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    流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血清細(xì)胞因子常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策*

    2018-03-27 01:33:12李向陽(yáng)鄭葵陽(yáng)湯仁仙
    關(guān)鍵詞:流式微球細(xì)胞因子

    李向陽(yáng) 華 慧 顏 超 于 倩 鄭葵陽(yáng) 湯仁仙

    (徐州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,徐州 221004)

    流式細(xì)胞儀技術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)CM),是應(yīng)用流式細(xì)胞儀,結(jié)合單克隆抗體技術(shù)、免疫熒光染色技術(shù),對(duì)快速流動(dòng)液體中的單細(xì)胞進(jìn)行多種參數(shù)測(cè)量和分析,檢測(cè)速度快、精確性高,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域[1]。流式微球捕獲芯片技術(shù)(cytometrin bead array,CBA)微量樣本多重蛋白定量技術(shù),是用流式細(xì)胞儀對(duì)多重蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)的方法,能夠同時(shí)對(duì)樣本中的多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清、積液中的細(xì)胞因子,由于這些細(xì)胞因子含量低,不容易檢測(cè),加上樣本數(shù)量少,傳統(tǒng)的方法無(wú)法滿足多因子檢測(cè)[2]。

    CBA檢測(cè)系統(tǒng)采用聚苯乙烯熒光微球連結(jié)特定的捕獲抗體,捕捉待測(cè)物,同時(shí)再加入待測(cè)物的熒光抗體,三者形成夾心復(fù)合物,通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)[3-4]。小鼠血清Th1/Th2/Th17相關(guān)細(xì)胞因子是實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)用到的檢測(cè)指標(biāo),由于血清量少很難運(yùn)用傳統(tǒng)的方法如ELISA法進(jìn)行多因子檢測(cè),而CBA法正好能解決這一問(wèn)題,它能夠一次性對(duì)血清中的IL-2、IL-4、IL-6、IFN-Υ、TNF、IL-10、IL-17A進(jìn)行定量檢測(cè)。但是由于CBA操作過(guò)程繁瑣,從樣本處理、上機(jī)檢測(cè)到數(shù)據(jù)處理都對(duì)實(shí)驗(yàn)者要求較高,每一步操作出現(xiàn)失誤都會(huì)影響到結(jié)果。故此本文結(jié)合之前的實(shí)驗(yàn)案例,將實(shí)驗(yàn)操作中常出現(xiàn)的問(wèn)題及解決方法進(jìn)行分析和總結(jié)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    BD Cytometric Bead Array(CBA)Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit( Catalog No.560485);BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀;華支睪吸蟲感染小鼠血清;FCAP分析軟件;流式上樣管;15ml離心管。

    1.2 方法

    1.2.1檢測(cè)樣本制備主要步驟 制備小鼠Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品;混合人Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子捕獲微球;標(biāo)準(zhǔn)品管及樣本管分別加入微球及相應(yīng)的樣本,加Th1/Th2/Th17 PE檢測(cè)試劑,2h后洗滌,上機(jī)檢測(cè)。

    1.2.2流式細(xì)胞儀調(diào)整 從BD官網(wǎng)下載CBA儀器調(diào)整模板,將模板通過(guò)Diva軟件導(dǎo)入到機(jī)器中。打開(kāi)模板,運(yùn)用Cytometer Setup Beads(CBA試劑盒配備)調(diào)整機(jī)器參數(shù)包括調(diào)整P1細(xì)胞群,調(diào)節(jié)FITC、PE、APC電壓等,參照說(shuō)明書進(jìn)行,在此不再贅述。

    1.2.3FCAP軟件分析 從Diva軟件中導(dǎo)出數(shù)據(jù),其格式為FCS2.0文件。打開(kāi)FCAP軟件,導(dǎo)入相應(yīng)的FCS2.0文件進(jìn)行分析,包括制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣本濃度等。

    2 標(biāo)準(zhǔn)品上機(jī)檢測(cè)流式圖

    正常的CBA標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)流式圖,表現(xiàn)為在FSC-A /SSC-A圖上顯示一群微球位于門P1之內(nèi),見(jiàn)圖1A;在PE-A/APC-A散點(diǎn)圖表現(xiàn)為7群,從上到下依次為IL-2、IL-4、IL-6、IFN-Υ、TNF、IL-10、IL-17A,群之間清晰無(wú)連接,無(wú)聚集成團(tuán),無(wú)多群現(xiàn)象,見(jiàn)圖1B;APC-A通道上也顯示為清晰的7群,見(jiàn)圖1C。

