傳染性蛋白的“負(fù)面”和“正面”（6）

朱欽士 （美國南加州大學(xué)醫(yī)學(xué)院）

（上接2018年第8期第18頁）

2.18 酵母細(xì)胞中的傳染性蛋白質(zhì) 酵母在一般情況下是單細(xì)胞的真核生物，與動物相比是較“原始”的，但酵母中存在傳染性蛋白的線索在半個世紀(jì)前就被發(fā)現(xiàn)了，比瘋牛病報道的年代（1986年）還早。1965年，英國科學(xué)家Brian Cox發(fā)現(xiàn)，出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）的一個“突變種”中，細(xì)胞對轉(zhuǎn)譯終止碼的識別出了問題，即肽鏈合成至mRNA上的轉(zhuǎn)譯終止碼（UAG和UAA）時，轉(zhuǎn)譯過程并未停止，而是繼續(xù)進(jìn)行，好像核糖體對終止碼“視而不見”。在與腺嘌呤的合成有關(guān)的一個基團(tuán)發(fā)生突變（ade2-1基因突變），在編碼序列中提前出現(xiàn)一個終止碼時，在正常情況下突變型酵母是不能合成完整的酶的，因?yàn)楹铣蛇^程提前終止。由于這個酶功能的缺失，腺嘌呤合成過程中的中間產(chǎn)物就會在細(xì)胞中聚集，使得菌斑成為紅色，這個突變型酵母也必須從培養(yǎng)液中獲得腺嘌呤才能生長。而有終止碼識別問題的酵母會“忽略”此終止碼，生產(chǎn)出完整的酶，腺嘌呤的合成正常進(jìn)行，菌斑為白色（因?yàn)闆]有中間產(chǎn)物聚集），培養(yǎng)基里也不用添加腺嘌呤。

該終止碼識別缺失的特性還可遺傳，使得后代的所有酵母都擁有此特性。按照分子生物學(xué)的經(jīng)典理論，負(fù)責(zé)這個性狀遺傳的應(yīng)該是某個問題基因，即通過DNA遺傳，且是“顯性”（dominant）遺傳，即2份基因中只要有一份基因突變，后代就可獲得突變引起的性狀。Cox將酵母的這個性狀用希臘字母ψ標(biāo)記，讀音為psi。然而對遺傳方式的研究結(jié)果卻與預(yù)期不符。例如將變種與正常的酵母雜交，后代應(yīng)該是一部分有終止碼識別問題，一部分沒有，但結(jié)果卻是雜交的所有后代都沒有終止碼識別問題，好像這個突變基因又變成了“隱性”（recessive）的，即需要2份基因都發(fā)生突變才表現(xiàn)突變癥狀。即酵母該性狀的遺傳方式與經(jīng)典的孟德爾遺傳方式不同，稱為“非孟德爾型遺傳”（non-Mendelian heredity）。

此現(xiàn)象讓科學(xué)家困惑了幾十年，即使在1982年P(guān)rusiner提出傳染性蛋白的概念之后，科學(xué)家仍然沒有想到酵母的異常遺傳現(xiàn)象可用傳染性蛋白進(jìn)行解釋。直至1994年，美國科學(xué)家Reed B.Wickner才從傳染性蛋白致病的事實(shí)中得到啟發(fā)，發(fā)現(xiàn)了酵母的另一個性狀，即在氮源利用上的機(jī)制變化，也是由傳染性蛋白控制和遺傳的（見下文），由此開啟了酵母傳染性蛋白的研究。在這之后2年，即1996年，美國的Susan Lindquist等才證明酵母的psi性狀也是通過傳染性蛋白遺傳的?？茖W(xué)家用［PST+］表示此性狀，其中的大寫字母和正號表示“顯性”，而括弧表示“非孟德爾型遺傳”。沒有這個psi性狀的酵母則用小寫字母和負(fù)號［pst-］表示。

