穩(wěn)定同位素技術(shù) 在蜂蜜真實性溯源中的研究進展

佘 僧,李 熠,宋洪波,陳蘭珍,*

(1.福建農(nóng)林大學,福建福州 350002; 2.中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093 3.農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京 100093 4.農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(北京)，北京 100093)

蜂蜜是蜜蜂通過口器吸取植物蜜腺中的花蜜或其他甜味分泌物,存入自身蜜囊攜帶回蜂巢中儲存,經(jīng)過一周時間,在內(nèi)勤蜂的吞吐中釀制成熟[1]。主要營養(yǎng)成分有糖、氨基酸、礦物質(zhì),揮發(fā)性酸、維生素及各種活性酶等[2]。蜂蜜醫(yī)藥價值有大量文料記載?！侗静菥V目》中蜂蜜注解有清熱、補中、解毒、潤燥四大醫(yī)藥功效?，F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn),適當食用蜂蜜可以防治胃腸道[3]、咽喉等疾病[4],改善睡眠質(zhì)量[5],治療感染性創(chuàng)傷[6],以及美容養(yǎng)顏等[7]。蜂蜜對于改善食品色澤、口感和香味也有顯著效果,由此蜂蜜加工制品也不斷增多如蜂蜜蛋糕、蜂蜜酒[8]等。蜂蜜醫(yī)藥、感官、加工等優(yōu)勢,使得其需求量不斷升高。中國海關(guān)統(tǒng)計公布的2013～2015年進口蜂蜜量分別為4856.7、5791.1、6520.7 t[9]。市場需求量增多的同時往往也伴隨著蜂蜜真實性質(zhì)量安全的弊端。深圳市消委會網(wǎng)絡(luò)公布的2016年蜂蜜比較實驗一階段報告中指出:購買的60款蜂蜜中一款被檢出外源C4植物糖漿摻假量超過51.7%。蜂蜜造假新聞的層出不窮,嚴重損害蜂蜜市場秩序的同時也給消費者健康埋下安全隱患。

同時,人們生活水平的提升生活質(zhì)量標準也隨之改變。消費者對于產(chǎn)品的品種類別、產(chǎn)地來源和名優(yōu)品牌關(guān)注度逐漸增高[10]。假冒那些具有三品一標標識產(chǎn)品、以次充優(yōu)等欺騙消費者的現(xiàn)象使得產(chǎn)品的產(chǎn)地和品種溯源研究成為食品質(zhì)量安全控制中的重要內(nèi)容。目前,用于蜂蜜真實性溯源研究的主要研究技術(shù)包括穩(wěn)定同位素技術(shù)、紅外光譜技術(shù)、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、核磁共振技術(shù)、DNA技術(shù)等。本文主要闡述穩(wěn)定同位素技術(shù)在蜂蜜研究中取得的研究成果以及分析總結(jié)該技術(shù)的優(yōu)勢與不足,為推進穩(wěn)定同位素技術(shù)在蜂蜜中的研究方向提供參考。

