分析海產(chǎn)品中磺胺類(lèi)藥物殘留的測(cè)定方法

秦艷芳，吳 昊

（1.長(zhǎng)治學(xué)院師范分院，山西 長(zhǎng)治 046000；2.山西師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004）

引言

在魚(yú)、蝦、蟹等海產(chǎn)品養(yǎng)殖期間，需要投放磺胺類(lèi)藥物來(lái)對(duì)細(xì)菌感染性疾病進(jìn)行預(yù)防與治療，磺胺類(lèi)藥物不僅能夠達(dá)到良好的抗菌效果，其自身還具備價(jià)格低、毒性少的優(yōu)勢(shì)。不過(guò)，當(dāng)磺胺類(lèi)藥物達(dá)到一定濃度時(shí)，仍會(huì)對(duì)人體健康造成損害，進(jìn)而影響人體的造血功能，引發(fā)溶血性貧血，特別是其中磺胺二甲基嘧啶等物質(zhì)，還會(huì)有潛在的致癌危險(xiǎn)。因此，需要建立高效的測(cè)定方法來(lái)對(duì)磺胺類(lèi)藥物殘留進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)前，我國(guó)對(duì)磺胺類(lèi)藥物的測(cè)定方法最常見(jiàn)的有氣相色譜法、免疫測(cè)定法、液相色譜法及氣-質(zhì)聯(lián)用法等。不過(guò)，這些測(cè)定方法往往只能對(duì)其中的幾種磺胺類(lèi)藥物進(jìn)行檢測(cè)，而磺胺類(lèi)藥物的種類(lèi)光是較為常見(jiàn)的就有幾十種，再加上其他種類(lèi)甚至多達(dá)數(shù)千種，因此僅僅依靠這些測(cè)定方法難以適用于對(duì)磺胺類(lèi)藥物的測(cè)定。為此，本文提出了一種超高效的檢測(cè)方法，即液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法來(lái)對(duì)磺胺類(lèi)藥物殘留進(jìn)行測(cè)定，它不僅靈敏度高，還能對(duì)獲得較高的回收率。本文便對(duì)這一測(cè)定方法進(jìn)行分析，以此明確這種測(cè)定方法的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

一、測(cè)定準(zhǔn)備工作

（一）測(cè)定材料及磺胺類(lèi)藥物的種類(lèi)

本次測(cè)定所選取的材料是以海產(chǎn)品中較為典型的日本對(duì)蝦、大菱鲆及三疣梭子蟹進(jìn)行磺胺類(lèi)藥物殘留的測(cè)定，這些測(cè)定材料均為市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，其余測(cè)定材料還包括試劑與超純水，測(cè)定試劑包括乙酸乙酯、乙酸銨、甲醇及甲酸，其中乙酸銨為優(yōu)級(jí)純，而甲酸試劑則為色譜純。本次測(cè)定中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法需要對(duì)21種磺胺類(lèi)藥物殘留進(jìn)行測(cè)定，這21種測(cè)定磺胺類(lèi)藥物的種類(lèi)包括：磺胺、磺胺噻唑、磺胺二甲基異惡唑、磺胺硝苯、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺醋酰、磺胺氯噠嗪、甲氧芐氨嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺二甲異嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺胍、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧嗪噠。

（二）測(cè)定儀器

該測(cè)定方法所選用的儀器有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、超聲波清洗器、超純水儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、氮吹儀及高速離心機(jī)。

（三）測(cè)定條件

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜需要調(diào)整色譜與質(zhì)譜，以此建立良好的測(cè)定條件，色譜條件包括對(duì)色譜柱的調(diào)整、流動(dòng)相的調(diào)整、流速的調(diào)整、柱溫的調(diào)整、進(jìn)樣量的調(diào)整及梯度洗脫程序的設(shè)定。色譜柱的寬度為2.1mm，長(zhǎng)度為100mm，測(cè)定精度為1.7μm；流動(dòng)相調(diào)整為每升乙酸銨溶液包含5摩爾0.1%體積分?jǐn)?shù)的甲酸；流速調(diào)整至0.25mL/min，柱溫調(diào)整到35℃，進(jìn)樣量調(diào)整至10μL；梯度洗脫程序的設(shè)定應(yīng)根據(jù)測(cè)定時(shí)間來(lái)對(duì)甲醇體積分?jǐn)?shù)、乙酸銨溶液體積分?jǐn)?shù)、梯度變化曲線(xiàn)進(jìn)行調(diào)整，如圖1所示。