此遺傳不是通過DNA，而是通過細(xì)胞質(zhì)完成的。起遺傳作用的是一個稱為Sup35的蛋白質(zhì)改變折疊方式，變成了Prion型的結(jié)構(gòu)。在正常酵母細(xì)胞中，Sup35是水溶性的，并與另一個蛋白Sup45一起，識別mRNA上的轉(zhuǎn)譯終止碼，并將合成完成的肽鏈從核糖體上解離下來。類似ApoA-I蛋白能改變折疊狀況的氨基端，Sup35的氨基端也能改變折疊方式，變成Prion蛋白那樣的橫向β-折疊，進(jìn)而形成聚合物。此聚合物能結(jié)合剛果紅，對聚合物的圓二色性（CD）測定表明其中富含β-折疊，說明其結(jié)構(gòu)和Prion蛋白類似。這個改變了折疊方式的Sup35蛋白，像PrPsc能將PrPc改變成自己的結(jié)構(gòu)一樣，也能將水溶性的Sup35改變成不溶于水的聚合物，即具有“傳染性”，最后使得酵母細(xì)胞中所有的Sup35都轉(zhuǎn)變成為聚合物而失去功能，使細(xì)胞不再能識別轉(zhuǎn)譯終止碼，其作用和Sup35的基因突變使Sup35蛋白喪失功能的效果是一樣的。

將提純的Sup35蛋白在體外變?yōu)榫酆衔铮僖耄踦si-］型的酵母，可將［psi-］型的酵母變?yōu)椋跴ST+］型的酵母。當(dāng)［PSI+］型的酵母與［pst-］型的酵母雜交時，［PSI+］細(xì)胞中的Sup35聚合物還會將［psi-］型酵母中的可溶性Sup35變?yōu)榫酆衔铩２粌H如此，酵母細(xì)胞中的熱休克蛋白Hsp104還能將這些聚合物分為小塊，在細(xì)胞中均勻分布，在細(xì)胞繁殖時進(jìn)入每一個后代細(xì)胞。因此在這里，Sup35蛋白的Prion形式不僅具有“傳染性”（即以可溶性Sup35蛋白為原料自我復(fù)制），它還具有“遺傳性”，在所有的后代細(xì)胞中出現(xiàn)，好像這個遺傳是“顯性”的。而Sup35基因突變的遺傳方式則是孟德爾型的隱性遺傳（需要2份基因突變才能使正常Sup35的功能消失）。

酵母的另一個傳染性蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞氮代謝的蛋白Ure2p。在有優(yōu)質(zhì)氮源（例如氨和谷氨酰胺）時，Ure2p能抑制另一個蛋白Gln3p的作用，使得細(xì)胞在有優(yōu)質(zhì)氮源時不能使用低質(zhì)量的氮源（例如uredosuccinate，Ure2p的名稱的由來）。當(dāng)Ure2p變成Prion形式，即變?yōu)闆]有正常功能的蛋白時，對Gln3p的抑制解除，細(xì)胞就可以在有優(yōu)質(zhì)氮源時也能使用低質(zhì)量的氮源。酵母的這種狀態(tài)被稱為［URE3］。

與Sup35蛋白和ApoA-I蛋白類似，Ure2p蛋白的氨基端也較易改變折疊狀況，形成Prion蛋白那樣的β-折疊結(jié)構(gòu)。提取的Ure2p片段（殘基1～65）可在試管中迅速形成小纖維。這些小纖維能被剛果紅染色，并在偏振光顯微鏡下呈蘋果綠的雙折射現(xiàn)象，說明與動物的傳染性蛋白形成的小纖維有類似的結(jié)構(gòu)。這樣形成的小纖維也能使全長的Ure2p蛋白改變折疊狀況，形成更粗的小纖維，說明該結(jié)構(gòu)能夠復(fù)制自己。［URE3］的性狀是遺傳性的，即可傳遞給下一代。此遺傳也需要Hsp104的參與。

