季節(jié)性流感疫苗研究進展

于志君，崔力文，程凱慧，高玉偉

流感是由流感病毒引起的一種可在人和多種動物間傳播的呼吸道傳染病[1]。根據(jù)流行程度和規(guī)模的不同，流感流行可分為流感大流行和季節(jié)性流感流行。根據(jù)抗原性和基因序列的不同，流感病毒可以分為A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒4種類型[2-3]。其中A型流感病毒可引發(fā)流感大流行，A型流感病毒和B型流感病毒均可引發(fā)季節(jié)性流感流行。A型流感病毒根據(jù)表面蛋白血凝素（hemagglutinin, HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase, NA）抗原性的不同可分為18種HA亞型和11種NA亞型[4-5]，目前引起季節(jié)性流感疫情的主要有2種亞型，H1N1亞型和H3N2亞型[6]。B型流感病毒分為2種類型，B/Yamagata/16/88樣B型流感病毒（Yamagata系）和B/Victoria/2/87樣B型流感病毒（Victoria系）[7]，均可引發(fā)季節(jié)性流感疫情。綜上所述，目前可引發(fā)季節(jié)性流感疫情的流感病毒主要有4種，分別是H1N1亞型流感病毒、H3N2亞型流感病毒以及2種B型流感病毒。

溫帶氣候條件下，季節(jié)性流感主要發(fā)生在冬季，而在熱帶地區(qū)，全年都可能發(fā)生流感，疫情暴發(fā)不規(guī)律[8]。季節(jié)性流感的特征包括高熱、咳嗽、頭痛、咽痛、流鼻涕、肌肉和關(guān)節(jié)痛以及嚴(yán)重的身體不適[9]。多數(shù)人在1周內(nèi)康復(fù)，臨床癥狀消失。季節(jié)性流感從感染到發(fā)病的時期稱為潛伏期，約為2 d。季節(jié)性流感的流行可嚴(yán)重影響任何年齡段的人群，但出現(xiàn)并發(fā)癥風(fēng)險最高的是孕婦、6～59個月兒童、老人、患有慢性疾?。ò滩　⑾?、慢性心肺疾病等）的人群以及衛(wèi)生保健人員[10]。根據(jù)WHO的報道，季節(jié)性流感每年都會在世界范圍內(nèi)肆虐，對老人、兒童以及免疫功能低下人群的危害尤其嚴(yán)重，每年會奪走大約50萬人的生命，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成巨大威脅[11]。疫苗是目前應(yīng)對季節(jié)性流感疫情最有效的手段，因此，WHO為了應(yīng)對季節(jié)性流感疫情，每年都會在2—3月、9月召開會議，推薦南、北半球季節(jié)性流感疫苗病毒株，其中2—3月是針對本年度的北半球流感季（北半球通常在每年10月至次年5月間發(fā)生季節(jié)性流感流行，2月為高峰），而9月則是針對下一年度的南半球流感季。此外，全球最新的季節(jié)性流感監(jiān)測信息都可從WHO網(wǎng)站（http://www.who.int/inf l uenza/surveillance_monitoring/updates/en/）上獲取。

目前常用的季節(jié)性流感疫苗分為兩大類，一類是滅活疫苗，另一類是減毒活疫苗，其中滅活疫苗主要為裂解疫苗。此外，目前在研的季節(jié)性流感疫苗還包括病毒樣顆粒（virus-like particles,VLPs）疫苗、細(xì)胞培養(yǎng)流感疫苗等。本文將結(jié)合最新的研究進展，綜述目前季節(jié)性流感疫苗的研究和應(yīng)用情況。

