1例痤瘡患者面部細菌的分離鑒定及耐藥分析

張 婧,郝羽翀,王 雨*

(1.吉林大學第一醫(yī)院，吉林 長春130021;2.吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院)

面部痤瘡是多種機制共同作用的結(jié)果，它的發(fā)生主要與皮脂腺分泌過多、細菌感染、毛孔堵塞以及炎癥過敏等方面有關(guān)，除此之外還與遺傳或者心理壓力等因素息息相關(guān)[1]。我們從一例臨床患者面部痤瘡位置分離得1株細菌，對其進行分離純化并結(jié)合理化特性進行鑒別，以期對痤瘡患者的病因有更深一步的認識。

1 病例摘要

患者女性，年齡23歲，于2017年3月就診于吉林大學第一醫(yī)院皮膚科，患者的痤瘡病程為1年零2月，臨床確診為面部痤瘡患者，近3個月內(nèi)參加過其他面部臨床研究或接受過皮膚科醫(yī)生治療，皮損形態(tài)有粉刺及囊腫。病情分度依據(jù)Pillsbury分類法,確定為中度(Ⅱ)[2]。用無菌棉簽收集患者痤瘡破處液體，并在無菌生理鹽水中進行溶解稀釋。取含菌的生理鹽水50 μl均勻涂布在血平板上，分別在有氧及無氧條件下，37℃過夜培養(yǎng)。利用厭氧罐培養(yǎng)法，在血平板進行培養(yǎng)，37 ℃過夜后，痤瘡丙酸桿菌的菌落形態(tài)呈灰白色或淡紅褐色，菌落約針尖大小，有凸起，表面光滑呈圓形[3]。菌落形態(tài)如圖1。挑取血平板上的單個菌落進行革蘭染色[4]，在100倍油鏡下進行觀察并拍攝。痤瘡丙酸桿菌革蘭染色呈陽性(Gram+)，不產(chǎn)芽孢營養(yǎng)類型為異養(yǎng)厭氧型，適應(yīng)性極強，能適用多種復雜環(huán)境。在100倍油鏡下觀察，細菌呈短桿狀，革染呈紫色，為典型的革蘭陽性菌[5]。油鏡觀察結(jié)果見圖2。利用經(jīng)典菌落PCR方法分析鑒別細菌類型，確定從患者病患處分離純化得一株厭氧菌，經(jīng)梅里埃細菌鑒定系統(tǒng)鑒定，后參照Negin NAGHDI等人的文獻[6]，以5′-AGCTCGGTGGGGTTCTCTCATC-3′，5′-GCTTCCTCATACCACTGGTCATC-3′為引物，PCR 反應(yīng)體系為50 μl，包括上、下游引物各0.4 μmol/L，模板2 μl，2×Taq Master Mix 25 μl。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延長1 min，共35 個循環(huán)； 72 ℃終末延長5 min。在PCR循環(huán)條件下行菌落PCR， 1%瓊脂糖凝膠電泳分離，并對PCR產(chǎn)物進行序列測定，經(jīng)BlastN比對測序結(jié)果[7]，按上文條件進行PCR后電泳結(jié)果如圖3，條帶大小為1 202 kb，測序結(jié)果顯示該株細菌為丙酸痤瘡桿菌，并命名為P.acnes1。為確定菌株對抗生素的敏感性，以便合理用藥，對所分菌株進行耐藥性分析。耐藥性測定系對PCR序列分析后確定為丙酸痤瘡桿菌的菌株經(jīng)平板稀釋法測定其對抗菌藥物的耐藥性[8]，每種藥物濃度均設(shè)50、100、200及400 μg/ml 4個濃度。平板結(jié)果顯示，P.Acnes1對檢測的14種抗生素中的5種耐藥，9種敏感抗生素為頭孢吡肟、頭孢米諾、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、克林霉素、鹽酸莫西沙、鹽酸左氧氟沙星和硫酸慶大霉素。在耐藥的5種抗生素中，阿奇霉素、頭孢西丁鈉和頭孢他美的耐受濃度為200 μg/ml，亞胺培南和氨芐西林鈉的耐受濃度為50 μg/ml[9]。藥敏試驗結(jié)果見表1。

