蛋白質(zhì)含量測定方法研究

郭垠利

（貴州師范學(xué)院，貴州貴陽 550018）

蛋白質(zhì)（Protein）是人體所需的重要營養(yǎng)物質(zhì)，是人體中不可或缺的組成成分。蛋白質(zhì)具有多種生理功能，如修復(fù)和構(gòu)成人體組織、參與人體新陳代謝、甚至提供能量等功能。所有的蛋白質(zhì)均含有C、H、O、N四種元素，少部分蛋白質(zhì)還含有S、Fe、Cu、P等元素，其中氮元素在所有蛋白質(zhì)中含量較為穩(wěn)定，約占16%，因此可通過蛋白質(zhì)中氮元素的含量來對其進行含量測定[1]。隨著人們生活水平的提高，人們越來越多的通過攝入蛋白質(zhì)以補充營養(yǎng)，然后我國在2008年發(fā)生的三聚氰胺事件，不僅對我國奶制品行業(yè)造成極大影響，也反映出我國對包括奶粉在內(nèi)的蛋白質(zhì)品含量測定方法的不足。因此，建立一套科學(xué)、快速、準確的蛋白質(zhì)含量測定方法具有重要的現(xiàn)實意義，故本文綜述了蛋白質(zhì)含量測定方法最新研究進展，以期為蛋白質(zhì)含量測定提供參考。

1 色譜法

色譜法（Chromatography）測定蛋白質(zhì)含量是利用蛋白質(zhì)在流動相與固定相中分配系數(shù)的不同，進行相對運動時，蛋白質(zhì)在兩相中多次進行分配，從而使蛋白質(zhì)得以分離。色譜法屬于物理分離方法，通常適合用于多組分試驗的分離分析。

1.1 高效液相色譜法

高效液相色譜（HPLC）是以液體為流動相，利用高壓泵輸送流動相進入色譜柱，待試樣在色譜柱中分離完畢后，再進入檢測器中，最終實現(xiàn)待測試樣的分離分析，該法具有靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)點[2]?？得系さ萚3]使用HPLC法對牛初乳中免疫球蛋白的含量進行測定，以甘氨酸鹽和磷酸鹽緩沖溶液作為流動相，檢查波長選為278nm，實驗得出該法測定牛初乳中免疫球蛋白含量的線性范圍為0.1～1.0mg/L，檢測限為0.3μg，認為該法靈敏度高、簡單快捷。王浩等[4]利用凝膠過濾-HPLC法測定牛奶中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量，實驗測定兩者的分離度為1.0，同時回收率可達到90%以上。

盡管HPLC法具有上述許多優(yōu)點，但由于通常使用的檢測器為紫外檢測器，然而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)通常又較為復(fù)雜且易改變，因此在實際的分離分析中常出現(xiàn)蛋白質(zhì)死吸附現(xiàn)象，從而使蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果偏低。

1.2 生物質(zhì)譜技術(shù)

當前，生物質(zhì)譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)定性分析與定量測定等方面。安美忱等[5]通過探究性試驗，對牛乳鐵蛋白素進行含量測定，結(jié)果為18.20 mg /L。Christophc等[6]利用HPLC-MS法測定牛奶中β-Lg含量時，通過使用物理化學(xué)性質(zhì)類似的物質(zhì)作為內(nèi)標物，從而消除提純過程中β-Lg損失所造成的影響，可準確實現(xiàn)對β-Lg的定量。Felfoul等[7]也利用HPLC-MS法對牛奶中α-La、β-Lg和Caseins含量進行測定，發(fā)現(xiàn)當溫度達到80℃時，無法檢測到前兩者，而后者卻能夠表現(xiàn)較高的活性，并能夠準確的含量測定，研究結(jié)果提示對蛋白質(zhì)進行含量測定時前處理最好避免遭受高溫，從而減少測量誤差。

1.3 離子交換色譜法

離子交換色譜法不僅能夠應(yīng)用于無機離子的含量測定，也能測定有機離子的含量。趙凌國等[8]利用該法測定牛奶中乳鐵蛋白的含量，通過正交試驗，確定最佳孵育時間為2h，洗脫pH為6.0，此條件下可準確測定乳鐵蛋白的含量。離子交換色譜法具有損耗率低、交換容量較大等優(yōu)點，不足之處在于對分子型混合物難以進行含量測定、蛋白質(zhì)峰容易重疊以及分離效果不佳等。

2 分光光度法

分光光度法的基本原理是Lambert-Beer定律，即被測物含量與吸光強度成正比。因此，可通過對待測物質(zhì)的吸光度從而對其進行含量測定，分光光度法中較為常用的為紫外-可見分光光度法和近紅外分光光度法。

2.1 紫外-可見分光光度法

紫外-可見分光光度法的檢測波長為200～800nm，適用于在該范圍內(nèi)能產(chǎn)生吸收的物質(zhì)，不僅可用于含量測定，也可用于物質(zhì)的鑒別以及雜質(zhì)的檢查。由丹青[9]利用紫外-可見分光光度法測定牛奶中蛋白質(zhì)的含量，試驗發(fā)現(xiàn)該法線性范圍較廣，回收率為93%～101%，RSD為0.5%～0.8%，含量測定結(jié)果較為準確。李良等[10]通過比較紫外-分光光度法和凱氏定氮法在蛋白質(zhì)含量測定方面的異同，發(fā)現(xiàn)兩種方法測定結(jié)果并無明顯差異，同時也發(fā)現(xiàn)紫外-分光光度法測定大批量樣品蛋白質(zhì)的具有明顯的優(yōu)勢。同時，其他研究人員也利用紫外-分光光度法測定蛋白質(zhì)含量[11-13]。