1 常用季節(jié)性流感疫苗

1.1 裂解疫苗 流感病毒裂解疫苗是通過采用WHO推薦的流行毒株，經(jīng)過雞胚孵化培養(yǎng)收獲病毒，再結(jié)合滅活疫苗生產(chǎn)工藝制備而成[12]。主要生產(chǎn)過程包括收獲流感病毒，通過裂解劑在適當(dāng)?shù)牧呀鈼l件下裂解流感病毒，去除病毒核酸和大分子蛋白，保留有效抗原成分 HA蛋白和NA蛋白，去除裂解劑以及純化有效抗原成分等步驟，制備的流感病毒裂解疫苗可有效保持流感病毒的免疫原性，還能夠降低疫苗接種后不良反應(yīng)發(fā)生的幾率，具有良好的安全性[13]。

我國目前使用的季節(jié)性流感疫苗主要是流感病毒裂解疫苗[14]。2018年以前，我國生產(chǎn)的流感病毒裂解疫苗全部為三價流感疫苗，然而三價疫苗在預(yù)防季節(jié)性流感疫情方面有時候會出現(xiàn)覆蓋不全面的問題。例如，2017—2018年季節(jié)性流感季，我國季節(jié)性流感疫苗株組分包括A1型病毒（WHO當(dāng)年推薦的H1N1亞型流感病毒流行株）、A3型病毒（WHO當(dāng)年推薦的H3N2亞型流感病毒流行株）和BV型病毒（WHO當(dāng)年推薦的Victoria系B型流感病毒流行株）。而2017年12月—2018年初，我國各地流感疫情明顯增多，且該高發(fā)季，以Yamagata系B型流感病毒毒株占流行優(yōu)勢，H1N1亞型流感病毒和H3N2亞型流感病毒共同流行[15]。由于本季三價流感疫苗含有的B型流感毒株成分并非是我國占流行優(yōu)勢的Yamagata系毒株，進而導(dǎo)致流感疫苗的保護效果受到一定的影響，引發(fā)流感疫情[16-17]。為了覆蓋近年來全球流感病毒流行的主要亞型，研發(fā)使用四價流感疫苗就成為當(dāng)前疾病防控的一種迫切需求。2018年6月8日，我國國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了華蘭生物疫苗有限公司等企業(yè)的四價流感病毒裂解疫苗的生產(chǎn)注冊申請，獲批上市的四價流感病毒裂解疫苗除包含普通三價流感疫苗的A1、A3、BV型病毒外，還包含BY型病毒（WHO當(dāng)年推薦的Yamagata系B型流感病毒流行株），這也是2017—2018年我國流感季流行的主要病毒株，該四價疫苗主要用于預(yù)防3歲及以上人群流感病毒的感染。四價流感病毒裂解疫苗是對我國流感病毒疫苗品種的有力補充，將與三價流感疫苗一起共同對我國防控季節(jié)性流感疫情發(fā)揮重要作用。

流感病毒裂解疫苗的臨床不良反應(yīng)主要包括頭疼、出汗、肌肉疼、關(guān)節(jié)疼、高熱、感覺不適、寒戰(zhàn)、疲倦、瘙癢、蕁麻疹或非特異性皮疹等，此外注射部位有可能會出現(xiàn)發(fā)紅、腫脹、疼痛、皮膚出血以及硬結(jié)等局部反應(yīng)。以上臨床不良反應(yīng)不需任何治療，癥狀通常在1～2 d內(nèi)自然消退。

1.2 亞單位疫苗 20世紀(jì)70和80年代，在裂解疫苗的基礎(chǔ)上，又研制出了亞單位表面抗原HA和NA疫苗，通過選擇合適的裂解劑和裂解條件，將流感病毒膜蛋白HA和NA裂解下來，選用適當(dāng)?shù)募兓椒ǖ玫郊兓腍A和NA蛋白。亞單位型流感疫苗具有很純的抗原組分，可用于兒童。1980年英國首次批準(zhǔn)使用該種疫苗，而后擴展到其他國家。多年的臨床應(yīng)用表明亞單位疫苗與流感裂解疫苗同樣具有很好的免疫效果和臨床安全性，接種人體后可刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體[18]。流感病毒亞單位疫苗的臨床不良反應(yīng)與流感病毒裂解疫苗的基本相同，但發(fā)生幾率更低。

