鼻息肉組織樹突狀細胞亞群的初步研究及意義

莊夏衍 王揮戈 林歆勝 李創(chuàng)偉

鼻息肉是耳鼻咽喉科常見的疾病之一,具有發(fā)病率較高（我國 2%～8%）[1，2]，復(fù)發(fā)傾向強（術(shù)后復(fù)發(fā)率15%～40%）的特點[3]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示：鼻息肉高發(fā)病率及高復(fù)發(fā)率，直接或間接增加經(jīng)濟負擔，并嚴重影響患者的生活質(zhì)量[4]。

大量的研究發(fā)現(xiàn)，鼻息肉是由各種免疫細胞及炎癥細胞參與的持續(xù)慢性炎癥反應(yīng)的疾病[5]。鼻息肉組織中輔助性T細胞 (heleper T cell,Th)發(fā)生極化，存在Th1細胞和Th2細胞的絕對數(shù)量增多、Th1/Th2比例失衡和Th細胞因子分泌優(yōu)勢發(fā)生改變。但究竟什么因素促使Th細胞極化？哪種亞型及細胞因子占優(yōu)勢？目前仍存有分歧，無統(tǒng)一定論。

樹突狀細胞（Dendritic cell,DC）是目前已知體內(nèi)功能最強、唯一能直接激活靜息T細胞的抗原提呈細胞，在機體免疫系統(tǒng)中處于核心地位。人DCs根據(jù)其表型分為兩個亞群：髓系DCs（mDCs）和淋巴系 DCs（pDCs）[6，7]，也可以根據(jù)功能分成兩個亞群，誘導(dǎo) Th1的DCs亞群（DC1s）和誘導(dǎo) Th2的 DCs亞群（DC2s）。在過去幾十年，mDCs和pDCs被認為分別代表 DC1s和 DC2s[8，9]。CD11C和 CD123是區(qū)分人類DC1和 DC2的主要標志[10，11]，它們在免疫應(yīng)答中各自起著獨特而又互補的作用[8，12]。研究認為，Th細胞的分化是由DC控制的，DC亞群能夠推進CD4和CD8的應(yīng)答，DC1與DC2分別誘導(dǎo)Th細胞分化為Th1和Th2，從而調(diào)節(jié) Th1/Th2的偏向[13]。

已有研究證實鼻息肉組織中DC明顯增多[14，15]。我們采用連續(xù)切片免疫組化方法，檢測鼻息肉中CD11c和CD123的表達情況，探討CD11c+DC(DC1)和CD123+DC(DC2)亞群在鼻息肉發(fā)病機理中的意義。

資料與方法

1 一般資料

鼻息肉組：接受鼻內(nèi)鏡手術(shù)的鼻息肉患者。共30例，男 16例，女 14例，年齡 18～66歲，平均（37±16）歲。如有以下情況即被排除出此研究：單側(cè)病變、上頜竇后鼻孔息肉、纖毛不動綜合征、鼻竇手術(shù)史、哮喘史、阿司匹林耐受不良史及全身嚴重疾病史。術(shù)前2周內(nèi)無全身或局部使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及任何種類鼻噴劑。

下鼻甲黏膜組：接受鼻中隔矯正術(shù)的患者共30例，男 20例，女 10例，年齡 18～59歲，平均（30±12）歲。選擇標準：術(shù)中正常下鼻甲組織，既往無變應(yīng)性鼻炎、慢性鼻竇炎、鼻息肉及全身嚴重疾病史。

2 試劑及儀器

鼠抗人Integrin X(CD11c)、鼠抗人IL-3R(CD123)（Santa Cruz公司產(chǎn)品）；DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；PV-6002二步法免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）

3 實驗方法

收取標本后修剪成1cm×1cm×1cm大小的組織塊，用10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋切片。鼻息肉組每張切片HE常規(guī)染色。以同一標本兩張連續(xù)切片分別采用免疫組織化學(xué)二步法檢測CD11c、CD123。

4 結(jié)果觀察和判定

在光學(xué)顯微鏡下，觀察HE染色后鼻息肉組織內(nèi)炎性細胞浸潤情況（圖1，圖2）。

圖1 鼻息肉組織HE染色（標尺：100μm）

圖2 鼻息肉組織HE染色（標尺：100μm）

選擇乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)標本作為陽性對照，以PBS替代一抗作陰性對照。以背景清晰、胞漿染成淡黃色、棕黃色為陽性細胞。每張切片在低倍鏡下隨機選取DC分布最密集的10個區(qū)，更換至高倍鏡(HPF×400)，計數(shù)10個高倍視野內(nèi)DC的總數(shù)代表該標本切片DC的浸潤程度。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

