灌漿期高溫對(duì)不同耐熱性小麥籽粒淀粉積累的影響

李睿瓊，侯立江，盧云澤，劉曼雙，許盛寶

(旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥?zhǔn)侨祟愔匾募Z食作物之一，對(duì)保障我國(guó)的糧食安全有至關(guān)重要的作用。小麥屬于喜涼作物，高溫氣候?qū)π←溕a(chǎn)影響較大[1-5]。小麥灌漿期對(duì)高溫脅迫尤為敏感，灌漿期遭遇高溫脅迫往往會(huì)造成小麥減產(chǎn)[2,5-8]。隨著全球變暖的不斷加劇以及“干熱風(fēng)”等極端天氣的頻繁出現(xiàn)，小麥生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展遭受巨大挑戰(zhàn)[9]。研究表明，氣溫每升高1 ℃，小麥平均減產(chǎn)6%[1]。因此，研究小麥耐熱機(jī)制，培育小麥耐熱品種已經(jīng)成為一個(gè)刻不容緩的課題。

高溫對(duì)小麥粒重的影響主要有兩個(gè)方面：(1)高溫脅迫使小麥籽粒衰老加速，灌漿時(shí)間縮短，最終造成粒重降低[10-12]；(2)高溫脅迫會(huì)降低與淀粉合成相關(guān)酶的活性[13,14]，抑制淀粉合成。淀粉是小麥籽粒的主要組成部分，是小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的決定性因素之一[15]。高溫對(duì)淀粉積累的影響被認(rèn)為是熱脅迫下小麥粒重下降的關(guān)鍵問題，研究高溫脅迫對(duì)淀粉積累的影響對(duì)于理解與改良小麥耐熱性具有重要意義[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，相比于直鏈淀粉，小麥籽粒支鏈淀粉的合成在熱脅迫下受到的抑制更為嚴(yán)重，淀粉積累的減少主要是由于支鏈淀粉的下降[16-17]。高溫會(huì)引起小麥籽?？偟矸酆椭ф湹矸鄣臏p少，但目前關(guān)于高溫對(duì)籽粒直鏈淀粉影響的研究有不同的結(jié)果。趙輝等認(rèn)為，35 ℃高溫對(duì)小麥籽粒直鏈淀粉含量幾乎無(wú)影響[18]；但周續(xù)蓮等對(duì)花后10～25 d的春小麥進(jìn)行35 ℃高溫處理后，發(fā)現(xiàn)籽粒直鏈淀粉含量升高[19]。此外，高溫脅迫對(duì)小麥籽粒的淀粉顆粒形成也會(huì)造成顯著影響[20-22]，改變了籽粒淀粉的組分、淀粉顆粒大小及粒度分布。小麥籽粒的淀粉顆粒分為兩類：一種是A 型淀粉粒，直徑大于10 μm，呈凸透鏡狀，該淀粉粒的形成起始于籽粒發(fā)育初期；另一種是B 型淀粉粒，直徑小于10 μm，呈圓球狀[23-24]。小麥灌漿初期遭遇熱脅迫后B型淀粉粒比例降低，A型淀粉粒比例升高[21]。高溫下A型和B型淀粉顆粒均減少，但后者更明顯，造成A型和B型淀粉粒比例升高[22]。不同實(shí)驗(yàn)的供試品種(系)對(duì)高溫脅迫的應(yīng)對(duì)策略不同，這可能是造成這些研究結(jié)果不一的原因之一。

目前，有關(guān)高溫對(duì)不同耐熱性小麥籽粒淀粉顆粒影響的研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以3個(gè)耐熱性不同的小麥品種(系)[44(耐熱)、94(熱敏感)和中國(guó)春(熱敏感)]為材料，在開花后15 d進(jìn)行熱脅迫(晝/夜溫度37/17 ℃，14/10 h)至成熟，探究熱脅迫對(duì)不同耐熱性小麥淀粉積累的影響，以期進(jìn)一步揭示小麥的耐熱機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理方法