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質(zhì)譜條件包括對(duì)電離方式及電壓的調(diào)整、離子源溫度的調(diào)整、脫溶劑氣溫度的調(diào)整、脫溶劑氣流量的調(diào)整、錐孔反吹氣流量的調(diào)整及其他參數(shù)的調(diào)整。其中，電離方式設(shè)定為ESI+；電離電壓設(shè)定為2.8千伏；離子源溫度設(shè)定為110攝氏度；脫溶劑氣溫度設(shè)定為350攝氏度、氣流量為700升每小時(shí)；錐孔反吹氣流量設(shè)定為50升每小時(shí)；其他參數(shù)的調(diào)整如圖2所示。

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（四）測(cè)定樣品及溶液的配置

1、樣品處理

在對(duì)這21種磺胺類(lèi)藥品進(jìn)行進(jìn)行測(cè)定之前，應(yīng)先對(duì)樣品進(jìn)行處理，首先，我們需要將測(cè)定樣品各稱(chēng)取5克放置到容積為50毫升的離心管當(dāng)中，并在離心管中放入15毫升的乙酸乙酯溶液，然后將其置于超聲波清洗器中處理1分鐘，取出后放入5克經(jīng)過(guò)灼燒處理以后的無(wú)水硫酸鈉并搖晃均勻，然后用超聲提取10分鐘，將其放入高速離心機(jī)中以每分鐘7000轉(zhuǎn)的速度處理5分鐘，取出后把調(diào)制好的乙酸乙酯溶液進(jìn)行合并，并放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行減壓濃縮，取出后摻入1毫升的甲醇與2毫升體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液對(duì)樣品進(jìn)行溶解，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的提取。樣品提取后，將樣品提取液放到到小柱當(dāng)中，然后安裝固相萃取裝置、機(jī)械泵，并將SPE裝置與HLB柱進(jìn)行連接后對(duì)樣品提取液進(jìn)行萃取，需要注意的是，流速應(yīng)不超過(guò)2毫升每分鐘，然后采用2毫升體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇溶液對(duì)小柱進(jìn)行淋洗，再采用10毫升的甲醇試劑進(jìn)行洗脫，此時(shí)，流速應(yīng)不超過(guò)2毫升每分鐘，然后對(duì)洗脫液進(jìn)行收集，將其放入氮吹儀中用35℃的水浴氮?dú)鈱?duì)洗脫液進(jìn)行吹干。吹干后用1毫升流動(dòng)相定容，并放入0.2微米的濾膜來(lái)對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的凈化，凈化以后方能對(duì)樣品進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

2、儲(chǔ)備液、中間液及工作液的配置

在進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定之前，需要提前稱(chēng)取磺胺類(lèi)藥品各0.01克，然后用甲醇試劑對(duì)藥品進(jìn)行溶解，使其配置成為濃度為100毫克每升的儲(chǔ)備液，并放入到冰箱中進(jìn)行儲(chǔ)存。中間液的配置需要利用甲醇試劑來(lái)配置為磺胺類(lèi)藥物濃度為10毫克每升的溶液。工作液的配置應(yīng)分別進(jìn)行稀釋?zhuān)?使其成為 1μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、10μg/L 的工作液，當(dāng)要對(duì)工作液進(jìn)行臨時(shí)使用時(shí)，應(yīng)將其配制添加到空白基質(zhì)當(dāng)中，并且每次測(cè)定應(yīng)抽取10μL的工作液進(jìn)行測(cè)定。