1 穩(wěn)定同位素技術(shù)的簡介

自然界中的生物和非生物都是由化學元素組成。具有相同質(zhì)子數(shù),不同中子數(shù)的同一元素的不同核素互為同位素。同位素根據(jù)穩(wěn)定性分為放射性同位素和穩(wěn)定同位素兩大類。穩(wěn)定同位素是指元素中原子序數(shù)相同,原子質(zhì)量不同,化學性質(zhì)基本相同,且半衰期大于1015年的同位素。穩(wěn)定同位素比值是指同一元素的重同位素原子豐度與輕同位素原子豐度比率,一般以字母R表示[11]。目前常用于食品研究應(yīng)用中的穩(wěn)定同位素比率主要有2H/1H、13C/12C、15N/14N、18O/16O、34S/32S、30Si/28Si、208Pb/206Pb。穩(wěn)定同位素技術(shù)的原理是指通過基于電磁學原理設(shè)計而成的質(zhì)譜儀,將被分析的穩(wěn)定同位素由原子轉(zhuǎn)化為離子狀態(tài),測定該元素的質(zhì)荷比從而獲得R樣本值。為了便于實際應(yīng)用,一般選擇分析穩(wěn)定同位素比值,即樣品某元素的穩(wěn)定同位素比率與國際標準品穩(wěn)定同位素比率之間的比值,以符號(δ)表示[12]。因為,生物體在同外界環(huán)境進行物質(zhì)交換(如呼吸作用、蒸騰作用、營養(yǎng)吸收等)將直接影響生物體內(nèi)代謝過程,生物體內(nèi)不同元素的穩(wěn)定同位素比值也隨之發(fā)生改變,該過程也被稱為同位素自然分餾效應(yīng)。外界環(huán)境中的季風氣候種類、地質(zhì)肥沃程度,經(jīng)緯度、降水量、物質(zhì)含量差異、生物體代謝方式等都將對生物體物質(zhì)交換產(chǎn)生影響,因此,同位素比值也具有鮮明的地域種屬特征,例如距離海洋越近的地域中δ32S值越高,C3植物的δ13C值明顯低于C4植物,人工施肥下作物的δ15N值高于未施肥作物。穩(wěn)定同位素經(jīng)自然分餾作用后穩(wěn)定同位素的組成與豐度確定了生物體獨特的穩(wěn)定同位素標識,因為該特征具有鮮明的地域、環(huán)境種屬等自然特征性,因此也被稱為“自然指紋”[13]。根據(jù)“自然指紋”的獨特性便可實現(xiàn)對物質(zhì)的追蹤、溯源、研究、分析[14]。此外,生物體內(nèi)穩(wěn)定同位素的種類及分布狀態(tài)隨加工、貯藏等變化的幅度很小,較其他研究技術(shù)具有良好的穩(wěn)定性,可真實準確的還原出食品原料的組成成分,耕作方式,種植環(huán)境[15]。鑒于穩(wěn)定同位素技術(shù)的精確性和穩(wěn)定性,該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品摻假檢測、動植物食品產(chǎn)地溯源鑒定、食品品種鑒別，例如果汁[16]、橄欖油[17]、小麥[18]、牛肉[19]、蜂蜜[20]等食品質(zhì)量安全研究。

2 穩(wěn)定同位素技術(shù)在蜂蜜中的研究進展

2.1 穩(wěn)定同位素技術(shù)在蜂蜜摻假鑒別的研究進展

1971年,Bender等發(fā)現(xiàn)植物不同光合作用途徑的穩(wěn)定碳同位素具有生物歧視效應(yīng),13C/12C出現(xiàn)可檢測到的信號差異[21]。1977年,W. White進一步研究得出:C3、C4、CAM植物的δ13C 范圍分別是-22‰～-28‰,-10‰～-31‰,確立了外源C4糖漿添加量小于7%時,蜂蜜中蜂蜜蛋白與蜂蜜滿足δ13C蜂蜜蛋白-δ13C蜂蜜<-1‰的相關(guān)關(guān)系[22-24]。1995年,基于W. White的研究成果,AOAC建立SCIRA(stable carbon isotope ratio analysis)方法檢測蜂蜜外源C4糖漿摻假的國際標準AOAC978.17[12]。該方法中注明:摻假量%=(δ13C蜂蜜蛋白-δ13C蜂蜜)/(δ13C蜂蜜蛋白-δ13C玉米糖漿),且摻假量大于7%時可判定為摻假蜂蜜。2002年,中國建立蜂蜜的國家標準《GB/T18932.1-2002蜂蜜中C4植物糖含量測定方法-穩(wěn)定碳同位素比率法》[25]。IRMS(isotope ratio mass spectrometer)技術(shù)在蜂蜜的真實性研究逐漸深入和全面。Cengiz等[26]通過土耳其安塔利亞13個蜂蜜樣本對IRMS技術(shù)的敏感度、精確度等數(shù)據(jù)真實性進行實驗驗證。該研究結(jié)果得出,IRMS技術(shù)檢測蜂蜜中C4糖含量的最低檢測限、最低檢測量、實驗室內(nèi)部標準回收率,分別為0.11%、0.38%、98.57%。Simsek等[27]利用IRMS技術(shù)對土耳其31個原蜜樣本以及43個商品蜜樣本進行檢測,結(jié)果顯示,31個原蜜樣本屬于純蜂蜜,商品蜜檢出摻假率為23%。Berriel等[28]首次利用IRMS技術(shù)對烏拉圭兩個地區(qū)的51個蜂蜜樣本進行分析,結(jié)果顯示,8%存在蜂蜜外源C4糖漿摻假。luo等[29]利用EA-IRMS(element analysis-isotope ratio mass spectrometer)技術(shù)對58個中國商品蜜進行分析,發(fā)現(xiàn)有23個商品蜜存在摻假。