    圖1 正常CBA流式檢測(cè)圖

    3 常見(jiàn)問(wèn)題分析及解決方法

    3.1 微球聚集成團(tuán),分群不清晰

    在檢測(cè)小鼠血清樣本的時(shí)候,正常流式散點(diǎn)圖上顯示為7群,見(jiàn)圖2A;但是有時(shí)會(huì)顯示多群,甚至聚集成團(tuán),見(jiàn)圖2B。微球由聚苯乙烯材料制作而成,血清加入微球之后如果沒(méi)有充分渦旋,容易沉淀聚集,細(xì)胞因子不能充分跟微球結(jié)合,導(dǎo)致多群甚至聚集現(xiàn)象發(fā)生,檢測(cè)結(jié)果將是無(wú)效的。從制備混合微球開(kāi)始到加入實(shí)驗(yàn)管,直到上機(jī)檢測(cè)前每一步都必須充分渦旋,以避免微球發(fā)生聚集。

    圖2 微球聚集現(xiàn)象

    3.2 散點(diǎn)圖上顯示8群或者多群

    CBA實(shí)驗(yàn)上機(jī)檢測(cè)后需要用到FACP軟件進(jìn)行分析,但是此軟件嚴(yán)格要求在APC通道上顯示為7群,多群,少群將無(wú)法檢測(cè)。在檢測(cè)血清時(shí)候,由于血清成分比較復(fù)雜,血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等;同時(shí)在小鼠取血過(guò)程中都會(huì)有部分溶血,血細(xì)胞中的成分如紅細(xì)胞碎片,血紅蛋白等釋放到血清中;這些物質(zhì)會(huì)影響到微球與細(xì)胞因子的結(jié)合,影響到整個(gè)體系中的組分,所以經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)多群現(xiàn)象,這樣的檢測(cè)結(jié)果將無(wú)法分析,見(jiàn)圖3。如何處理這樣的數(shù)據(jù)直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

    圖3 APC通道顯示多群微球

    我們?cè)赑E-A/APC-A散點(diǎn)圖上重新設(shè)一個(gè)門P2,見(jiàn)圖4A;其邏輯關(guān)系如圖4C所示,與模板自帶的門P1并行同屬于“All Events”。門P2將所需要的目的微球群圈選在內(nèi),非目的微球群排除在外,此時(shí)在APC-A通道上可清晰顯示出7個(gè)微球群,如圖4B所示。門設(shè)置完成后,將數(shù)據(jù)導(dǎo)出時(shí),一定要選擇導(dǎo)出目標(biāo)數(shù)據(jù)為 “P2”,這樣我們檢測(cè)的數(shù)據(jù)就夠在FACP軟件進(jìn)行分析,7種細(xì)胞因子的數(shù)值也能依次計(jì)算出來(lái)。

    圖4 設(shè)門選中目標(biāo)微球群

    3.3 FSC/SSC的檢測(cè)圖中碎片過(guò)多

    在檢測(cè)血清樣本時(shí)FSC/SSC的檢測(cè)圖中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)碎片過(guò)多,見(jiàn)圖5;影響到結(jié)果的準(zhǔn)確性,此時(shí)應(yīng)調(diào)整機(jī)器的狀態(tài),上調(diào)FSC/SSC的閾值,如果問(wèn)題仍然存在,重復(fù)樣本洗滌步驟,或者稀釋血清,盡量減少血清中的雜質(zhì)成分如紅細(xì)胞碎片。

    圖5 FSC/SSC的檢測(cè)圖出現(xiàn)大量碎片

    3.4 檢測(cè)樣本濃度低于標(biāo)準(zhǔn)品最低濃度

    當(dāng)樣本中待測(cè)細(xì)胞因子濃度很低的時(shí)候經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)樣本值位于標(biāo)準(zhǔn)曲線之外,導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確或者無(wú)結(jié)果,此時(shí)我們?cè)谥谱鳂?biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)候,增加額外的稀釋濃度點(diǎn)如10、5、2.5、1.25pg/ml。此時(shí)樣本值就能被檢測(cè)出來(lái),并且結(jié)果是可信的。

    4 討論

    流式細(xì)胞儀以其檢測(cè)速度快、檢測(cè)手段靈活、多指標(biāo)、多參數(shù)、靈敏度(可達(dá)0.3pg/ml)等特點(diǎn)已成為基礎(chǔ)科研,臨床檢測(cè)等必不可少的技術(shù)手段[5-6]。CBA是流式細(xì)胞術(shù)的一個(gè)新技術(shù),整合了免疫微球、激光檢測(cè)、信號(hào)處理及計(jì)算機(jī)運(yùn)算等功能。CBA將近似于細(xì)胞大小的微珠作為捕獲載體,使其攜帶已知熒光抗原或抗體,來(lái)捕獲檢測(cè)物中的相關(guān)抗體或抗原。由于遮蔽效應(yīng)可以使熒光微球的發(fā)散光減弱,應(yīng)用不同大小的熒光微球,可同時(shí)檢測(cè)同一標(biāo)本的多種抗原或抗體。這種方法能同時(shí)檢測(cè)單一液相樣本中多個(gè)目的蛋白(如同時(shí)測(cè)定多種細(xì)胞因子、多種自身抗體等),檢測(cè)需用標(biāo)本量少,靈敏度高,重復(fù)性好,直接熒光標(biāo)記易于使用,檢測(cè)線性范圍寬,避免酶聯(lián)反應(yīng)所致的人工假象,可用于單細(xì)胞分子水平的多參數(shù)檢驗(yàn),也可用于真菌、寄生蟲、病毒或混合感染的檢測(cè)。較傳統(tǒng)的ELISA有較大的優(yōu)勢(shì),CBA檢測(cè)所需樣本體積為傳統(tǒng)ELISA的1/6,對(duì)于稀有樣本,CBA是目前最好的選擇,少量樣本即可檢測(cè)細(xì)胞因子、抗體、抗原等多個(gè)指標(biāo);同時(shí)CBA穩(wěn)定性好,可重復(fù)性高,能避免酶聯(lián)免疫放大技術(shù)使信號(hào)失真導(dǎo)致的假陽(yáng)性[7-8]。