酵母［PSI+］和［URE3］性狀的形成并不需要Sup35和Ure2p的基因突變，而是可以自然發(fā)生。5%的乙醇能極大增加這2個蛋白變成Prion類型蛋白的幾率。這些蛋白表達(dá)水平的升高也會使Prion型蛋白出現(xiàn)的幾率增加。與動物的傳染性蛋白對細(xì)胞有傷害性不同，［PSI+］和［URE3］的性狀能遺傳給后代，說明Sup35和Ure2p蛋白形成的Prion型聚合物對酵母細(xì)胞的害處并不大，甚至有人認(rèn)為酵母中傳染性蛋白的形成，也許是酵母在不改變基因的DNA序列的情況下適應(yīng)某些不利生活條件的一種方法。

除Sup35和Ure2p蛋白，酵母的其他一些蛋白也可轉(zhuǎn)變?yōu)镻rion型的結(jié)構(gòu)，所以也屬于酵母的傳染性蛋白，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Mot3（modulator of transcription）可形成［MOT3+］，修改酵母轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）的蛋白Mod5（tRNA modification）可形成［MOD+］，改變酵母染色質(zhì)的蛋白SwiI可形成［SWI+］等。這些蛋白折疊方式的改變也導(dǎo)致酵母性狀的改變。

檢查酵母傳染性蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)容易形成Prion型結(jié)構(gòu)的功能域含有較多的谷氨酰胺和天冬酰胺殘基，而少有帶電的氨基酸側(cè)鏈。將功能域中的氨基酸序列打亂，隨機(jī)排列，功能域仍具有形成Prion型結(jié)構(gòu)的能力，說明不是具體的氨基酸序列，而是氨基酸的組成，是決定一段肽鏈?zhǔn)欠袢菀祝ɑ蛘吣軌颍┬纬蒔rion型結(jié)構(gòu)的因素。造成人類杭廷頓氏癥的Huntingtin基因，就是增加了很多CAG重復(fù)序列，相當(dāng)于在蛋白中增加了許多谷氨酰胺殘基，使其轉(zhuǎn)變?yōu)镻rion型結(jié)構(gòu)的可能性極大增加。

但不是所有的Prion型功能域都富含谷氨酰胺和天冬酰胺。例如引起阿茨海默癥的Aβ肽鏈就不富含這2種氨基酸，在42個氨基酸殘基中只含有1個谷氨酰胺和1個天冬酰胺殘基，且不少氨基酸殘基的側(cè)鏈含有帶電基團(tuán)。即使酵母的傳染性蛋白Mod5也沒有富含這2種氨基酸的功能域，說明其他氨基酸組成的肽鏈區(qū)段也可能有形成Prion型結(jié)構(gòu)的能力。但是富含谷氨酰胺和天冬酰胺的特點(diǎn)，還是可以代表一部分傳染性蛋白的功能域，可用于搜尋其他蛋白中類似的功能域。在此思想指導(dǎo)下，Susan Lindquist編寫了用氨基酸組成預(yù)測肽鏈變?yōu)镻rion型結(jié)構(gòu)的程序，可用于檢測其他生物中的蛋白是否也含有類似的功能域。用該程序，科學(xué)家在細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了傳染性蛋白。

2.19 肉毒桿菌中的傳染性蛋白Rho（ρ）如上所說，許多傳染性蛋白都有自己形成Prion型結(jié)構(gòu)的功能域，其中一些（特別是酵母的傳染性蛋白）富含谷氨酰胺和天冬酰胺。2017年，美國科學(xué)家Ann Hochschild用酵母的傳染性蛋白為模板，搜尋約6萬個細(xì)菌的基因組，發(fā)現(xiàn)肉毒桿菌（Clostridium botulinum）的Rho（代表希臘字母ρ）蛋白含有這樣的功能域（在殘基74～141）。

Rho蛋白，類似酵母的Sup35蛋白，也是負(fù)責(zé)終止基因表達(dá)的蛋白。Sup35的功能是與Sup45一起識別轉(zhuǎn)譯終止碼，使核糖體停止肽鏈的合成過程，并將新合成的肽鏈從核糖體釋放出來；而Rho蛋白以六聚體的形式，結(jié)合在新合成mRNA分子上，停止轉(zhuǎn)錄并釋放新合成的mRNA分子。