IRMS技術(shù)具有良好的的精確度和準確度,在鑒別蜂蜜中C4植物外源糖漿摻假方面獲得很好的效果。但是,針對目前新的摻假技術(shù)如對蜜蜂飼喂糖漿增高產(chǎn)量,外源C3植物糖漿摻假如甜菜糖漿,IRMS技術(shù)無法實現(xiàn)準確檢出。Gule等[30]利用IRMS技術(shù)對飼喂蜜蜂不同濃度糖漿生產(chǎn)的蜂蜜進行檢測分析。檢測方法包括AOAC 978.17,1995[31]AOAC991.41,1995[32]AOAC998.12,2005[33];檢測指標包括:δ13C蜂蜜、δ13C蜂蜜蛋白、C4糖含量。研究結(jié)果顯示,蜂蜜飼喂糖漿量高于20 L/群以及低劑量飼喂C4植物糖漿能準確檢出,但對于甜菜糖漿飼喂量低于5 L/群時,無法檢出。MartíN等[34]通過對15種蜂蜜共計49個樣本進行分析,研究發(fā)現(xiàn),使用半乳糖氧化酶反應(yīng)處理蜂蜜中的低聚糖或添加小于7%的玉米糖漿都可以使蜂蜜中的δ13C處于正常值范圍。Rogers等[35]利用IRMS技術(shù)測定新西蘭1023個純蜂蜜樣本的δ13C蜂蜜、δ13C蜂蜜蛋白、C4糖含量。檢出333個蜂蜜樣本C4糖含量超過7%,其中麥盧卡蜂蜜占324個,錯判率97.2%。麥盧卡蜜中甲基乙二醛含量超過250 mg/kg或者抗氧化活性>10+時,AOAC 998.12方法發(fā)生誤判。

針對IRMS技術(shù)的不足之處,不同技術(shù)的聯(lián)用開始作為檢測技術(shù)研究的熱點,如NMR-IRMS(Nuclear Magnetic Resonance and isotope ratio mass sepctormeter),LC-IRMS(liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry)等。Cotte等[36]利用IRMS和NMR聯(lián)用技術(shù)研究蜂蜜的真實性。研究發(fā)現(xiàn),IRMS對于蜂蜜的摻假優(yōu)于NMR,而NMR對于部分單花蜜的品種鑒別效果略優(yōu)于IRMS。測定蜂蜜中單糖、二糖的碳同位素比值成為研究的新思路[37]。Cabaero等[38]利用LC-IRMS技術(shù)測定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖的δ13C值,發(fā)現(xiàn)三者之間呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系,外添加的糖漿含量在1%～10%之間將改變純蜂蜜中單糖所存在的線性關(guān)系。Hao等[39]利用LC-IRMS和EA-IRMS技術(shù)分別對800個商品蜜進行分析研究。研究發(fā)現(xiàn):摻假率計算值在-7

IRMS與不同技術(shù)的聯(lián)用對于解決蜂蜜中甜菜摻假、蜜蜂糖漿飼喂等真實性問題的研究仍存有誤判、錯判現(xiàn)象。隨著LC-IRMS對于蜂蜜中單糖研究的逐步深入,蜂蜜中的單糖含量變化范圍的相關(guān)關(guān)系以及特征性變化區(qū)間等新的關(guān)于穩(wěn)定同位素技術(shù)研究思路,將為IRMS技術(shù)在蜂蜜的真實性研究中帶來突破性發(fā)現(xiàn)。

2.2 穩(wěn)定同位素技術(shù)在蜂蜜產(chǎn)地溯源中的研究進展

食品溯源起源于1986年歐洲瘋牛病爆發(fā)后的食品安全控制應(yīng)急措施。2002年美國提出農(nóng)田到餐桌的風險管理,溯源機制成為食品質(zhì)量安全的重要內(nèi)容。2008年我國發(fā)布《農(nóng)產(chǎn)品地理標志管理辦法》,并設(shè)立無公害食品、綠色食品、有機食品和地理標志農(nóng)產(chǎn)品(三品一標)[40]。具有三品一標標識的特色名優(yōu)產(chǎn)品從申請審核到最終獲得認證,需通過專業(yè)研究人員的實地考核以及層層評審。對于蜂蜜而言,特色品牌的蜜源地一般屬于自然環(huán)境極為優(yōu)越,如我國湖北神農(nóng)架林區(qū)的神農(nóng)百花蜜,湖北黃陂區(qū)的黃陂荊蜜,湖北枝江市的枝江蜂蜜屬于典型具有國家地理標識的蜂蜜品牌。名優(yōu)品牌的知名度、售價遠遠高于普通蜂蜜品牌。在利益誘惑驅(qū)使下,少數(shù)商家采取偽冒名優(yōu)品牌的欺騙性行為售賣給消費者摻假蜂蜜或者普通產(chǎn)區(qū)的蜂蜜,這嚴重破壞公平、公正的市場規(guī)則。產(chǎn)地溯源由此成為應(yīng)急性安全控制之外產(chǎn)品質(zhì)量控制的一項重要研究技術(shù)。

