區(qū)隨生育期的變化呈先減小后增大的趨勢(shì)，其變化趨勢(shì)與超級(jí)稻根系生長(zhǎng)趨勢(shì)[40-41]相反。Chloro fl exi、Actinobacteria和Planctomycetes的相對(duì)豐度在2種生產(chǎn)區(qū)均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，與超級(jí)稻根系生長(zhǎng)趨勢(shì)相近，其可能受水稻根系影響更大。Proteobacteria和Bacteroidetes的相對(duì)豐度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，與土壤速效養(yǎng)分氮磷鉀含量變化趨勢(shì)一致，且具有極顯著相關(guān)性（表6）；從相關(guān)系數(shù)大小來看，速效磷是影響此兩種菌門的首要肥力因子，其次是速效鉀。

表6 超級(jí)稻不同生育期Proteobacteria和Bacteroidetes與土壤速效養(yǎng)分的相關(guān)性分析（n=8）Table 6 Correlation coefficients between soil available nutrient and the relative abundances of Proteobacteria and Bacteroidetes in four growth stages

通過RDA分別對(duì)兩個(gè)不同產(chǎn)區(qū)微生物群落影響因素分析表明（圖6），高產(chǎn)區(qū)微生物群落組成的主要影響因子是速效氮，而低產(chǎn)區(qū)的主要影響因子是速效磷。這可能因高產(chǎn)區(qū)土壤碳氮含量較高（表1），速效氮和速效鉀均處于極豐富狀態(tài)，速效磷含量也較豐富[42]（表2），說明在土壤肥力較高水稻土中，速效氮是影響微生物群落的首要限制因子。低產(chǎn)區(qū)雖然速效氮處于較豐富狀態(tài)，但是速效磷和速效鉀處于較缺乏狀態(tài)（表2），所以在養(yǎng)分含量較貧乏水稻土中，速效磷是影響微生物群落組成的主要因子。

4 結(jié)論

研究表明，高產(chǎn)區(qū)和低產(chǎn)區(qū)土壤微生物群落動(dòng)態(tài)變化的主控因子分別是速效氮和速效磷，說明在土壤肥力較高水稻土中，速效氮是影響微生物群落的首要限制因子，而在養(yǎng)分含量較低水稻土中，速效磷是影響微生物群落組成的主要因子。不同產(chǎn)區(qū)中土壤有機(jī)質(zhì)是影響Proteobacteria分布的最關(guān)鍵因子，土壤速效磷則是影響B(tài)acteroidetes分布的主要因子，而Acidobacteria與土壤養(yǎng)分含量的關(guān)系并不大，說明優(yōu)勢(shì)菌群的分布對(duì)土壤性質(zhì)的響應(yīng)不同。超級(jí)稻土壤中微生物多樣性與不同產(chǎn)區(qū)（理化性狀不同）和不同生育期（根系生長(zhǎng)代謝差異）均存在顯著相關(guān)性，印證了土壤—植物—微生物間存在相互作用關(guān)系。這些結(jié)論為進(jìn)一步探明超級(jí)稻高產(chǎn)的土壤環(huán)境微生物分子機(jī)理提供數(shù)據(jù)支持。

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