宮頸高危型HPV感染者外周血T、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞變化分析

余曉鳳,陳玲玲,王晶華,姜 浩,閻澤君,馮 軍

(承德醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院 承德市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河北 承德067000)

人乳頭瘤病毒(HPV)感染在年輕性活躍的個體中很常見。目前有超過200種HPV亞型被發(fā)現(xiàn)，其中有40種亞型能夠?qū)е律称鞲腥綶1]。根據(jù)2012年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)對HPV致癌性的分類[2]，常見的高危型包括HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59及68共13個型別，在99.7%的宮頸癌中能夠檢測到高危型HPV感染[3,4]，大約80%的宮頸癌是由HPV16和HPV18感染所致[5]。70%-80%的女性在其一生中會有至少一次感染HPV，大量流行病學(xué)資料表明人體HPV亞臨床感染(SPI)更為常見[6]，HPV感染中絕大部分為一過性感染，大多數(shù)病損可自行消退，有數(shù)據(jù)顯示[7]，約90%的HPV感染在2年內(nèi)自我清除，僅有不足1%的HPV感染可能發(fā)展為惡性腫瘤[8]。由此說明機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗HPV感染中發(fā)揮著重要作用。近年來，對于高危型HPV感染細(xì)胞免疫功能在外周血T淋巴細(xì)胞亞群研究較多但結(jié)果不一，而對全身免疫功能研究較少。因?yàn)閷m頸癌病理分型以鱗癌為主，腺癌及其他特殊類型癌少見，所以本研究中宮頸癌組選取宮頸鱗癌病人，通過檢測各組外周血T、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞變化，來進(jìn)一步研究和分析高危型HPV感染者全身免疫功能狀態(tài)，為臨床高危型HPV感染的免疫干預(yù)及預(yù)后提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 選取2015年11月至2017年1月于我院婦科門診及病房行宮頸癌篩查的患者，高危型HPV-DNA檢測陽性且分別行TCT檢查及陰道鏡下病理活檢者共133例為病例組，其中SPI 31例，平均年齡(43.06±7.98)歲；CINⅠ級24例，平均年齡(44.14±7.35)歲；CINⅡ級28例，平均年齡(42.28±6.96)歲、CINⅢ級26例，平均年齡(43.87±5.15)歲；SCC 24例，平均年齡(52.83±3.78)歲；另選擇同期高危型HPV-DNA陰性且宮頸液基細(xì)胞學(xué)(TCT)陰性健康者30例為對照，平均年齡(40.12±5.66)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡：21-55歲；高危型HPV感染：16型，18型，其他12種高風(fēng)險(xiǎn)亞型：31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68b陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠或哺乳期的女性患者；近1年內(nèi)使用過免疫抑制劑增強(qiáng)劑治療，且伴有免疫性疾病者；經(jīng)血清學(xué)或PCR法證實(shí)伴有其他病毒感染性疾病者；有重要臟器的器質(zhì)性病變者；精神疾病患者；近半年內(nèi)有重大手術(shù)、創(chuàng)傷等應(yīng)急刺激者；近2月接受全身抗病毒治療者；患有除宮頸癌以外的其他惡性腫瘤者；處于生殖道急性感染期者；雙重或多重高危型HPV感染者。

1.1.2主要試劑和儀器 由貝克曼庫爾特有限公司提供的四色淋巴細(xì)胞亞群試劑:CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5(PN.6607013)和CD45-FITC/CD16CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5(PN.6607073)；溶血素(OptilyseC,PN.A11895)；流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司，F(xiàn)C500)。

1.2方法

1.2.1病例組分組 嚴(yán)格按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)將高危型HPV-DNA檢測陽性，無臨床癥狀和體征者歸為SPI組，共31例；有宮頸病變且根據(jù)宮頸多點(diǎn)活檢及P16/Ki67雙染結(jié)果判定病變級別分為宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級(CINⅠ)組、 CINⅡ組、CINⅢ組及SCC組。

1.2.2HPV核酸分型檢測 (1)標(biāo)本采集：取患者宮頸脫落細(xì)胞，保存至專用細(xì)胞保存液，及時(shí)送檢。(2)檢測方法：使用羅氏cobas 4800 全自動核酸提取及熒光PCR分析系統(tǒng)對標(biāo)本行HPV核酸檢測及分型。