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)從ICARDA(International Center for Agricultural Search in the Dry Areas，國(guó)際干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究中心)引進(jìn)的多個(gè)小麥品系進(jìn)行了多年多點(diǎn)分期播種，并以千粒重減少率為標(biāo)準(zhǔn)鑒定了這些品系的耐熱性。本研究選取其中耐熱的44號(hào)小麥品系(以下簡(jiǎn)稱44)和熱敏感的94號(hào)小麥品系(以下簡(jiǎn)稱94)以及中國(guó)春(公認(rèn)的熱敏感小麥，簡(jiǎn)稱CS)為實(shí)驗(yàn)材料。

2016年9-12月在西北農(nóng)林科技大學(xué)溫室將小麥種植于塑料盆缽(26 cm×26 cm×20 cm)中，每盆裝營(yíng)養(yǎng)土2.6 kg，播種9粒小麥，每個(gè)實(shí)驗(yàn)材料種植8盆，按常規(guī)栽培措施進(jìn)行管理，小麥生長(zhǎng)中控制白粉病和蚜蟲，保持良好水分供應(yīng)。選取開花時(shí)間和生長(zhǎng)一致的小麥在開花后12 d轉(zhuǎn)移到人工氣候培養(yǎng)箱(型號(hào)RDN-1000D-4，寧波東南儀器有限公司)進(jìn)行2 d生長(zhǎng)適應(yīng)(24/17 ℃，14/10 h)后，每份材料的一半(4盆)小麥植株轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)箱，進(jìn)行熱脅迫處理(37/17 ℃，14/10 h)至成熟；另一半小麥植株仍留在原培養(yǎng)箱，作為對(duì)照。小麥品系44播種時(shí)間為2016年9月14日，開花時(shí)間為2016年12月11日，對(duì)照組處理時(shí)間為2016年12月26日-2017年1月20日，熱脅迫處理時(shí)間為2016年12月26日至2017年1月18日；小麥品系94播種時(shí)間為2016年9月30日，開花時(shí)間為2017年1月3日，對(duì)照組處理時(shí)間為2017年1月18日至2017年2月14日，熱脅迫處理時(shí)間為2017年1月18日至2017年2月10日；CS春播種時(shí)間為2016年9月14日，開花時(shí)間為2016年12月12日，對(duì)照組處理時(shí)間為2016年12月27日至2017年1月21日，熱脅迫處理時(shí)間為2017年1月27日至2017年2月13日。日期記錄有前后1 d的誤差。取成熟穗用于實(shí)驗(yàn)分析。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 生育期與粒重統(tǒng)計(jì)

主莖抽穗后每天觀察、掛牌標(biāo)注每穗開花期，穗軸完全變黃時(shí)記錄成熟期，剪下成熟穗用于后續(xù)研究。選單穗分別脫粒稱重，計(jì)算平均千粒重。

1.2.2 小麥籽粒淀粉顆粒的觀察和粒徑的統(tǒng)計(jì)

取各小麥品種(系)對(duì)照和熱脅迫處理的穗中部籽粒。用解剖刀在籽粒中部橫向斷開，使籽粒產(chǎn)生自然裂開的橫斷面，取厚度約3 mm的橫切片，直接將橫切片用黑色雙面膠粘在掃描電鏡樣品臺(tái)上，自然斷裂的橫斷面向上，使用離子濺射儀鍍金膜后，用JEOL JSM-6360LV掃描電鏡對(duì)籽粒橫斷面胚乳淀粉進(jìn)行觀察并拍照。均勻選取籽粒橫截面各部分(約15個(gè)視野)進(jìn)行觀察拍照，每個(gè)材料的熱脅迫處理與對(duì)照至少取三個(gè)樣品進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。

每個(gè)材料每種處理下約拍攝50張照片(×700)，使用圖像分析軟件Image J測(cè)量每張圖片中所有的完整可見淀粉顆粒(除去極小和變形的淀粉顆粒)最大直徑。為了比較各實(shí)驗(yàn)材料不同條件下淀粉顆粒粒徑的變化趨勢(shì)，從測(cè)得的所有粒徑數(shù)據(jù)中按比例選取相同的數(shù)據(jù)量(約1 000個(gè)左右)繪制粒徑曲線圖。

