流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血清細(xì)胞因子常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策*

李向陽(yáng) 華 慧 顏 超 于 倩 鄭葵陽(yáng) 湯仁仙

(徐州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，徐州 221004)

流式細(xì)胞儀技術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)，是應(yīng)用流式細(xì)胞儀，結(jié)合單克隆抗體技術(shù)、免疫熒光染色技術(shù)，對(duì)快速流動(dòng)液體中的單細(xì)胞進(jìn)行多種參數(shù)測(cè)量和分析，檢測(cè)速度快、精確性高，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域[1]。流式微球捕獲芯片技術(shù)(cytometrin bead array,CBA)微量樣本多重蛋白定量技術(shù)，是用流式細(xì)胞儀對(duì)多重蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)的方法，能夠同時(shí)對(duì)樣本中的多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清、積液中的細(xì)胞因子，由于這些細(xì)胞因子含量低，不容易檢測(cè)，加上樣本數(shù)量少，傳統(tǒng)的方法無(wú)法滿足多因子檢測(cè)[2]。

CBA檢測(cè)系統(tǒng)采用聚苯乙烯熒光微球連結(jié)特定的捕獲抗體，捕捉待測(cè)物，同時(shí)再加入待測(cè)物的熒光抗體，三者形成夾心復(fù)合物，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)[3-4]。小鼠血清Th1/Th2/Th17相關(guān)細(xì)胞因子是實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)用到的檢測(cè)指標(biāo)，由于血清量少很難運(yùn)用傳統(tǒng)的方法如ELISA法進(jìn)行多因子檢測(cè)，而CBA法正好能解決這一問(wèn)題，它能夠一次性對(duì)血清中的IL-2、IL-4、IL-6、IFN-Υ、TNF、IL-10、IL-17A進(jìn)行定量檢測(cè)。但是由于CBA操作過(guò)程繁瑣，從樣本處理、上機(jī)檢測(cè)到數(shù)據(jù)處理都對(duì)實(shí)驗(yàn)者要求較高，每一步操作出現(xiàn)失誤都會(huì)影響到結(jié)果。故此本文結(jié)合之前的實(shí)驗(yàn)案例，將實(shí)驗(yàn)操作中常出現(xiàn)的問(wèn)題及解決方法進(jìn)行分析和總結(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

BD Cytometric Bead Array(CBA)Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit( Catalog No.560485)；BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀；華支睪吸蟲感染小鼠血清；FCAP分析軟件；流式上樣管；15ml離心管。

1.2 方法

1.2.1檢測(cè)樣本制備主要步驟 制備小鼠Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品；混合人Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子捕獲微球；標(biāo)準(zhǔn)品管及樣本管分別加入微球及相應(yīng)的樣本，加Th1/Th2/Th17 PE檢測(cè)試劑，2h后洗滌，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2流式細(xì)胞儀調(diào)整 從BD官網(wǎng)下載CBA儀器調(diào)整模板，將模板通過(guò)Diva軟件導(dǎo)入到機(jī)器中。打開(kāi)模板，運(yùn)用Cytometer Setup Beads(CBA試劑盒配備)調(diào)整機(jī)器參數(shù)包括調(diào)整P1細(xì)胞群，調(diào)節(jié)FITC、PE、APC電壓等，參照說(shuō)明書進(jìn)行，在此不再贅述。

1.2.3FCAP軟件分析 從Diva軟件中導(dǎo)出數(shù)據(jù)，其格式為FCS2.0文件。打開(kāi)FCAP軟件，導(dǎo)入相應(yīng)的FCS2.0文件進(jìn)行分析，包括制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度等。

2 標(biāo)準(zhǔn)品上機(jī)檢測(cè)流式圖

正常的CBA標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)流式圖，表現(xiàn)為在FSC-A /SSC-A圖上顯示一群微球位于門P1之內(nèi)，見(jiàn)圖1A；在PE-A/APC-A散點(diǎn)圖表現(xiàn)為7群，從上到下依次為IL-2、IL-4、IL-6、IFN-Υ、TNF、IL-10、IL-17A，群之間清晰無(wú)連接，無(wú)聚集成團(tuán)，無(wú)多群現(xiàn)象，見(jiàn)圖1B；APC-A通道上也顯示為清晰的7群，見(jiàn)圖1C。