為證明此功能域確實(shí)能形成Prion型的結(jié)構(gòu)，Hochschild將 Rho的74～141片段、1～248片段（其中包含74～141片段），以及殘基1～73被除去的Rho片段（也含有74～141片段）表達(dá)在大腸桿菌中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3個片段都能形成Prion型的聚合物。這些聚合物能結(jié)合剛果紅，并在偏振光顯微鏡上呈現(xiàn)蘋果綠色的雙折射現(xiàn)象。相反，不含此功能域的Rho蛋白片段（例如殘基1～141被去掉），則不形成這樣的聚合物。

Rho蛋白變成Prion型的結(jié)構(gòu)后，理論上它終止轉(zhuǎn)錄過程的功能也應(yīng)消失。為證明這一點(diǎn)，Hochschild利用在大腸桿菌中的基因表達(dá)系統(tǒng)，將Rho的Prion功能域與大腸桿菌Rho蛋白的羧基端相連接，再觀察對“報告基因”（受某個啟動子操控，表達(dá)產(chǎn)物容易檢測的基因）表達(dá)的影響。結(jié)果表明，大腸桿菌會有2種狀態(tài)，報告基因高表達(dá)的狀態(tài)和低表達(dá)狀態(tài)，說明這樣的雜合Rho蛋白有2種功能狀態(tài)。從這2種大腸桿菌中提取的Rho蛋白表明，低表達(dá)細(xì)菌中的Rho處于聚合物的狀態(tài)，而高表達(dá)的Rho蛋白處于可溶狀態(tài)。

不僅如此，2種表達(dá)狀態(tài)不同的大腸桿菌還能以低概率相互轉(zhuǎn)化，說明Rho蛋白可在聚合狀態(tài)和可溶狀態(tài)間相互轉(zhuǎn)化。聚集狀態(tài)可長期在大腸桿菌中維持，在傳120代之后仍然保持聚集狀態(tài)，說明細(xì)菌的Rho蛋白不僅具有傳染性，且與酵母一樣具有遺傳性。

由于Rho蛋白是以酵母富含谷氨酰胺和天冬氨酸殘基的功能域?yàn)槟０逅褜さ降?，?xì)菌很可能還含有其他氨基酸殘基組成的功能域，例如像人類PrP蛋白的功能域和Aβ肽鏈那樣的功能域。

傳染性蛋白在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，說明形成Prion型結(jié)構(gòu)的蛋白功能域出現(xiàn)的時間非常之早，在原核生物和真核生物分開之前就發(fā)生了。傳染性蛋白改變折疊方式，進(jìn)而聚合而喪失功能，也許是微生物適應(yīng)嚴(yán)酷環(huán)境的一種方式。例如Sup35和Rho蛋白變成Prion形式后，原來轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的功能消失，造成更長的mRNA和肽鏈的形成，在mRNA的穩(wěn)定性和蛋白的功能上都會發(fā)生改變，在一些環(huán)境條件下對生物的生存可能是有利的。這種方式不需要基因發(fā)生突變，而又能傳遞給后代，因此是對微生物有利的機(jī)制而得以保存。這種遺傳方式不同于通過DNA的基因遺傳，而是通過細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)的遺傳。從這些蛋白質(zhì)的傳染性（復(fù)制自己的結(jié)構(gòu)）和遺傳性（能通過聚合物的形式傳給后代）這2個方面來看，蛋白質(zhì)里儲存的信息是可以被輸出的。

2.20 植物中的傳染性蛋白 使用自己編寫的搜尋Prion型功能域的程序，Lindquist搜尋了植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的基因組，發(fā)現(xiàn)了474個擬南芥蛋白含有類似的Prion型的功能域。其中的3個蛋白與擬南芥開花控制有關(guān)，分別是LD（luminidependens）、FPA（Flowering Locus PA)和FCA（Flowering Locus CA）。其中LD是一個轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)PA和FCA是RNA結(jié)合蛋白。