運用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。CD11c、CD123分別在實驗組和對照組中表達的陽性率比較采用四格表卡方檢驗。數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗后，實驗組CD11c+DC與CD123+DC的比較采用配對卡方檢驗和配對樣本t檢驗。均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 HE染色光鏡觀察結(jié)果

以淋巴細胞、漿細胞浸潤為主的標本達70%，以嗜酸性粒細胞浸潤為主的標本僅占30%。

2 CD11c的表達情況

CD11c+DC胞膜有明顯微狀突起，胞體較大，胞漿呈淡黃色或棕黃色，核多偏位，在鼻息肉組織上皮下基底部和腺體周圍分布較多，間質(zhì)中有少量散在分布（圖3）。在對照組中，僅有極少量CD11c+DC在上皮下基底部和腺體周圍分布（圖4），63.3%的標本甚至沒有陽性細胞出現(xiàn)。

圖3 CD11C+DC在鼻息肉組織中的分布（標尺：50μm）

圖4 CD11C+DC在正常下鼻甲黏膜中的分布（標尺：50μm）

CD11c在鼻息肉組的表達與對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（a＝0.05，P＜0.01）（表 1）。

表1 CD11c在鼻息肉組織和正常下鼻甲黏膜中的表達情況的比較

圖5 CD123+DC在鼻息肉組織中的分布（標尺：50μm）

CD123在鼻息肉組的表達與對照組比較，差異有高度統(tǒng)計意義（a＝0.05，P＜0.01）（表 2）。

表2 CD123在鼻息肉組織和正常下鼻甲黏膜中的表達情況

3 CD123的表達情況

CD123陽性細胞均具有DC2特殊細胞形態(tài)，呈卵圓形，體積較CD11c陽性細胞小，胞質(zhì)呈棕黃色，核略偏位，在鼻息肉組織上皮下基底部和腺體周圍分布較多，間質(zhì)中有少量散在分布（圖5），而在對照組中，僅有極少量分布在血管和腺體周圍，有的甚至幾乎沒有表達（圖6）。

圖6 CD123+DC在下鼻甲黏膜中的分布（標尺：50μm）

4 CD11c與CD123鼻息肉組織中表達情況的比較

在鼻息肉組織中，CD11c與CD123的陽性表達情況相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。高倍視野下，計數(shù)鼻息肉組CD11c+DC的平均數(shù)目為109.57/10HPF，CD123+DC計數(shù)平均為 89.74/10HPF。鼻息肉組織中CD11c+DC的細胞數(shù)明顯高于CD123+DC，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表 4）。

表3 鼻息肉中CD11c與CD123表達情況的比較

表4 鼻息肉組織中CD11c+DC與CD123+DC分布情況的比較

討論

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)我國鼻息肉的組織病理學(xué)特征與全球其他地區(qū)存在著顯著差異，國內(nèi)不同地區(qū)鼻息肉的免疫病理特征也存在差異。如北京和成都就有所不同，北京鼻息肉患者呈現(xiàn)Th2/Th1/Th17混合免疫模式，而成都的鼻息肉患者以Th2免疫反應(yīng)為主的比例則非常低。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)我國鼻息肉組織中以嗜酸性粒細胞浸潤為主的僅占30%。Lou等[17]發(fā)現(xiàn)我國鼻息肉組織以淋巴細胞及漿細胞浸潤為主。我們的實驗結(jié)果顯示，潮汕地區(qū)鼻息肉以淋巴細胞及漿細胞浸潤為主，約占70%，與上述看法基本一致。這說明不同人種及不同地區(qū)間鼻息肉確實存在組織病理學(xué)上的差異，需要我們進一步認識這種差異的內(nèi)在機制。