1.3 減毒活疫苗 相較于流感滅活疫苗，流感減毒活疫苗有眾多優(yōu)點，包括避免肌肉注射造成的疼痛、接種人群范圍更廣、能激發(fā)較好的黏膜免疫及細(xì)胞免疫和免疫持續(xù)時間較長等[19]。

目前上市的流感減毒活疫苗主要是以雞胚生產(chǎn)的冷適應(yīng)性減毒活疫苗。冷適應(yīng)性減毒活疫苗具備冷適應(yīng)性、溫度敏感性和減毒性這3個特性。冷適應(yīng)特性是指病毒能夠在25 ℃和33 ℃進行高效的復(fù)制；溫度敏感性是指A型流感病毒在39 ℃時不能復(fù)制，B型流感病毒在37 ℃時不能復(fù)制；減毒性是指病毒對小鼠和雪貂的致病性顯著降低，無致死性[20]。這樣的冷適應(yīng)減毒活疫苗具備良好的安全性和有效性。研究發(fā)現(xiàn)，HA和NA是流感病毒基因組中最易發(fā)生變異的基因節(jié)段，而冷適應(yīng)減毒活疫苗母本株中與冷適應(yīng)及減毒特性相關(guān)的氨基酸突變位點位于除HA和NA以外的6個內(nèi)部基因上，因此冷適應(yīng)減毒活疫苗母本株的遺傳性狀比較穩(wěn)定[21]。

2003年和2012年，美國相繼批準(zhǔn)上市了以雞胚生產(chǎn)的三價流感減毒活疫苗和四價流感減毒活疫苗。冷適應(yīng)減毒活疫苗的制備流程為分別以A型流感病毒A/Ann Arbor/6/60 （H2N2）和B型流感病毒B/Ann Arbor/1/66作為冷適應(yīng)減毒活疫苗母本株，將其內(nèi)部PB1、PB2、PA、NP、M和NS 6個基因與WHO推薦的流行株的HA和NA基因進行重配，進而獲得流感冷適應(yīng)減毒活疫苗。A/Ann Arbor/6/60 （H2N2）和B/Ann Arbor/1/66是由Maassab等[22]研制而成。Maassab等將這2株病毒在雞胚上低溫連續(xù)傳代，使其具備冷適應(yīng)性、溫度敏感性和減毒性這3個特性，而以其為基因骨架制備而成的流感冷適應(yīng)減毒活疫苗也具備相同的3個特性。這種冷適應(yīng)性減毒疫苗可以通過滴鼻免疫，避免肌肉注射時所產(chǎn)生的疼痛，且能產(chǎn)生持久的體液免疫，以及良好的黏膜免疫和細(xì)胞免疫。除了美國外，俄羅斯以A/Leningrad/134/17/57 （H2N2）為基因骨架制備而成的流感冷適應(yīng)減毒活疫苗也已成功應(yīng)用達數(shù)十年之久[22]。

值得注意的是，目前傳統(tǒng)的冷適應(yīng)性流感減毒活疫苗大都以雞胚為基質(zhì)進行生產(chǎn)，存在一定的缺點。首先，病毒在雞胚上進行連續(xù)傳代，在其適應(yīng)的過程中，HA往往容易發(fā)生突變，從而不能與流行株匹配完好，因此不能保證更好的免疫效果；其次，生產(chǎn)過程中存在外源因子污染的可能，收獲的雞胚尿囊液需要不斷純化去除外源因子及雜蛋白等；第三，生產(chǎn)周期長，生產(chǎn)過程繁瑣，雞胚來源受到限制，生產(chǎn)規(guī)模小，疫苗產(chǎn)量不足以應(yīng)對流感大流行。因此，以傳代細(xì)胞系為基質(zhì)生產(chǎn)減毒活疫苗成為發(fā)展趨勢。國內(nèi)外用來生產(chǎn)流感疫苗的連續(xù)傳代細(xì)胞系主要有犬腎細(xì)胞（MDCK細(xì)胞）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）和人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（PER.C6）等[23-24]。目前美國MedImmune等公司以上述細(xì)胞為基質(zhì)生產(chǎn)的流感疫苗已經(jīng)上市，而且生產(chǎn)規(guī)模最大可達6000 L。此外有研究表明，采用非洲綠猴腎細(xì)胞生產(chǎn)的冷適應(yīng)流感減毒活疫苗遺傳性狀穩(wěn)定，有利于通過重配來生產(chǎn)減毒活疫苗。