1.2.3 籽?？偟矸酆康臏y(cè)定

將小麥籽粒置于研缽內(nèi)研磨成粉，過0.5 mm篩，取100 mg使用總淀粉試劑盒(K-TSTA,Megazyme,Wicklow,Ireland)測(cè)定總淀粉含量[25]，每個(gè)樣品三次重復(fù)。

1.2.4 直鏈淀粉/支鏈淀粉比例的測(cè)定

將小麥籽粒置于研缽內(nèi)研磨成粉，過180 μm篩，取20.0～25.0 mg用直鏈淀粉/支鏈淀粉淀粉試劑盒(K-AMYL,Megazyme,Wicklow,Ireland)測(cè)定籽粒直鏈淀粉的含量(%，w/w)[26]，并計(jì)算出直/支比，每個(gè)樣品三次重復(fù)。

1.2.5 每千粒直鏈淀粉和支鏈淀粉積累量的計(jì)算

直鏈淀粉積累量=千粒重×總淀粉含量×直鏈淀粉的含量

支鏈淀粉積累量=千粒重× 總淀粉含量×(1-直鏈淀粉的含量)

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；T測(cè)驗(yàn)用于檢測(cè)差異顯著性；用Excel 2013制作淀粉顆粒粒徑分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌漿期高溫對(duì)小麥籽粒發(fā)育的影響

熱脅迫后，各品種(系)的灌漿期都不同程度縮短，其中熱敏感材料94和中國(guó)春縮短幅度較大，但差異不顯著(表1)。熱脅迫導(dǎo)致熱敏感材料94和中國(guó)春的粒重顯著下降，但并未引起耐熱材料44粒重發(fā)生顯著變化。這表明熱脅迫對(duì)熱敏感小麥的灌漿過程產(chǎn)生了顯著影響。

2.2 灌漿期高溫對(duì)小麥籽粒淀粉含量及直/支比的影響

與對(duì)照相比，熱脅迫下，耐熱材料44及熱敏感材料94和CS的籽?？偟矸酆糠謩e下降1.39%、5.89%和5.98%，其中44變化不顯著，94和CS變化均極顯著(表2)。這表明熱脅迫對(duì)熱敏感小麥品種的淀粉積累造成顯著影響。

熱脅迫后，耐熱材料44的直鏈淀粉含量較對(duì)照極顯著減少，而兩個(gè)熱敏感材料94和CS均極顯著增加；44的直/支比間顯著下降，而熱敏感材料均極顯著上升(表2)。這說明熱脅迫對(duì)耐熱性不同小麥的直鏈和支鏈淀粉合成的影響顯著不同。

表1 不同小麥品種(系)在熱脅迫和對(duì)照條件下的灌漿期時(shí)間、千粒重和灌漿速率Table 1 Grain filling duration,thousand kernel weight and filling rate under heat stress

*和**分別表示同一材料不同處理間差異顯著。表2、表3同。

* and ** indicate the significant difference between heat stress and control for a same material at 0.05 and 0.01 levels,respectively.The same in table 2 and table 3.

2.3 灌漿期高溫對(duì)小麥籽粒直鏈淀粉與支鏈淀粉積累量的影響

熱脅迫后小麥籽粒直鏈淀粉和支鏈淀粉積累量較對(duì)照都極顯著下降，其中支鏈淀粉降幅較大。不同耐熱性小麥材料支鏈淀粉積累量對(duì)熱脅迫的反應(yīng)不同(表3)，熱脅迫后耐熱材料44僅減少2.03%，熱敏感材料94和CS分別下降20.25%和32.7%。這表明高溫脅迫下小麥籽粒支鏈淀粉合成的減少是千粒重降低的主要因素，而且支鏈淀粉變化程度與品種(系)耐熱性相關(guān)。

