豬藍耳病與豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌混合感染的診治

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林 毅, 戴卓建, 葉勇剛, 李興玉, 張先惠, 葉健強, 潘 夢, 肖 璐

(四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 251600)

豬藍耳病亦稱豬繁殖與呼吸綜合征，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS)引起的豬的急性接觸性傳染病[1]，可造成母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸癥狀，具有發(fā)病快、死亡率高等特點。豬鏈球菌病是由鏈球菌感染所引起的豬的一類疾病的總稱，該病分布范圍極廣，世界各地均有發(fā)生[2]；副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道的一種常在菌，但在特定條件下能夠侵入機體并引起嚴重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征[3]。2017年10月份，四川某豬場爆發(fā)以高燒、呼吸道、共濟失調(diào)、圓圈運動等腦神經(jīng)炎癥和急性型敗血癥癥狀為主的病情，發(fā)病急、死亡高。經(jīng)臨床診斷及實驗室確診為豬藍耳病及豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌病混合感染導(dǎo)致。采取對癥措施后，疫病很快得到控制，現(xiàn)將有關(guān)情況報告如下。

1 臨床癥狀

發(fā)病豬以育肥豬為主，兼有仔豬發(fā)病，懷孕母豬流產(chǎn)，部分豬經(jīng)治療無效后死亡。病豬主要表現(xiàn)為體溫升高，高達41℃～42℃，病豬食欲極具下降，咳喘及呼吸急促，部分豬共濟失調(diào)、站立不穩(wěn)、轉(zhuǎn)圈運動等癥狀的神經(jīng)特征，下腹、耳尖以及四肢末端的皮膚出現(xiàn)發(fā)紫或者發(fā)紅的跡象。

2 剖檢病變

病豬內(nèi)臟器官出血，心包積液，心包積液并有纖維素性滲出物，心肌表面呈“絨毛心”，肺臟部位具有較多的纖維素樣的滲出物。腹股溝淋巴結(jié)腫大明顯、切面水腫、出血。胸腔積有大量黃色液體并有纖維素滲出物。全身內(nèi)臟器官出血，肺臟腫大，間質(zhì)增寬，呈現(xiàn)大理石樣或者斑駁狀。腎臟有能夠見到少量出血點，大腸有出血點，膀胱黏膜部位有出血點，關(guān)節(jié)腫脹，有大量滲出物。

3 實驗室確診

3.1 病料采集

無菌采集病豬病豬肺臟、脾臟、淋巴結(jié)，置于冰盒中送實驗室備檢。引物設(shè)計[4-6]合成豬瘟、圓環(huán)、藍耳鑒定引物,參考Oliveira等[7]的Hps 16S rRNA引物副豬嗜血桿菌病合成上、下游引物，參考PICARD等[8]合成豬鏈球菌鑒定引物，細菌16s基因由本實驗室保存(見表1)。

表1 鑒定引物列表

續(xù)表1

3.2 病毒DNA/RNA提取

采用天根組織病毒DNA/RNA提取試劑盒提取病毒總DNA和RNA，采用寶生物RNA反轉(zhuǎn)錄是試劑盒(RNA to cDNA EcoDryTM premix)反轉(zhuǎn)錄cDNA。

3.3 PCR反應(yīng)

采用95℃ 3 min,95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃1 min 30循環(huán)，72℃ 終延伸10 min。2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

4 細菌分離鑒定

無菌采集肺臟、心血、關(guān)節(jié)液無菌接種鮮血瓊脂平板和TSA平板(含有5%的血清及0.002%的NAD)，挑取優(yōu)勢菌落精簡并劃線相應(yīng)的培養(yǎng)基，挑取單菌落接種TSB液體培養(yǎng)基(含有5%的血清及0.002%的NAD)并進行16S基因擴增并測序，同時采用鏈球菌及副豬嗜血桿菌病鑒定引物PCR鑒定。

5 致病性試驗

將分離純化的細菌接種TSB肉湯(含0.0002% NAD 和5%新生牛血清)，皮下注射小鼠0.4 mL，每種細菌注射5只同時設(shè)置5只小白鼠對照組，對照組皮下注射0.4 mL無菌生理鹽水。

6 結(jié)果

6.1 病毒PCR檢測結(jié)果

經(jīng)RT-PCR及PCR鑒定，確診送檢病料中存在高致病性藍耳病毒，未檢出豬瘟、圓環(huán)病毒(檢測結(jié)果見圖1)。

圖1 豬瘟 圓環(huán) 藍耳PCR檢測結(jié)果

注:1-3:一號樣品豬瘟、圓環(huán)、藍耳檢測結(jié)果；4-6:二號樣品豬瘟、圓環(huán)、藍耳檢測結(jié)果;7-9:三號樣品豬瘟、圓環(huán)、藍耳檢測結(jié)果；10-11:陰性對照；12:DL2000 Maker Plus