流感減毒活疫苗的臨床不良反應(yīng)主要包括骨骼肌痛、滲出性中耳炎等，此外，在15～35個月的幼兒中應(yīng)用冷適應(yīng)減毒疫苗有增加哮喘的傾向，因此不建議3歲以下兒童使用。

2 新型季節(jié)性流感疫苗研究進展

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)流感疫苗 與目前的流感疫苗生產(chǎn)方法相比，細(xì)胞培養(yǎng)流感疫苗的方法克服了現(xiàn)有生產(chǎn)工藝的許多不足，顯著增加了疫苗產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本和時間。過去60多年來，用于生產(chǎn)流感疫苗的病毒一直是在SPF雞胚中培養(yǎng)的。然而一方面，并不是每枚雞胚都可以用來生產(chǎn)疫苗，只有經(jīng)過認(rèn)證的養(yǎng)雞廠才可以提供SPF雞胚；另一方面，每枚SPF雞胚一次只能注射一種病毒，但是典型的流感疫苗包含3種或4種病毒組分（即三價或四價流感疫苗），導(dǎo)致現(xiàn)有流感疫苗生產(chǎn)效率不高。現(xiàn)有方法需要大量合格的SPF雞胚。以美國為例，為全美人口生產(chǎn)足夠的流感疫苗需要多達數(shù)億枚的SPF雞胚。而細(xì)胞培養(yǎng)法則克服了上述缺點。此外，細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)流感疫苗還有助于人類靈活應(yīng)對流感大流行，用SPF雞胚培養(yǎng)流感病毒，須提前對生產(chǎn)疫苗的數(shù)量做出精確規(guī)劃，而在流感大流行期間，很難在短時間內(nèi)購置生產(chǎn)疫苗所需的大量的SPF雞胚，而細(xì)胞培養(yǎng)法則可以在短時間內(nèi)制造出大批量流感疫苗來應(yīng)對流感大流行疫情。此外，細(xì)胞生產(chǎn)的流感疫苗和雞胚生產(chǎn)的流感疫苗在安全性和免疫原性方面沒有顯著差別。Reisinger等[25]評估了細(xì)胞生產(chǎn)的三價流感疫苗與雞胚生產(chǎn)的三價流感疫苗在安全性和免疫原性方面的差別，他們在超過600名＜50歲的成人志愿者中開展臨床試驗，按照1∶1比例接種了細(xì)胞生產(chǎn)三價流感疫苗或雞胚生產(chǎn)三價流感疫苗，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)兩種疫苗在安全性和免疫原性方面存在顯著差異。此外，通過非洲綠猴腎細(xì)胞細(xì)胞生產(chǎn)的冷適應(yīng)減毒活疫苗在成人滴鼻免疫試驗中也被證明具有良好的安全性和免疫原性[26]。

2.2 病毒樣顆粒疫苗 目前上市的季節(jié)性流感疫苗主要包括裂解疫苗、亞單位疫苗和減毒活疫苗，這些疫苗都需要在雞胚或哺乳動物細(xì)胞中增殖后才能產(chǎn)生足夠的抗原，導(dǎo)致這些疫苗的生產(chǎn)過程需要消耗大量的時間和金錢，而流感VLPs疫苗可以有效解決傳統(tǒng)疫苗的上述缺點[27]。