2 討論

痤瘡是一種毛囊皮脂腺的慢性炎癥，好發(fā)于青年。其發(fā)生主要與皮脂分泌過多、毛囊皮脂腺導管堵塞、細菌感染和炎性反應(yīng)等因素密切相關(guān)[10]。Wang 等[11]將痤瘡患者鼻部皮膚微生物與痤瘡丙酸桿菌共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌可抑制痤瘡丙酸桿菌，實驗結(jié)果表明，也許可以通過微生物間相互抑制達到治療痤瘡的目的。研究表明該疾病對患者自我形象和生活質(zhì)量影響程度很大[12]。本例患者面部油脂分泌量明顯高于正常人，病程約一年，無痤瘡家族史，痤瘡瘢痕主要位于鼻部及下頜，對口服及局部治療藥物反應(yīng)性差，屬遲發(fā)型痤瘡。

本實驗通過傳統(tǒng)的臨床菌株分離[13]，獲得一株在無氧條件下，在血平板上長勢良好，在有氧條件下無法生長的細菌，經(jīng)過革蘭染色確定為紫色短桿菌，表現(xiàn)為典型的革蘭陽性細菌特征[14]。結(jié)合其生長條件，判斷為丙酸痤瘡桿菌，黃小芳等的文章中提及，痤瘡丙酸桿菌是一種革蘭染色的厭氧短桿菌，細胞內(nèi)寄生，屬于皮膚的正常菌群，一般寄居在皮膚的毛囊及皮脂腺中。隨著青少年的發(fā)育成熟，毛囊口出現(xiàn)角栓，皮脂腺分泌功能也明顯增加，因皮脂含有較多脂肪酸等成分，適合P.acnes的生長及繁殖，從而成為痤瘡最主要的病因之一[15]。利用丙酸痤瘡桿菌的保守序列設(shè)計引物，進行菌落PCR并結(jié)合電泳和測序分析，確定為一株丙酸痤瘡桿菌。在NCBI中進行BlastN操作，與已公布的序列進行比對，一致性在99%，確定為丙酸痤瘡桿菌[16]。

圖1P.acnes1在血平板上的形態(tài)圖2經(jīng)過革染的P.acnes1在100倍油鏡下形態(tài)圖3PCR電泳結(jié)果

表1 P.Acnes1的耐藥性測定結(jié)果

—”表示不耐藥,數(shù)字代表耐受的藥物濃度

痤瘡的發(fā)生與痤瘡丙酸桿菌的感染密切相關(guān)，口服抗生素是治療重型痤瘡有效的方法之一。國際上痤瘡治療共識推薦第二代四環(huán)素類藥物包括米諾環(huán)素、多西環(huán)素等作為痤瘡抗菌治療的首選藥物，其次是第一代四環(huán)素類藥物。針對該株細菌的藥敏性實驗，設(shè)定50、100、200及400 μg/ml四個濃度梯度，選用14種常見抗生素進行平板梯度稀釋實驗，結(jié)果顯示P.acnes1對14種抗生素中的5種有抗性，但并不能對三類(氨基糖苷類、紅霉素、β-內(nèi)酰胺類)或三類以上抗生素同時耐藥，故并非為多重耐藥菌[17]。通過對該株細菌的鑒定以及耐藥性分析進一步的了解了患者的病因，以期進行更好的護理。確?；颊叩囊缽男浴⑦x用有治療靶點的抗生素及足夠的治療療程是治療取得成功的關(guān)鍵。提高痤瘡患病早期就診率是預(yù)防重型痤瘡發(fā)生的基礎(chǔ)；為患者提供安全、有針對性、足夠療程的綜合治療是提高痤瘡治療效果的關(guān)鍵。以正確的態(tài)度對待，保證積極樂觀的精神狀態(tài)，并注意調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)，注重面部的清潔衛(wèi)生，保持良好的生活習慣，為早日治愈打好堅實基礎(chǔ)[18]。

[1]Safizadeh H，Shamsi-Meymandy S， Naeimi A.Quality of life in Iranian patients with acne[J].Dermato1 Res Pract，2012， 2012： 571.