2.4 灌漿期高溫對(duì)小麥籽粒淀粒粒徑的影響

三個(gè)小麥材料的籽粒淀粉粒徑在2～35 μm的范圍內(nèi)變化(圖1)。對(duì)照條件下，熱敏感材料粒徑為8～14μm的淀粉粒極少；耐熱材料44的淀粉粒中A型和B型淀粉粒之間的分界不明顯，粒徑為8～14 μm的淀粉顆粒明顯多于熱敏感品種(系)。熱脅迫后，耐熱品系44的淀粉粒徑?jīng)]有明顯改變；而熱敏感材料94和CS的A型淀粉顆粒的粒徑明顯減小，粒徑為8～14 μm的淀粉粒增多(圖1和圖2)。這些結(jié)果表明，不同耐熱性小麥的淀粉粒徑分布對(duì)熱脅迫的反應(yīng)存在顯著差異。

表2 對(duì)照和熱脅迫條件下供試小麥總淀粉含量、直鏈淀粉比例和直/支比Table 2 Changes in starch composition under heat stress

*：P<0.05;**:P<0.01.

圖1 熱脅迫對(duì)小麥籽粒淀粉顆粒粒徑的影響

表3 熱脅迫后小麥材料籽粒中直鏈淀粉及支鏈淀粉積累量的變化Table 3 Changes of amylose and amylopectin weight per 1 000 grains of each wheat lines after heat stress

**：P<0.01.

黑色箭頭指示熱脅迫條件下中間大小(8～14 μm)的淀粉粒。A：對(duì)照條件下小麥材料44的籽粒淀粉顆粒；B：熱脅迫條件下小麥材料44的籽粒淀粉顆粒；C：對(duì)照條件下小麥材料94的籽粒淀粉顆粒；D：熱脅迫條件下小麥材料94的籽粒淀粉顆粒； E：對(duì)照條件下CS的籽粒淀粉顆粒；F：熱脅迫條件下CS的籽粒淀粉顆粒。

The black arrows indicate the intermediate granules. A:Grain starch granules of wheat material 44 under control condition;B:Grain starch granules of wheat material 44 under heat stress; C:Grain starch granules of wheat material 94 under control condition;D:Grain starch granules of wheat material 94 under heat stress; E:Grain starch granules of Chinese Spring wheat under control condition;D:Grain starch granules of Chinese spring wheat under heat stress.

圖2熱處理對(duì)小麥籽粒胚乳淀粉顆粒的影響

Fig.2Grainstarchgranulealterationsinheatstress

3 討 論

淀粉是小麥籽粒的主要組成部分，其變化直接影響小麥的粒重與品質(zhì)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫處理后，小麥籽粒的總淀粉、直鏈淀粉含量均呈下降趨勢(shì)。但不同耐熱性小麥的直/支比變化存在差異，耐熱小麥的直/支比下降，而熱敏感小麥表現(xiàn)則相反，推測(cè)可能熱敏感小麥籽粒中支鏈淀粉比直鏈淀粉下降更為顯著。本研究結(jié)果表明，支鏈淀粉合成過程更容易受到熱脅迫影響，這與前人的研究結(jié)果一致[12,16-17,20]。