    CBA法能夠?qū)颖景ㄑ?、?xì)胞培養(yǎng)上清、滲出液等可溶性細(xì)胞因子進(jìn)行定量檢測(cè),此方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)領(lǐng)域、干細(xì)胞領(lǐng)域、腫瘤研究及疾病的治療等。CBA檢測(cè)速度快,靈敏度高,樣本使用量少,50μl體積即可對(duì)多種細(xì)胞因子進(jìn)行快速定量檢測(cè),但是由于操作過(guò)程繁瑣,對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求高,從一定程度上限制了其廣泛使用[9-10]。在檢測(cè)血清時(shí),由于血清成分復(fù)雜,細(xì)胞因子含量差距大,實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)分群不明顯,微球聚集,濃度太低等現(xiàn)象,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成很大影響;CBA試劑盒說(shuō)明書上雖然有相關(guān)步驟及問(wèn)題處理方法,但是過(guò)于籠統(tǒng),沒(méi)有具體的案例,操作人員往往要經(jīng)過(guò)多次摸索才能夠做出較為滿意的結(jié)果,本文主要結(jié)合實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常見(jiàn)到的問(wèn)題,對(duì)其進(jìn)行分析,并找出解決問(wèn)題的方法,為實(shí)驗(yàn)人員提供參考,避免實(shí)驗(yàn)中一些技術(shù)問(wèn)題的出現(xiàn),及遇到相似的問(wèn)題能夠盡快得到解決,從而提高實(shí)驗(yàn)的有效性和準(zhǔn)確性。

    [1] 陳朱波,曹雪濤.流式細(xì)胞術(shù)原理、操作及應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社,2010:1-216.

    [2] Du L,Grover A,Ramanan S,et al.The evolution of guidelines for the validation of flow cytometric methods[J].Int J Lab Hematol,2015,37(Suppl 1): 3-10.DOI:10.1111/ijlh.12344.

    [3] 趙春蘭,于華鳳,韓玉玲,等.流式CBA法檢測(cè)哮喘患兒Th1/Th2和Treg/Th17細(xì)胞因子失衡情況[J].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床,2017,(4):1-5. DOI:10.3969/j.issn.1673- 5013. 2017.04.001.

    [4] Lawrence JG,Butela K,Atzinger A.A likelihood approach to classifying fluorescent events collected by multicolor flow cytometry[J].J Microbiol Methods,2013,94(1): 1-12.DOI:10.1016/j.mimet.2013.04.001.

    [5] Khan SS,Smith MS,Reda D,et al. Multiplex bead array assays for detection of soluble cytokines: comparisons of sensitivity and quantitative values among kits from multiple manufacturers[J]. Cytometry B Clin Cytom, 2004,61(1): 35-39. DOI: 10.1002/cyto.b.20021.

    [6] Njemini R,Onyema OO,Renmans W,et al.Shortcomings in the application of multicolour flow cytometry in lymphocyte subsets enumeration[J].Scand J Immunol,2014,79(2): 75-89.DOI:10.1111/sji.12142.

    [7] 高赟,許沈華,朱赤紅,等.CBA技術(shù)檢測(cè)胃腸癌患者Th/1Th2細(xì)胞因子表達(dá)水平的研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2011,21(2): 280-283.

    [8] Ren W,Liu H,Yang W,et al.A cytometric bead assay for sensitive DNA detection based on enzyme-free signal amplification of hybridization chain reaction[J].Biosens Bioelectron,2013,49: 380-386.DOI:10.1016/j.bios.2013.05.055.

    [9] 劉波.流式細(xì)胞儀及其臨床應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)療設(shè)備,2013,28(7): 66-69.

    [10] Aghaeepour N,F(xiàn)inak G, et al.Critical assessment of automated flow cytometry data analysis techniques[J].Nat Methods,2013,10(3): 228-238.DOI:10.1038/nmeth.2365.

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