6.2 細菌分離鑒定

TSA平板(含0.0002% NAD 和5%新生牛血清)上優(yōu)勢菌為圓形、光滑濕潤、無色透明的菌落形態(tài)革蘭氏染色為陰性短桿菌(見圖2)；鮮血瓊脂上優(yōu)勢菌落為圓形、針尖大小的半透明狀菌落形態(tài)，革蘭氏染色為陽性單個、成對或者短鏈狀的橢圓形菌(見圖3)。

圖2 TSA平板優(yōu)勢菌染色鏡檢

圖3 鮮血瓊脂平板優(yōu)勢菌顏色鏡檢

6.3 細菌16S鑒定及特異性鑒定

采用采用細菌16 s引物擴增細菌16S基因片段，并送上海生工進行測序，經(jīng)NCBI上序列比對確定TSA平板上優(yōu)勢菌圍副豬嗜血桿菌，鮮血瓊脂平板上優(yōu)勢菌為豬鏈球菌(見圖4)；采用副豬嗜血桿菌鑒定引物及豬鏈球菌鑒定引物對純化的細菌進行PCR鑒定，復(fù)檢確診TSA平板上優(yōu)勢菌為副豬嗜血桿菌(見圖5)，血平板上優(yōu)勢菌為豬鏈球菌(見圖6)。

圖4 TSA平板及血平板上優(yōu)勢菌16S電泳圖

注:1.DL2000 Maker plus ，2-3.陰性對照，4-5.TSA平板優(yōu)勢細菌16s鑒定 ,6-9.鮮血瓊脂平板優(yōu)勢細菌16 s鑒定

圖5 副豬嗜血桿菌鑒定

注：1.DL2000 Maker plus ，2.陰性對照，3-4.副豬嗜血桿菌PCR鑒定

圖6 豬鏈球菌鑒定

注：1.陰性對照，2-9.豬鏈球菌PCR鑒定，10. DL2000 Maker plus

6.4 致病性試驗

副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌皮下注射小白鼠24 h后，副豬嗜血桿菌4只死亡(4/5)，豬鏈球菌5只死亡(5/5)，對照組無死亡，將死亡小鼠的心血接種TS平板和血平板，分離出對應(yīng)的副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌，證明這兩種菌具有較強的致病性。

7 防控措施

該次疫情主要是高致病性藍耳病毒感染豬群后，造成其淋巴器官中的 T細胞和 B 細胞數(shù)量減少、淋巴組中巨噬細胞浸潤以及外周血和淋巴組織中的巨噬細胞、單核細胞數(shù)量升高，最終導(dǎo)致豬群免疫系統(tǒng)受到侵害，引發(fā)豬的免疫抑制，使的豬的呼吸系統(tǒng)抵抗力降低。副豬嗜血桿菌與豬鏈球菌為豬呼吸系統(tǒng)常見病，當豬群發(fā)生藍耳病時，副豬嗜血桿菌與豬鏈球菌呈現(xiàn)較高的分離率，且這兩種病原協(xié)同時可引發(fā)或加重疾病。

目前藍耳病缺乏有效的治療藥物，該病是一種免疫抑制病，其引發(fā)的免疫抑制導(dǎo)致的繼發(fā)感染常常加重豬場的損失，因此控制藍耳病豬群的繼發(fā)感染會大大降低豬群的發(fā)病率和死亡率。選用對副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌都有效的頭孢類藥物(如頭孢哌酮和頭孢噻呋鈉)以及替米考星可以有效的控制繼發(fā)感染。對于藍耳病，雖然疫苗免疫是豬場最常規(guī)的方法，但是由于藍耳病弱毒疫苗毒株多樣，各個疫苗毒株之間的雜交、重組導(dǎo)致的毒力返強時有發(fā)生，因此對不穩(wěn)定豬群推薦使用藍耳病滅活苗穩(wěn)定豬群，配合使用抗病毒中藥(七清敗毒散、白虎湯等)，免疫增強劑(黃芪多糖、活性肽等)和免疫因子(白細胞介素、干擾素、轉(zhuǎn)移因子)，同時對發(fā)病豬群加強護理、保溫、清潔衛(wèi)生等措施。該場豬群采用七清敗毒散拌料、黃芪多糖飲水，肌注頭孢噻呋鈉，仔豬肌注倍健+ 倍康肽組合，豬群疫情迅速得到有效控制。

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