熱脅迫對(duì)小麥籽粒淀粉顆粒的大小也有影響[16,27]。Wang等發(fā)現(xiàn)，在熱脅迫下，A型淀粉顆粒數(shù)量和粒徑均有所降低，B型淀粉顆粒的粒徑變小，數(shù)量增多[17,20]，這與HURKMAN等[20]的研究結(jié)果一致。在本研究中，熱脅迫處理后，熱敏感小麥的A型淀粉顆粒粒徑降低，但一些中間型淀粉顆粒(8～14 μm)的數(shù)量顯著增加；而耐熱小麥品系淀粉粒粒徑?jīng)]有明顯改變。A型顆粒的合成在開花后4 d開始，生長(zhǎng)和發(fā)育階段持續(xù)約20 d；而B型顆粒合成始于開花后10 d，開花后20 d開始有明顯的顆粒生長(zhǎng)[28]。Evers[29]觀察發(fā)現(xiàn)，A型淀粉粒先形成一個(gè)核，然后再一層一層裝配，直至形成大的A型淀粉粒。因此，本研究推測(cè)這些中間型淀粉顆粒應(yīng)屬于A型淀粉顆粒，熱脅迫阻礙了其裝配增大過程，一方面導(dǎo)致A型淀粉粒粒徑減小，另一方面導(dǎo)致中等大小的淀粉粒堆積，數(shù)目增多，這些中等高大小淀粉粒在正常條件下本可以繼續(xù)一層層裝配成更大的A型淀粉粒。有趣的是，在正常條件下，耐熱小麥存在更多的中等大小淀粉顆粒，熱脅迫后淀粉顆粒大小變化不顯著，這表明不同耐熱性小麥的淀粉顆粒的對(duì)熱脅迫的響應(yīng)存在差異。在未來的研究中，這種特征可被用來篩選耐熱小麥種質(zhì)。此外，B型顆粒粒徑似乎不受熱脅迫的影響，表明具有高比例的B型顆粒的小麥也可能表現(xiàn)出更好的耐熱性，但需要進(jìn)一步研究證明。

目前，有關(guān)熱脅迫對(duì)小麥淀粉顆粒影響的研究較多，但不同的研究結(jié)果不一，這可能與所選小麥品種本身的耐熱性相關(guān)。本研究以不同耐熱性小麥為研究材料，證實(shí)了不同耐熱性小麥響應(yīng)熱脅迫的方式存在差異。其中，A型淀粉在對(duì)熱脅迫應(yīng)答中是不同小麥材料的一個(gè)重要特征，這為高溫下小麥淀粉積累過程提供了新的理解，也為今后小麥耐熱研究工作奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

[1] LOBELL D B,TEBALDI C.Getting caught with our plants down:the risks of a global crop yield slowdown from climate trends in the next two decades [J].EnvironmentalResearchLetters,2014,9(7):74003.

[2] TACK J,BARKLEY A,NALLEY L L.Effect of warming temperatures on US wheat yields [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2015,112(22):6931.

[3] SEMENOV M A,SHEWRY P R.Modelling predicts that heat stress,not drought,will increase vulnerability of wheat in Europe [J].ScientificReports,2011,1:66.

[4] UR REHMAN A,HABIB I,AHMAD N,etal.Screening wheat germplasm for heat tolerance at terminal growth stage [J].PlantOmics,2009,2(1):9.

[5] SCAFARO A P,ATKIN O K.The impact of heat stress on the proteome of crop species [M].Agricultural Proteomics Volume 2.Springer,2016:155.

[6] WOLLENWEBER B,PORTER J R,SCHELLBERG J.Lack of interaction between extreme high-temperature events at vegetative and reproductive growth stages in wheat [J].JournalofAgronomyandCropScience,2003,189(3):142.

[7] STRATONOVITCH P,SEMENOV M A.Heat tolerance around flowering in wheat identified as a key trait for increased yield potential in Europe under climate change [J].Journalofexperimentalbotany,2015,66(12):3599.

[8] FAROOQ M,BRAMLEY H,PALTA J A,etal.Heat stress in wheat during reproductive and grain-filling phases [J].CriticalReviewsinPlantSciences,2011,30(6):491.

[9] TINGLEY M P,HUYBERS P.Recent temperature extremes at high northern latitudes unprecedented in the past 600 years [J].Nature,2013,496(7444):201.

[10] DJANAGUIRAMAN M,PRASAD P V V.Ethylene production under high temperature stress causes premature leaf senescence in soybean [J].FunctionalPlantBiology,2010,37(11):1071.

[11] PRASAD P V V,PISIPATI S R,MOMCILOVIC I,etal.Independent and combined effects of high temperature and drought stress during grain filling on plant yield and chloroplast ef-tu expression in spring wheat [J].JournalofAgronomyandCropScience,2011,197(6):430.

[12] ZHAO H,DAI T,JIANG D,etal.Effects of high temperature on key enzymes involved in starch and protein formation in grains of two wheat cultivars [J].JournalofAgronomy&CropScience,2008,194(1):47.