為證明這些功能域的確能形成Prion類型的結(jié)構(gòu)，Lindquist將這些功能域與綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）融合在一起，在酵母中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這3個功能域都能形成淀粉樣聚合物。

將這3個功能域與酵母Sup35蛋白的羧基端融合在一起，在有Ade基因突變（即在編碼區(qū)中提前引入一個轉(zhuǎn)譯終止碼）的酵母中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它們能在部分酵母中使Sup35的羧基端喪失功能，使酵母能忽略該終止碼，合成完整的蛋白，說明這些功能域的確能發(fā)揮Prion結(jié)構(gòu)的作用，即使可溶性的蛋白喪失功能。有些酵母仍然不能忽略終止碼，說明有部分Sup35羧基端仍處于功能狀態(tài)，不因?yàn)榕c植物的Prion功能域融合就喪失功能，即植物蛋白的Prion功能域在酵母中也不完全形成Prion型的結(jié)構(gòu)。

同樣，由于這幾個蛋白是以酵母富含谷氨酰胺和天冬氨酸殘基的功能域?yàn)槟０逅褜さ降模参锖芸赡苓€含有其他氨基酸殘基組成的功能域。目前對植物傳染性蛋白的研究還很少，估計隨著研究的進(jìn)展，會有更多的植物傳染性蛋白被發(fā)現(xiàn)。

2.21 傳染性蛋白有“光明面”嗎 從以上例子可以看出，蛋白肽鏈的折疊出現(xiàn)錯誤，形成Prion型的橫向β-折疊結(jié)構(gòu)，進(jìn)而聚集形成淀粉樣沉積，是肽鏈在折疊過程中不可避免地要出現(xiàn)的問題。生物既然選擇了用氨基酸組建蛋白質(zhì)，就不能完全避免折疊狀態(tài)出問題的可能性。Prion型的結(jié)構(gòu)就像是一個“折疊陷阱”，一旦掉入此結(jié)構(gòu)，就很難再出來。不僅如此，開始形成的聚合物就像一個“黑洞”，不斷將周圍正常的蛋白“吸”入自己的結(jié)構(gòu)，讓自己長大，使得這種結(jié)構(gòu)的蛋白具有傳染性。

在形成Prion型的結(jié)構(gòu)時，由于蛋白分子的結(jié)構(gòu)改變，通常都會導(dǎo)致蛋白質(zhì)原先正常的生理功能喪失。不僅如此，在人和其他高等動物中，淀粉樣的沉積物，無論是在細(xì)胞內(nèi)還是在細(xì)胞外，幾乎對細(xì)胞都是有害的，導(dǎo)致各式各樣的淀粉樣變性病?，F(xiàn)在一提到傳染性蛋白，人們想到的都是它造成的可怕后果，即蛋白折疊方式改變所造成的后果總是負(fù)面的。Prion被譯為“朊病毒”，和疾病傳染源劃歸一類，就反映了這種情況。即使在酵母中，［PSI+］和［URE3］也被一些科學(xué)家看作是傳染性蛋白病。由于許多醫(yī)院并不進(jìn)行淀粉樣病變的檢測工作（例如對需要透析和換腎的患者并不進(jìn)行淀粉樣沉積的檢查），淀粉樣變性病的實(shí)際發(fā)生率估計要比已報道的為多。不過總的說來，淀粉樣變性病的發(fā)病率還是很低的，動物億萬年的演化，已最大限度地減少了蛋白折疊錯誤及其帶來的不良后果，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的淀粉樣變性病，是動物對肽鏈折疊錯誤的各種防御機(jī)制在一些情況下不可避免的失效所造成的結(jié)果。

現(xiàn)在的問題是，蛋白折疊錯誤的后果總是負(fù)面的，是否還是有其“光明面”？近年來的科學(xué)研究表明，蛋白形成淀粉樣聚合物不僅有致病作用，也有正面效果。在本文的第3部分中，將詳細(xì)介紹淀粉樣聚合物的“正面作用”，即它們的生理功能。

（待續(xù)）