VLPs是由病毒結(jié)構(gòu)蛋白組裝且不含病毒遺傳物質(zhì)的空殼結(jié)構(gòu)。由于VLPs不含病毒核酸，因此具有較高的安全性。此外，VLPs可以刺激機體產(chǎn)生較強的體液免疫和細(xì)胞免疫，免疫原性強。目前通常選擇昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)來生產(chǎn)流感VLPs，所產(chǎn)生的VLPs與天然流感病毒形態(tài)相似。研究表明，H1N1亞型VLPs疫苗可展示與母本病毒HA和NA蛋白空間構(gòu)象一致的抗原表位，進而誘導(dǎo)針對HA和NA的特異性抗體產(chǎn)生，目前已在臨床試驗中證明有效[28]。通過動物實驗，Ross等[29]證明一種包括H1N1亞型流感病毒、H3N2亞型流感病毒和一種B型流感病毒的三價VLPs能夠為機體提供針對不同季節(jié)性流感病毒的保護。通過皮膚貼片微針注射技術(shù)和動物實驗，Quan等[30]證明含有海藻糖的H1N1亞型VLPs能夠給機體提供長時間、高抗體滴度的免疫保護，小鼠在免疫1年后仍可抵抗H1N1亞型流感病毒的致死性攻擊。Wang等[31]研究表明，通過滴鼻免疫的途徑，嵌合鞭毛蛋白的H1N1亞型VLPs能夠引起顯著的黏膜免疫反應(yīng)。目前Novavax公司的三價和四價季節(jié)性流感VLPs疫苗已進入人體臨床試驗階段，但尚無季節(jié)性流感VLPs疫苗上市。

2.3 其他季節(jié)性流感疫苗 除了細(xì)胞培養(yǎng)疫苗和病毒樣顆粒疫苗外，還有一些季節(jié)性流感疫苗也在研發(fā)中，包括復(fù)制缺陷型疫苗、添加 MF59佐劑的流感疫苗等。Wacheck等[32]發(fā)現(xiàn)NS1復(fù)制缺陷型H1N1季節(jié)性流感疫苗通過鼻內(nèi)接種的方式接種志愿者后，志愿者體內(nèi)可產(chǎn)生有效的流感中和抗體，且未發(fā)現(xiàn)除鼻腔炎癥狀或頭痛等常見疫苗不良反應(yīng)以外的其他不尋常的不良反應(yīng)。Vesikari等[33]發(fā)現(xiàn)添加佐劑MF59的季節(jié)性流感疫苗可增強機體接種疫苗后的免疫應(yīng)答水平。

3 結(jié) 語

自1918年西班牙流感大流行以來，每次流感大流行后都會出現(xiàn)新的季節(jié)性流感病毒株來取代或與之前季節(jié)性流感病毒株共同流行，當(dāng)前季節(jié)性流感病毒由2種A型流感病毒（H1N1亞型流感病毒和H3N2亞型流感病毒）和B型流感病毒（Yamagata系和Victoria系）組成。季節(jié)性流感已成為影響全球的重要疾病負(fù)擔(dān)，對公共衛(wèi)生安全和經(jīng)濟社會的健康發(fā)展構(gòu)成重要威脅。流感疫苗是應(yīng)對季節(jié)性流感疫情的有效手段，雖然偶爾也會出現(xiàn)由于WHO推薦的疫苗株與各國當(dāng)季實際流行的病毒株不匹配而引發(fā)的季節(jié)性流感疫情程度顯著加重的事件，但總體上流感疫苗在應(yīng)對季節(jié)性流感疫情和保護人類健康方面做出了不可磨滅的貢獻。

在合理利用現(xiàn)有的三價和四價流感滅活疫苗以及流感減毒活疫苗的基礎(chǔ)上，各國也在積極研發(fā)安全、高效和低成本的新型流感疫苗，包括細(xì)胞培養(yǎng)流感疫苗、VLPs疫苗等，未來各種新型流感疫苗的上市將會是對現(xiàn)有流感疫苗品種的有力補充，它們將與現(xiàn)有流感疫苗一道共同在人類防控季節(jié)性流感疫情的過程中發(fā)揮重要作用。