產(chǎn)地溯源技術(shù)各有優(yōu)劣,穩(wěn)定同位素技術(shù)對于蜂蜜產(chǎn)地溯源的研究應(yīng)用都取得不錯的成果,而且對于地理自然環(huán)境差異較大的蜂蜜產(chǎn)地溯源效果顯著。Antje等[41]利用IRMS技術(shù)測定歐洲20個地區(qū)516個樣本的C、N、H、S穩(wěn)定同位素比值,七個地區(qū)的地域鑒別度超過70%。產(chǎn)地鑒別中氣候條件、地質(zhì)環(huán)境相似度越小,IRMS技術(shù)的識別度越高。Chesson等[42]利用IRMS技術(shù)測定蜂蜜和蜂蠟的δ2H值,發(fā)現(xiàn)在糖和水蒸氣等物質(zhì)的氫原子交換作用下,兩者具有δ2Hhoney=0.9δ2Hwax+170%(R2=0.9000)的線性關(guān)系。而通過對采樣地點濕度的記錄,蜂蠟δ2H值與年降水量、地表水的δ2H值呈顯著相關(guān)性。通過測定蜂蠟δ2H值可得知蜂蜜的地理來源,從而實現(xiàn)產(chǎn)地鑒別。Dinca等[43]利用NMR和IRMS技術(shù)對來自羅馬尼亞、意大利、塞浦路斯、希臘、巴西和俄羅斯蜂蜜進行研究。雖然所選采樣地點存在氣候條件、溫濕度等自然環(huán)境條件的顯著差異。但兩項技術(shù)單獨使用時,均無法實現(xiàn)準確的地域判別。而兩者連用并通過主成分分析法判別成功率高達99.85%。陳輝等[44]利用ICP-MS與IRMS技術(shù)連用測定中國不同產(chǎn)地來源的253個蜂蜜樣本的44個微量元素指標以及C、N、H、O、S五個穩(wěn)定同位素指標,并通過人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法進行分析研究。結(jié)果顯示,洋槐蜜、荊條蜜和所有蜂蜜的地理來源判別準確率分別為90%、95%和96%。Kropf等[45]利用TXRF(total reflection X-ray fluorescence spectrometry)和IRMS技術(shù)對斯洛文尼亞刺槐蜜、椴樹蜜、栗樹蜜三種花蜜不同地域的122個蜂蜜樣本,并通過主成分分析法進行研究分析。結(jié)果顯示,阿爾卑斯山、迪納里克、潘諾尼亞、地中海四個存在顯著氣候環(huán)境差異的椴樹蜜地域識別率為100%,刺槐和栗樹蜜產(chǎn)識別率分別為98.2%和94.6%。

2.3 穩(wěn)定同位素技術(shù)在蜂蜜品種鑒別中的研究進展

蜂蜜的品種按照蜜源種類可分為單花蜜和百花蜜兩個大類別。一般在未出現(xiàn)大片單一植物蜜源時,蜜蜂采集多種植物花蜜釀制的蜂蜜都稱為百花蜜。單花蜜要求蜜蜂采集花蜜的植物蜜源屬于同一種植物。單花蜜的命名一般根據(jù)其蜜源植物來確定,如荊條蜜、椴樹蜜、荔枝蜜、洋槐蜜。相對而言,單花蜜因為蜜源植物的單一,口感、色澤、香味等都有一定的特征性。如洋槐蜜的香味醇厚、口感潤滑顏色為淺琥珀色,棗花蜜回味有辛辣感、顏色為深琥珀色。同時,蜜源植物生存條件的適應(yīng)度等原因不同單花蜜的產(chǎn)量也有所不同。如中國由南至北、從東到西,地理、地質(zhì)、氣候、溫濕度等環(huán)境條件變化顯著。油菜喜冷涼、耐寒、分布廣、跨越時間長,油菜蜜產(chǎn)量屬于中國所有單花蜜產(chǎn)量中最高。而椴樹一般耐寒、喜濕,多集中于東北地區(qū),開花時間以及蜜源地的限制使得椴樹蜜的產(chǎn)量遠低于荊條蜜、油菜蜜等大蜜源的單花蜜品種。因此,不同植物來源蜂蜜的價格與產(chǎn)量存在較大差異,而部分不法商家慣用低價值的單花蜜冒充高價值的單花蜜,以獲取更高的利潤。