1.2.3淋巴細(xì)胞亞群檢測 (1)標(biāo)本采集：對符合標(biāo)準(zhǔn)的患者，在獲取其知情同意的情況下采集空腹靜脈血2 ml，EDTA抗凝。(2)實(shí)驗(yàn)操作：取流式管2只，將每個病人的樣本管分別標(biāo)記為A管和B管，用加樣槍分別吸取10 μl四色淋巴細(xì)胞亞群試劑于A管(CD45+/CD3+/CD4+/CD8+)和B管(CD45+/CD3-/CD16+CD56+/CD19+)中，再分別向A、B兩管中加入100 μl新鮮EDTA抗凝靜脈血，渦旋混勻，室溫避光放置15 min，然后分別向兩管中加入溶血素500 μl，渦旋混勻，室溫避光放置10 min，然后每管加入500 μl PBS，室溫平衡5 min，充分渦旋混勻，2 h內(nèi)上機(jī)檢測(計(jì)數(shù)10000個細(xì)胞)。(3)結(jié)果判定：流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)每10000個細(xì)胞中標(biāo)記細(xì)胞所占的百分比。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1HPV16/18型及其他高危型陽性在病例組間所占比例

從SPI到SCC，隨著宮頸病理分期進(jìn)展，HPV16型及HPV18型所占比例逐漸升高，其他型別所占比例相對降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.551，P<0.05)，見表1。

表1 HPV16/18型及其他高危型陽性在病例組間所占比例

2.2不同高危型別HPV感染各組間外周血淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平比較

HPV16/18型與其他型別感染各細(xì)胞變化趨勢一致：對照組、SPI及CINⅠ三組間各細(xì)胞變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CINⅡ與CINⅢ組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對照組及亞臨床組比較， CINⅡ、CINⅢ及SCC組CD4+、CD16+56+降低，CD8+升高，CD4+/CD8+降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且隨著病理分期的進(jìn)展，CD4+、CD16+56+依次呈下降趨勢，而CD8+逐漸上升， CD4+/CD8+逐漸降低，甚至SCC組的CD4+/CD8+顯著低于CINⅠ組，出現(xiàn)倒置現(xiàn)象，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD3+、CD19+在各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。SCC組與對照組流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果比較見圖1。

表2 不同型別HPV感染病例組及對照組外周血淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平比較

Note:acompared with the control group,P<0.05; bcompared with the group of SPI,P<0.05;ccompared with the group of CINⅠ,P<0.05;dcompared with the group of CIN Ⅱ,P<0.05; ecompared with the group of CIN Ⅲ;P<0.05.fcompared with the group of SCC;P<0.05.

Note:A1:CD3+CD4+in group of SCC;A2:CD3+CD8+in group of SCC;A3:CD3-CD16+CD56+in group of SCC;B1:CD3+CD4+in control group;B2:CD3+CD8+in control group;B3:CD3-CD16+CD56+in control group.

圖1SCC組與對照組外周血淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測散點(diǎn)圖

3 討論

目前國內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為高危型HPV持續(xù)感染是發(fā)生宮頸癌的主要危險(xiǎn)因素[9,10]。機(jī)體感染HPV后，會啟動一系列免疫應(yīng)答來清除HPV感染，有研究報(bào)道[11]HPV進(jìn)入人體96小時(shí)內(nèi)為固有免疫，96小時(shí)后主要為適應(yīng)性免疫。近年來研究表明機(jī)體抗HPV感染以細(xì)胞免疫為主，而T淋巴細(xì)胞亞群為細(xì)胞免疫中的關(guān)鍵成分[12]。本研究選取CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及SCC與對照組及SPI組比較，結(jié)果提示隨著宮頸病變程度的加重，HPV16/18所占比例越來越高，這也提示HPV16/18是導(dǎo)致宮頸癌前病變及宮頸癌的重要因素。各組間淋巴細(xì)胞亞群比較結(jié)果提示宮頸高級別病變及宮頸鱗癌患者體內(nèi)存在明顯的淋巴細(xì)胞亞群偏移現(xiàn)象，可能與發(fā)生病毒免疫逃逸有關(guān)，表現(xiàn)為固有免疫及細(xì)胞免疫功能降低，SCC組CD4+/CD8+<1,說明已經(jīng)出現(xiàn)免疫抑制，同時(shí)也說明患者體內(nèi)可能存在HPV持續(xù)感染。