[13] HURKMAN W J,MCCUE K F,ALTENBACH S B,etal.Effect of temperature on expression of genes encoding enzymes for starch biosynthesis in developing wheat endosperm [J].PlantScience,2003,164(5):873.

[14] THITISAKSAKUL M,JIM NEZ R C,ARIAS M C,etal.Effects of environmental factors on cereal starch biosynthesis and composition [J].JournalofCerealScience,2012,56(1):67.

[15] SLADE A J,MCGUIRE C,LOEFFLER D,etal.Development of high amylose wheat through TILLING [J].BMCPlantBiology,2012,12(1):1.

[16] LIU P,GUO W,JIANG Z,etal.Effects of high temperature after anthesis on starch granules in grains of wheat(TriticumaestivumL.) [J].JournalofAgriculturalScience,2011,149(2):159.

[17] WANG X,CAI J,LIU F,etal.Pre-anthesis high temperature acclimation alleviates the negative effects of post-anthesis heat stress on stem stored carbohydrates remobilization and grain starch accumulation in wheat [J].JournalofCerealScience,2012,55(3):331.

[18] 趙 輝,戴廷波,荊 奇,等.灌漿期高溫對(duì)兩種品質(zhì)類型小麥品種籽粒淀粉合成關(guān)鍵酶活性的影響[J].作物學(xué)報(bào),2006,32(3):423.

HAO H,DAI T B,JING Q,etal.Effects of high temperature during grain filling on key enzymes involved in starch synthesis in two wheat cultivars with different quality types [J].ActaAgronomicaSinica,2006,32(3):423.

[19] 周續(xù)蓮,康建宏,吳宏亮,等.花后高溫對(duì)春小麥籽粒淀粉含量及產(chǎn)量的影響研究 [J].種子,2012,31(2):5.

ZHOU X L,KANG J H,WU H L,etal.Study on the effect of high temperature after anthesison starch formation and yield in spring wheat [J].Seed,2012,31(2):5.

[20] HURKMAN W J,MCCUE K F,ALTENBACH S B,etal.Expression of genes for starch biosynthesis is regulated by high temperaturein developing wheat endosperm [J].PlantScience,2003,164(5):873.

[21] PANOZZO J F,EAGLES H A,PANOZZO J F,etal.Cultivar and environmental effects on quality characters in wheat.I.Starch [J].Crop&PastureScience,1998,49(5):629.

[22] PENG M,GAO M,ESM A A,etal.Separation and characterization of A- and B-type starch granules in wheat endosperm [J].CerealChemistry,1999,76(3):375.

[23] BANCEL E,ROGNIAUX H,DEBITON C,etal.Extraction and proteome analysis of starch granule-associated proteins in mature wheat kernel(TriticumaestivumL.) [J].JournalofProteomeResearch,2010,9(6):3299.

[24] ZHANG C,DONG J,LIU F,etal.Starch granules size distribution in superior and inferior grains of wheat is related to enzyme activities and their gene expressions during grain filling [J].JournalofCerealScience,2010,51(2):226.

[25] MCCLEARY B V,GIBSON T S,MUGFORD D C.Measurement of total starch in cereal products by amyloglucosidase-alpha-amylase method:collaborative study [J].JournalofAoacInternational,1997,80(3):571.

[26] GIBSON T S,SOLAH V A,MCCLEARY B V.A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A [J].JournalofCerealScience,1997,25(2):111.

[27] LU H,WANG C,GUO T,etal.Starch composition and its granules distribution in wheat grains in relation to post-anthesis high temperature and drought stress treatments [J].Starch-Starke,2013,66(5-6):419.

[28] SHINDE S V,NELSON J E,HUBER K C.Soft wheat starch pasting behavior in relation to A- and B-type granule content and composition [J].CerealChemistry,2003,80(1):91.

[29] SC A D E M.Scanning electron microscopy of wheat starch.III.Granule development in the endosperm [J].Starch-Starke,1971,23(5):157.