隨著人們對于蜂蜜品種的關(guān)注度增高,品種鑒別也成為蜂蜜研究的重要內(nèi)容。由于蜂蜜中蛋白質(zhì)、糖、礦物元素等營養(yǎng)物質(zhì)基本上來自于蜜源植物,不同植物與環(huán)境中物質(zhì)交換的能力各不相同,且不同蜂蜜對于從蜜源植物中獲取的營養(yǎng)物質(zhì)成分含量的各有高低,因此,同一種元素的穩(wěn)定同位素的相對豐度存在一定差異。Dinca等[43]利用NMR和IRMS技術(shù)對羅馬尼亞不同植物蜜源的40個蜂蜜樣本測定δ13C、δ2H、δ18O、D/H值。結(jié)果顯示,羅馬尼亞單花蜜的δ13C變化范圍較小,洋槐蜜、油菜蜜、山花蜜的δ13C變化范圍分別是:-22.34‰～-24.23‰、-25.02‰～-26.22‰、-23.26‰～-26.33‰,而椴樹蜜δ13C的差值范圍最小在-24.05‰～-24.99‰之間。IRMS可以準確區(qū)別油菜蜜,而NMR能夠區(qū)分椴樹蜜與洋槐蜜。Karabagias等[46]利用IRMS和ICP-OES(inductively coupled plasma optical-emission spectroscopy)技術(shù)測定2011～2013年24個來自于希臘不同植物蜜源的蜂蜜樣本。百里香蜜、松花蜜、冷杉蜜、柑橘蜜的δ13C分別是(-24.87‰±0.68‰)、(-25.62‰±0.38‰)、(-26.37‰±0.18‰)以及(-25.49‰±0.70‰)。并通過主成分分析法,品種鑒別準確率可達到87.5%。Wu等[47]利用IRMS和ICP-MS技術(shù)對中國荊條蜜、洋槐蜜、棗花蜜、油菜蜜四種主蜜源組成的57個蜂蜜樣本進行測定,并通過主成分分析法進行數(shù)據(jù)分析。研究得出,不同品種蜂蜜的δ13C、δ13H、δ13O值存在明顯的差異,δ13H較δ13C能更有效的區(qū)分這四種不同品種的蜂蜜,四種蜂蜜的品種鑒別率接近100%。

2.4 其他

穩(wěn)定同位素技術(shù)不僅在蜂蜜摻假、產(chǎn)地以及品種鑒別方面有較多的研究,而且在蜂蜜儲存年限、人工飼喂影響方面也有所報道,胡柳花等[48]利用EA-IRMS技術(shù)研究了百花蜜、洋槐蜜、紫云英蜜儲存2年內(nèi)的δ13C值變化,研究發(fā)現(xiàn),三種蜂蜜儲存2年后,δ13C值基本穩(wěn)定。其次,關(guān)于人工飼喂的蜜蜂所釀造的蜂蜜與野生蜜蜂所釀造蜂蜜兩者之間的差異,也有學者通過IRMS技術(shù)進行一定的研究。Lucy等[49]利用IRMS技術(shù)對人工飼養(yǎng)蜜蜂與野生蜜蜂所產(chǎn)的蜂蜜進行分析,從群體遺傳學、寄生傳播、傳粉、種間相互作用和蜜蜂育種五個方面探究兩種方式下所產(chǎn)蜂蜜的差別。其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),人工飼喂和非人工飼喂之間的碳穩(wěn)定同位素值具有明顯差異。

3 結(jié)語

IRMS技術(shù)在蜂蜜的真實性溯源研究中具有顯著的成果。如碳穩(wěn)定同位素技術(shù)在蜂蜜中外源C4糖漿摻假鑒別已得到廣泛應(yīng)用,并有效遏制了市場中蜂蜜C4植物糖漿摻假。C、S、H三種穩(wěn)定同位素對于蜂蜜的產(chǎn)地鑒別效果良好,尤其是鑒別來源于環(huán)境差異較大的不同產(chǎn)地同種蜂蜜方面,具有較高的鑒別率。IRMS技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)用可有效提升不同植物來源蜂蜜的鑒別效果。同時,IRMS技術(shù)也存在某些不足,例如無法有效鑒別蜂蜜中摻C3植物糖漿,自然環(huán)境差異較小的產(chǎn)地鑒別率偏低。其次,目前應(yīng)用于蜂蜜研究中的穩(wěn)定同位素主要涉及C、N、H、O、S等元素,而其他穩(wěn)定同位素如Pb、Si在蜂蜜中的研究較少。隨著穩(wěn)定同位素技術(shù)和其他技術(shù)的發(fā)展,兩種或多種技術(shù)的聯(lián)用將更好的溯源蜂蜜的真實性,具有更好的應(yīng)用前景。