Th細胞是免疫應(yīng)答中的核心淋巴細胞，當機體受抗原刺激時，Th0細胞在DC細胞和巨噬細胞的協(xié)助下激活，向Thl細胞或Th2細胞轉(zhuǎn)化并分泌多種細胞因子。Th1細胞主要參與細胞免疫應(yīng)答；Th2細胞主要促進體液免疫應(yīng)答，其分泌的細胞因子可促使嗜酸性粒細胞的集聚和活化。Thl細胞和Th2細胞及其分泌的細胞因子在鼻息肉發(fā)病機理中的作用日益受到重視。大量的研究發(fā)現(xiàn)[18-21]，鼻息肉組織中Th細胞發(fā)生極化，鼻息肉組織中Th1、Th2細胞均顯著高于正常鼻黏膜，并存在Th1/Th2比例失衡，Th1細胞百分率明顯高于Th2細胞，但是Th2型細胞因子的表達具有普遍優(yōu)勢。炎性細胞和細胞因子相互作用，發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)抗炎效應(yīng)，使鼻黏膜的免疫反應(yīng)性呈活化和擴大狀態(tài)，但由于局部炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，致使炎性細胞在發(fā)揮局部保護作用的同時又造成組織的損傷，加重局部的炎癥反應(yīng)，最終形成了鼻息肉。這提示我們，病因的多元性導(dǎo)致了免疫反應(yīng)的復(fù)雜性，鼻息肉是一類由體液免疫和細胞免疫共同參與的多種免疫機制異常的疾病。但究竟什么因素促使Th細胞極化？什么決定了哪種亞型及細胞因子占優(yōu)勢？目前無統(tǒng)一定論。

樹突狀細胞（DC）是目前已知體內(nèi)功能最強的、唯一能激活初始型T細胞的專職抗原提呈細胞，是機體免疫應(yīng)答的始動者[22，23]，是機體免疫系統(tǒng)中一類不可缺少的免疫細胞。DC能調(diào)節(jié)機體對抗原產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答類型：細胞免疫或T細胞依賴的體液免疫（Th1/Th2型免疫反應(yīng)）。Rissoan等[8]認為，DC亞群才是決定Th細胞向Th1細胞或Th2細胞分化的主要驅(qū)動力。DC1/DC2比值的變化直接影響Th1/Th2細胞的分化，DC1/DC2能通過細胞因子精細地調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞的應(yīng)答平衡，維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。同時，DC亞群在誘導(dǎo)Th分化時存在負反饋調(diào)節(jié)機制，Th1/Th2細胞分別通過其分泌的細胞因子IFN-γ和IL-4作用于DC1/DC2，調(diào)控DC1/DC2的發(fā)育及比例，從而更精確地調(diào)節(jié)機體內(nèi)Th1細胞和Th2細胞免疫功能的動態(tài)平衡，使機體免疫處于穩(wěn)態(tài)。

我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，在鼻息肉組織中DC可通過一系列的細胞和體液免疫機制導(dǎo)致Th1/Th2細胞比例失衡[15]。因此，我們認為鼻息肉組織中Th1/Th2比例失衡只是一個現(xiàn)象，DC及其亞群才很可能是Th1/Th2失衡而致免疫應(yīng)答紊亂的動因，檢測患者鼻息肉組織中DC亞群DC1和DC2有助于我們了解鼻息肉的初始免疫狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，CD11c和CD123在鼻息肉組的表達均高于對照組，在鼻息肉組，CD11c和CD123的表達無明顯差異，但CD11c+DC與CD123+DC細胞數(shù)量的比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示鼻息肉組織中存在DC1/DC2混合模式，DC1和DC2通過分別誘導(dǎo)Th1型與Th2型免疫應(yīng)答，Th1/Th2型免疫應(yīng)答并存，DC1/DC2比例失衡導(dǎo)致鼻息肉組織Th1/Th2細胞比例失衡。DC1在鼻息肉組織中占優(yōu)勢主導(dǎo)地位，在DC1的主導(dǎo)作用下Thl亞群介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)占優(yōu)勢地位。本研究發(fā)現(xiàn)鼻息肉炎癥反應(yīng)的終極結(jié)果，其組織病理學(xué)上以淋巴細胞及漿細胞浸潤為主(約占70%)，也從因果關(guān)系上印證了DC1在鼻息肉中占優(yōu)勢主導(dǎo)地位這一結(jié)論。這個新的認識進一步拓展和延伸了以往單純關(guān)注細胞因子調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞平衡的視野，將鼻息肉發(fā)病機制的研究焦點從對Th細胞極化的研究上升到對DC1/DC2的產(chǎn)生、發(fā)育及調(diào)節(jié)的節(jié)點上來，把貫穿于鼻息肉發(fā)病過程的炎癥反應(yīng)追溯到了更上游的初級始動階段。簡而言之，就是鼻息肉研究的Th1/Th2階段進入了DC1/DC2階段。

展望未來，通過DC亞群對Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡這一關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點如何進行精細調(diào)節(jié)的深入研究，必將豐富和深化對鼻息肉發(fā)病機制，尤其是對DC始動介導(dǎo)炎癥反應(yīng)路線圖的認識，為鼻息肉的防治提供了新的思路和更精準的干預(yù)靶點。

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