[2]趙 辨.臨床皮膚病學[M].3版.南京：江蘇科學技術(shù)出版社，2001：935.

[3]楊 鵬.痤瘡丙酸桿菌的分離鑒定及其對小鼠抗傳染性胸膜肺炎放線桿菌感染研究[A].中國畜牧獸醫(yī)學會生物制品學分會、中國微生物學會獸醫(yī)微生物學專業(yè)委員會.首屆中國獸藥大會——獸醫(yī)生物制品學、獸醫(yī)微生物學學術(shù)論壇論文集(2008)[C].中國畜牧獸醫(yī)學會生物制品學分會、中國微生物學會獸醫(yī)微生物學專業(yè)委員會,2008:5.

[4]沈 杰.大腸菌群革蘭氏染色技術(shù)的實驗研究[J].干旱環(huán)境監(jiān)測,2008,(01):62.

[5]張 智,滕婷婷,程奕星.痤瘡丙酸桿菌生理生化特性及其致病性綜述[J].當代醫(yī)學(學術(shù)版),2008,(07):12.

[6]Naghdi N,Ghang M.A comparison of culture and PCR methods for identifying Propionibacterium acnes in lesions isolated from patients with acne[J].Turkish Journal of Medical Sciences,2017,47(3):967.

[7]馬雪嬌.臨床分離黏質(zhì)沙雷菌質(zhì)粒編碼的16S rRNA甲基化酶基因與β-內(nèi)酰胺酶基因的研究[D].安徽醫(yī)科大學,2015.

[8]王奇颯.云南地區(qū)痤瘡患者皮損分離痤瘡丙酸桿菌抗生素耐藥情況分析及重樓皂苷對痤瘡相關(guān)病原菌抑菌效果評價[D].昆明醫(yī)科大學,2016.

[9]劉麗華.重慶地區(qū)痤瘡丙酸桿菌對四種抗生素耐藥性的調(diào)查[D].重慶醫(yī)科大學,2007.

[10]馮世綸.經(jīng)方治療面部痤瘡[J].中華中醫(yī)藥雜志,2016,31(02):499.

[11]Wang Y，Kuo S，Shu M，et al．Staphylococcus epidermidis in the human skin microbiome mediates fermentation to inhibit the growth of Propionibacterium acnes:implications of probiotics in acne vulgaris[J].Appl Microbiol Biotechnol，2014，98(1):411．

[12]李沂軒,賀雪文,侯愛華.面部痤瘡患者兩種生活質(zhì)量量表的考評[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學雜志,2016,15(02):108.

[13]曾憲玉,姜 敏,付 辰,等.武漢地區(qū)痤瘡患者皮損中分離的丙酸桿菌耐藥性分析[J].中國皮膚性病學雜志,2014,28(02):131.

[14]周 曼.影響革蘭氏染色結(jié)果的因素及原因分析[J].標準計量與質(zhì)量,2003,(12):21.

[15]黃小芳.中國痤瘡患者的臨床表現(xiàn)、生活方式和情緒與痤瘡的相關(guān)分析[D].浙江大學,2016.

[16]黃 源.東方巴貝斯蟲頂質(zhì)體基因組的測序分析及RON2在入侵中作用的研究[D].華中農(nóng)業(yè)大學,2016.

[17]賴遠花,黃新偉.1例銅綠假單胞菌是否為多重耐藥菌的藥敏結(jié)果解讀[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2017,(15):138.

[18]王 莉.面部痤瘡的治療及護理[J].中國社區(qū)醫(yī)師,2015,31(16):140.