圖1 正常CBA流式檢測(cè)圖

3 常見(jiàn)問(wèn)題分析及解決方法

3.1 微球聚集成團(tuán)，分群不清晰

在檢測(cè)小鼠血清樣本的時(shí)候，正常流式散點(diǎn)圖上顯示為7群，見(jiàn)圖2A；但是有時(shí)會(huì)顯示多群，甚至聚集成團(tuán)，見(jiàn)圖2B。微球由聚苯乙烯材料制作而成，血清加入微球之后如果沒(méi)有充分渦旋，容易沉淀聚集，細(xì)胞因子不能充分跟微球結(jié)合，導(dǎo)致多群甚至聚集現(xiàn)象發(fā)生，檢測(cè)結(jié)果將是無(wú)效的。從制備混合微球開(kāi)始到加入實(shí)驗(yàn)管，直到上機(jī)檢測(cè)前每一步都必須充分渦旋，以避免微球發(fā)生聚集。

圖2 微球聚集現(xiàn)象

3.2 散點(diǎn)圖上顯示8群或者多群

CBA實(shí)驗(yàn)上機(jī)檢測(cè)后需要用到FACP軟件進(jìn)行分析，但是此軟件嚴(yán)格要求在APC通道上顯示為7群，多群，少群將無(wú)法檢測(cè)。在檢測(cè)血清時(shí)候，由于血清成分比較復(fù)雜，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等；同時(shí)在小鼠取血過(guò)程中都會(huì)有部分溶血，血細(xì)胞中的成分如紅細(xì)胞碎片，血紅蛋白等釋放到血清中；這些物質(zhì)會(huì)影響到微球與細(xì)胞因子的結(jié)合，影響到整個(gè)體系中的組分，所以經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)多群現(xiàn)象，這樣的檢測(cè)結(jié)果將無(wú)法分析，見(jiàn)圖3。如何處理這樣的數(shù)據(jù)直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3 APC通道顯示多群微球

我們?cè)赑E-A/APC-A散點(diǎn)圖上重新設(shè)一個(gè)門P2，見(jiàn)圖4A；其邏輯關(guān)系如圖4C所示，與模板自帶的門P1并行同屬于“All Events”。門P2將所需要的目的微球群圈選在內(nèi)，非目的微球群排除在外，此時(shí)在APC-A通道上可清晰顯示出7個(gè)微球群，如圖4B所示。門設(shè)置完成后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)出時(shí)，一定要選擇導(dǎo)出目標(biāo)數(shù)據(jù)為 “P2”，這樣我們檢測(cè)的數(shù)據(jù)就夠在FACP軟件進(jìn)行分析，7種細(xì)胞因子的數(shù)值也能依次計(jì)算出來(lái)。

圖4 設(shè)門選中目標(biāo)微球群

3.3 FSC/SSC的檢測(cè)圖中碎片過(guò)多

在檢測(cè)血清樣本時(shí)FSC/SSC的檢測(cè)圖中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)碎片過(guò)多，見(jiàn)圖5；影響到結(jié)果的準(zhǔn)確性，此時(shí)應(yīng)調(diào)整機(jī)器的狀態(tài)，上調(diào)FSC/SSC的閾值，如果問(wèn)題仍然存在，重復(fù)樣本洗滌步驟，或者稀釋血清，盡量減少血清中的雜質(zhì)成分如紅細(xì)胞碎片。