二、測(cè)定方法

本次測(cè)定通過(guò)在測(cè)定過(guò)程中摻入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸試劑，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)流動(dòng)相PH值的調(diào)節(jié)，從而確保測(cè)定過(guò)程中的磺胺類(lèi)藥物組分能夠進(jìn)行分離，并通過(guò)在水相中摻入濃度為0.5mol/L的乙酸銨試劑，實(shí)現(xiàn)對(duì)各磺胺類(lèi)藥物組分的保留，并能對(duì)各組分峰形進(jìn)行大幅度改善。依據(jù)所測(cè)定磺胺類(lèi)藥物21種組分的分子結(jié)構(gòu)，測(cè)定電離方式設(shè)定為ESI+，并將這21種磺氨類(lèi)藥物的組分分別配制成1ng/mL的甲醇溶液，然后利用串聯(lián)質(zhì)譜儀來(lái)掃描離子峰值，并以此作為基礎(chǔ)對(duì)其分別進(jìn)行母離子二級(jí)質(zhì)譜分析，以此明確質(zhì)譜中信號(hào)最強(qiáng)的兩種碎片離子，將子離子與母離子進(jìn)行組合，使其成為離子對(duì)并進(jìn)行監(jiān)測(cè)，然后通過(guò)MRM來(lái)對(duì)樣品定性及定量進(jìn)行分析。為了使測(cè)定的靈敏度更高，本次測(cè)定將MRM程序設(shè)定為七個(gè)，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)這21種磺胺類(lèi)藥物組分的出峰時(shí)間所產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行收集。本次實(shí)驗(yàn)所選取的試劑包括乙酸乙酯、二氯甲烷及乙腈，用來(lái)對(duì)海產(chǎn)品中的磺胺類(lèi)藥物進(jìn)行分別提取，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比。此外，本次試驗(yàn)對(duì)樣品凈化條件進(jìn)行了選擇，并對(duì)C18固相萃取小柱與HLB小柱進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，最終確定由Qasis HLB來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的凈化，并采取將磺氨標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至空白基質(zhì)的方式來(lái)對(duì)線(xiàn)性范圍進(jìn)行確定。本次試驗(yàn)將日本對(duì)蝦、大菱鲆及三疣梭子蟹這三類(lèi)海產(chǎn)品作為研究對(duì)象，對(duì)其回收率、檢出限、線(xiàn)性范圍及精密度進(jìn)行研究，并在樣品中分別添加了三種磺胺類(lèi)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，回收率及精密度計(jì)算中均重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，檢出限以3倍信噪比為準(zhǔn)，定量限以10倍信噪比為準(zhǔn)。

三、測(cè)定結(jié)果

通過(guò)對(duì)七個(gè)MRM程序中21種磺胺信號(hào)的出峰時(shí)間信號(hào)進(jìn)行收集，并利用串聯(lián)質(zhì)譜儀來(lái)進(jìn)行掃描，掃描譜圖結(jié)果如圖3所示。

圖3 21種磺胺類(lèi)藥物信號(hào)出峰時(shí)間掃描譜圖

依據(jù)出峰順序來(lái)進(jìn)行排列，從左至右依次為：磺胺、磺胺噻唑、磺胺二甲基異惡唑、磺胺硝苯、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺醋酰、磺胺氯噠嗪、甲氧芐氨嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺二甲異嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺胍、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧嗪噠。

經(jīng)過(guò)測(cè)定結(jié)果表明，在乙酸乙酯、二氯甲烷及乙腈試劑分別對(duì)海產(chǎn)品中的21種磺胺類(lèi)藥物提取中，二氯甲烷的提取率最低，而乙酸乙酯與乙腈試劑的提取效率則相對(duì)較高。在利用Qasis HLB對(duì)樣品進(jìn)行凈化時(shí)，凈化效果效好，樣品回收率高，且操作要求低，能夠非常容易的進(jìn)行重復(fù)操作。經(jīng)過(guò)對(duì)線(xiàn)性范圍的確定，并以磺胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)將其添加到空白基質(zhì)當(dāng)中，使其成為標(biāo)準(zhǔn)區(qū)線(xiàn)，經(jīng)過(guò)測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)線(xiàn)性范圍處于1至1004μg/L時(shí)，效果最好。對(duì)日本對(duì)蝦、大菱鲆及三疣梭子蟹的線(xiàn)性范圍、精密度、檢出限及回收率進(jìn)行測(cè)定時(shí)，測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量至1至5μg/Kg時(shí)，日本對(duì)蝦及大菱鲆樣品中的21種磺胺藥物平均回收率均在68%至82%，回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在4.1%至11.8%。以10倍信噪比作為定量限測(cè)定時(shí)，定量限均不超過(guò)1.0μg/Kg，以3倍信噪比作為檢出限測(cè)定時(shí)，檢出限均不超過(guò)0.5μg/Kg。這三種海產(chǎn)品的21種磺胺類(lèi)藥物殘留測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