2.2 近紅外分光光度法

近紅外分光光度法檢測波長為780～2526nm，適用于在該范圍內(nèi)能產(chǎn)生吸收的物質(zhì)。李雙紅等[14]通過正交試驗，對牛奶中蛋白質(zhì)含量進行測定，利用多種方法建模，并對其進行評定，結(jié)果顯示一胎和二胎奶牛中乳蛋白具有相同的最優(yōu)模型，這為測定原料牛奶中含量提供了理論上的依據(jù)。單楊等[15]建立了蛋白質(zhì)預(yù)測模型，蛋白質(zhì)含量利用凱氏定氮法求出，該模型的優(yōu)點為檢測成本低、應(yīng)用范圍較廣等，但其準確度與精確度等需要提高。

3 滴定法

滴定法的原理是當?shù)竭_滴定終點時，通過標準溶液的消耗量求出待測溶液的濃度，主要分為人工滴定法與自動電位滴定法兩類。高美玲等[16]認為，凱氏定氮法誤差較大，因此對其進行優(yōu)化，通過加入乙醇沉淀蛋白質(zhì)，并通過濃硫酸消耗該沉淀，最終實現(xiàn)了準確測定蛋白質(zhì)含量的目的。周曉琳等[17]對凱氏定氮法進行優(yōu)化后，確保了凱氏定氮法能夠準確測定高蛋白的含量。王靜等[18]認為人工滴定誤差較大，從而研制出自動凱氏定氮儀，不僅減少了試驗誤差，還具有檢測速度快、分辨率高等優(yōu)點。何莉萍[19]探究了影響蛋白質(zhì)含量測定的因素，發(fā)現(xiàn)測定條件在pH＜3、測定溫度25℃時，線性范圍廣，同時線性關(guān)系也較好。

4 酶聯(lián)免疫吸附法

該法是由荷蘭兩學(xué)者于1971年提出，其基本原理是通過酶與復(fù)合物的結(jié)合產(chǎn)生顏色反應(yīng)，通過顏色的深淺對待測物進行定量測定。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）經(jīng)文獻報道也能應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量測定中。馬智偉等[20]通過應(yīng)用優(yōu)化后的前處理方法獲得到了高純度的IgG，利用HRP-兔抗牛IgG作為二抗，使用ELISA法對其進行含量測定。也可利用ELISA法對初乳、過渡乳和成熟乳中蛋白質(zhì)的含量進行測定，發(fā)現(xiàn)LF的含量依次降低，同時還發(fā)現(xiàn)，LF的含量與孕婦所攝取的營養(yǎng)有關(guān)，與體重、年齡等無明顯關(guān)系。ELISA法具有操作簡便、準確度高等優(yōu)點，能夠放大反應(yīng)的效果，可進一步提高ELISA法測定蛋白質(zhì)的靈敏度。但該方法有時會產(chǎn)生假陽性與假陰性結(jié)果，易受到交叉免疫性的影響[21]。

5 聯(lián)合測定法

在實際的測定過程中，有時一種方法不能夠準確測定蛋白質(zhì)的含量，此時就需同時應(yīng)用兩種或兩種以上的方法才能實現(xiàn)蛋白質(zhì)含量準確測定的目的。孫雯[22]將凱氏定氮法與等電點法聯(lián)用，沉淀的條件為酸性，而復(fù)溶的條件為堿性，從而利用凱氏定氮法測定乳蛋白含量。樂薇等[23]通過數(shù)碼比色法測定牛乳中蛋白質(zhì)的含量，采用考馬斯亮藍染色，從而計算蛋白質(zhì)含量，實驗發(fā)現(xiàn)該法RSD＜2%，同時加樣回收率在98%～103%范圍內(nèi)，上述兩種方法聯(lián)用具有測定時間短、準確度高等優(yōu)點。

6 氨基酸折算法

除上述蛋白質(zhì)含量測定方法外，氨基酸折算法也可用于蛋白質(zhì)含量的測定。國外研究機構(gòu)使用氨基酸折算法測定奶粉中乳清蛋白和酪蛋白的含量，檢測的理論基礎(chǔ)為Asx、Ala、Phe和Pro四種氨基酸的含量，通過這四種氨基酸的含量從而可折算出奶粉中乳清蛋白和酪蛋白的含量。李爽等[24]通過對上述蛋白質(zhì)測定方法進行評估后發(fā)現(xiàn)，并不是所有奶粉都能夠應(yīng)用氨基酸折算法測定蛋白質(zhì)的含量，例如含豆配方奶粉中含有的大豆分離蛋白在測定過程中能夠改變氨基酸的組成，因此該法不適用于含豆配方奶粉蛋白質(zhì)含量測定。

7 結(jié)語

我國是一個人口大國，食品安全問題較為突出，本文綜述了蛋白質(zhì)含量測定方法最新研究進展，總結(jié)歸納了色譜法、分光光度法、滴定法、酶聯(lián)免疫吸附法、聯(lián)合測定法以及氨基酸折算法六種蛋白質(zhì)含量測定方法，同時比較了上述測定方法的優(yōu)缺點。由于部分蛋白質(zhì)含量測定方法存在檢測費用高、檢測過程復(fù)雜等缺點，因此，建立檢測成本低、操作簡便的蛋白質(zhì)含量測定方法具有重要的現(xiàn)實意義。