圖5 FSC/SSC的檢測(cè)圖出現(xiàn)大量碎片

3.4 檢測(cè)樣本濃度低于標(biāo)準(zhǔn)品最低濃度

當(dāng)樣本中待測(cè)細(xì)胞因子濃度很低的時(shí)候經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)樣本值位于標(biāo)準(zhǔn)曲線之外，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確或者無(wú)結(jié)果，此時(shí)我們?cè)谥谱鳂?biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)候，增加額外的稀釋濃度點(diǎn)如10、5、2.5、1.25pg/ml。此時(shí)樣本值就能被檢測(cè)出來(lái)，并且結(jié)果是可信的。

4 討論

流式細(xì)胞儀以其檢測(cè)速度快、檢測(cè)手段靈活、多指標(biāo)、多參數(shù)、靈敏度(可達(dá)0.3pg/ml)等特點(diǎn)已成為基礎(chǔ)科研，臨床檢測(cè)等必不可少的技術(shù)手段[5-6]。CBA是流式細(xì)胞術(shù)的一個(gè)新技術(shù)，整合了免疫微球、激光檢測(cè)、信號(hào)處理及計(jì)算機(jī)運(yùn)算等功能。CBA將近似于細(xì)胞大小的微珠作為捕獲載體，使其攜帶已知熒光抗原或抗體，來(lái)捕獲檢測(cè)物中的相關(guān)抗體或抗原。由于遮蔽效應(yīng)可以使熒光微球的發(fā)散光減弱，應(yīng)用不同大小的熒光微球，可同時(shí)檢測(cè)同一標(biāo)本的多種抗原或抗體。這種方法能同時(shí)檢測(cè)單一液相樣本中多個(gè)目的蛋白(如同時(shí)測(cè)定多種細(xì)胞因子、多種自身抗體等)，檢測(cè)需用標(biāo)本量少，靈敏度高，重復(fù)性好，直接熒光標(biāo)記易于使用，檢測(cè)線性范圍寬，避免酶聯(lián)反應(yīng)所致的人工假象，可用于單細(xì)胞分子水平的多參數(shù)檢驗(yàn)，也可用于真菌、寄生蟲、病毒或混合感染的檢測(cè)。較傳統(tǒng)的ELISA有較大的優(yōu)勢(shì)，CBA檢測(cè)所需樣本體積為傳統(tǒng)ELISA的1/6，對(duì)于稀有樣本，CBA是目前最好的選擇，少量樣本即可檢測(cè)細(xì)胞因子、抗體、抗原等多個(gè)指標(biāo)；同時(shí)CBA穩(wěn)定性好，可重復(fù)性高，能避免酶聯(lián)免疫放大技術(shù)使信號(hào)失真導(dǎo)致的假陽(yáng)性[7-8]。

CBA法能夠?qū)颖景ㄑ?、?xì)胞培養(yǎng)上清、滲出液等可溶性細(xì)胞因子進(jìn)行定量檢測(cè)，此方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)領(lǐng)域、干細(xì)胞領(lǐng)域、腫瘤研究及疾病的治療等。CBA檢測(cè)速度快，靈敏度高，樣本使用量少，50μl體積即可對(duì)多種細(xì)胞因子進(jìn)行快速定量檢測(cè)，但是由于操作過(guò)程繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求高，從一定程度上限制了其廣泛使用[9-10]。在檢測(cè)血清時(shí)，由于血清成分復(fù)雜，細(xì)胞因子含量差距大，實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)分群不明顯，微球聚集，濃度太低等現(xiàn)象，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成很大影響；CBA試劑盒說(shuō)明書上雖然有相關(guān)步驟及問(wèn)題處理方法，但是過(guò)于籠統(tǒng)，沒(méi)有具體的案例，操作人員往往要經(jīng)過(guò)多次摸索才能夠做出較為滿意的結(jié)果，本文主要結(jié)合實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常見(jiàn)到的問(wèn)題，對(duì)其進(jìn)行分析，并找出解決問(wèn)題的方法，為實(shí)驗(yàn)人員提供參考，避免實(shí)驗(yàn)中一些技術(shù)問(wèn)題的出現(xiàn)，及遇到相似的問(wèn)題能夠盡快得到解決，從而提高實(shí)驗(yàn)的有效性和準(zhǔn)確性。

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