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四、討論

通過(guò)對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析可知，由于磺胺類(lèi)藥物組分耐熱能力較差，而乙腈試劑的沸點(diǎn)則相對(duì)較高，這就使磺胺類(lèi)藥物濃縮時(shí)增加很大難度，而在用乙酸乙脂進(jìn)行濃縮時(shí)，回收率較好，并且SPE凈化以后不會(huì)出現(xiàn)干擾問(wèn)題，因此選擇乙酸乙酯試劑最佳。在對(duì)樣品凈化時(shí)，由于磺胺類(lèi)的PH值偏向于弱減性，而僅靠溶液的方式是很難去除掉樣品中的干擾物質(zhì)的，從理論上來(lái)講，固相萃取小柱與HLB小柱都適用于對(duì)磺胺類(lèi)藥物的凈化，不過(guò)，比較適用于非極性至中極性的磺胺類(lèi)藥物凈化，而HLB小柱則本身有親脂親水性，因而不存在抽干問(wèn)題，碳鏈也不會(huì)產(chǎn)生塌陷現(xiàn)象，因此，HLB小柱對(duì)樣品的凈化效果更好。從圖3中我可以看出，這種測(cè)定方法的靈敏度很高，通過(guò)對(duì)質(zhì)譜與色譜的調(diào)整，能夠極大程度的提高21種磺胺類(lèi)藥物組分的響應(yīng)值。此外，如果對(duì)噪音進(jìn)行降低，并選取等級(jí)更高的試劑，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的檢出限將更加精確，也將更能滿(mǎn)足對(duì)海產(chǎn)品磺胺類(lèi)藥物的殘留檢測(cè)要求，而這種超高效的測(cè)定方法，有效彌補(bǔ)了國(guó)內(nèi)測(cè)定種類(lèi)少，靈敏度不高的缺陷，因此極具應(yīng)用價(jià)值。

結(jié)語(yǔ)

本次測(cè)定方法將日本對(duì)蝦、大菱鲆及三疣梭子蟹這三類(lèi)海產(chǎn)品作為測(cè)定樣本，通過(guò)利用乙酸乙酯試劑來(lái)對(duì)21種磺胺類(lèi)藥物組分進(jìn)行提取，并用HLB小柱其進(jìn)行凈化，以小柱作為色譜柱，通過(guò)采用乙酸銨溶液及甲醇試液作為流動(dòng)相，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀來(lái)對(duì)這三種海產(chǎn)品中的21項(xiàng)磺胺類(lèi)藥物組分殘留進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，并依據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)及時(shí)間的差異性來(lái)對(duì)其進(jìn)行定性與定量分析，從而取得良好的檢測(cè)效果。該測(cè)定方法與氣-質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法、免疫測(cè)定法的優(yōu)勢(shì)相比較，氣-質(zhì)聯(lián)用法具備極強(qiáng)的分離能力，但對(duì)未知化合物的定性能力不足。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法則充分結(jié)合了氣-質(zhì)聯(lián)用法的分離優(yōu)勢(shì)，并且彌補(bǔ)了對(duì)未知化合物定性能力不足的缺陷。高效液相色譜法具備反復(fù)使用、易回收及樣品不被破壞等優(yōu)點(diǎn)，但它的缺點(diǎn)也非常明顯，就是柱外效應(yīng)，分離物質(zhì)的擴(kuò)散與滯留現(xiàn)象都會(huì)使高效液相色譜法的靈敏度受到影響，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法則具備易回收、樣品不被破壞的優(yōu)勢(shì)，雖然靈敏度會(huì)受到流動(dòng)相試劑等級(jí)與噪音的影響，但不會(huì)受到分離物質(zhì)擴(kuò)散與滯留現(xiàn)象的影響。免疫測(cè)定法具備操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，但缺點(diǎn)是其應(yīng)用范圍十分有限。而該測(cè)定方法的重現(xiàn)性較好，線(xiàn)性范圍非常寬，因此更適合對(duì)海產(chǎn)品磺胺類(lèi)藥物進(jìn)行測(cè)定。更重要的是，以上三種方法都只能對(duì)其中幾種磺胺類(lèi)藥物殘留進(jìn)行測(cè)定，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法則能同時(shí)對(duì)上述21種磺胺類(lèi)藥物殘留進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，因此其應(yīng)用前景十分廣闊。

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