輔助性T細(xì)胞(Th 細(xì)胞)是淋巴細(xì)胞的一個亞群， 根據(jù)分泌細(xì)胞因子不同，主要分為Th1與Th2兩種細(xì)胞，其中Th1主要參與細(xì)胞免疫反應(yīng)，Th2可輔助B細(xì)胞分化為抗體分泌細(xì)胞，參與體液免疫應(yīng)答。近年來大量研究表明Th細(xì)胞在抗HPV感染中具有重要意義[13，14]，其Th1/Th2比值的恒定能夠確保機(jī)體免疫功能的正常進(jìn)行，大量臨床研究表明，隨著高危型HPV感染患者病情的不斷加重，體內(nèi)的Th1及Th2之間的平衡狀態(tài)被消除，表現(xiàn)為Th2細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)，導(dǎo)致其所分泌的IL-4、IL-5等Th2型細(xì)胞因子占優(yōu)勢，進(jìn)而對細(xì)胞免疫產(chǎn)生抑制，使CD4+T細(xì)胞增殖分化受抑，從而使IL-2、IFNγ等Th1型細(xì)胞因子分泌減少，進(jìn)一步導(dǎo)致HPV感染者病情發(fā)展過快，致使機(jī)體對病毒產(chǎn)生耐受作用[15]。本研究中，隨著宮頸病變程度加重，高危型HPV感染者CD4+T逐漸減低，而CD8+T逐漸上升，CD4+/CD8+比值逐漸降低，宮頸癌組甚至出現(xiàn)倒置，提示患者已經(jīng)處于免疫抑制狀態(tài)。近年來對于高危型HPV感染者全身細(xì)胞免疫(外周血T淋巴細(xì)胞亞群)變化的研究，結(jié)果尚無定論。Chen ZF等[16]和Hernandez等[17]研究認(rèn)為高危型HPV感染者與非感染者相比，外周血T淋巴細(xì)胞亞群無明顯變化；而國內(nèi)有研究結(jié)果[18-20]表明有變化。而本研究顯示各病例組外周血淋巴細(xì)胞亞群比例有差異，且與宮頸病變病理分期有關(guān)，高級別癌前病變及宮頸癌患者存在細(xì)胞免疫減低，病變程度與HPV感染型別有關(guān)。

NK細(xì)胞是參與機(jī)體固有免疫的一類重要細(xì)胞，NK細(xì)胞及活化的NK細(xì)胞數(shù)量減少能夠使人體抗病毒、抗腫瘤的能力降低，而NK細(xì)胞自身所具有的活性是通過CD4+T細(xì)胞所分泌的IL-2、IFNγ實(shí)行調(diào)節(jié)的[21]，本研究中，高級別宮頸病變組及SCC 組CD4+T細(xì)胞均低于對照組、SPI組及低級別宮頸病變組，這可能是導(dǎo)致NK細(xì)胞降低的原因。本研究結(jié)果提示CD19+B細(xì)胞在各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明與體液免疫相關(guān)的B細(xì)胞在高危型HPV感染中無明顯變化。對于SPI組及CINⅠ來說，淋巴細(xì)胞亞群與對照組相比無明顯變化，這說明亞臨床感染及宮頸低級別病變的患者全身免疫功能基本正常。

綜上所述，通過檢測宮頸高危型HPV感染患者外周血T、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的變化，可以了解患者從HPV亞臨床感染至宮頸上皮內(nèi)瘤變甚至發(fā)展為宮頸癌的整個病變進(jìn)展過程中的全身免疫功能狀態(tài)。同時(shí)，可為臨床高危型HPV感染伴宮頸病變患者的免疫干預(yù)及預(yù)后提供客觀依據(jù)。

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