用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)4種刺激劑類禁用物質(zhì)

丁晶琳 董穎 張麗娟 趙君 馬艷華 閆寬

1國(guó)家體育總局反興奮劑中心（北京 100029）

2北京化工大學(xué)理學(xué)院（北京 100029）

用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)4種刺激劑類禁用物質(zhì)

丁晶琳2董穎1張麗娟2趙君2馬艷華1閆寬1

1國(guó)家體育總局反興奮劑中心（北京 100029）

2北京化工大學(xué)理學(xué)院（北京 100029）

目的：使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，為世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（WADA）在檢測(cè)窗口中擬增加的4種刺激劑甲磺美嗪（amezinium methylsulfate，I）、嗎拉宗（morazone，II）、貝美格（3-ethyl-3-methylglu?tarimide，III）和阿拉明（metaraminol，IV）建立了常規(guī)檢測(cè)方法，并對(duì)方法進(jìn)行考察和驗(yàn)證。方法：用5%的醋酸鉛水溶液將樣品中蛋白質(zhì)等大分子沉淀后，離心10分鐘，取上清液上機(jī)檢測(cè)。質(zhì)譜采用電噴霧電離源（ESI），在正離子模式下，通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式對(duì)樣品進(jìn)行分析。結(jié)果：經(jīng)過(guò)定性和定量分析，得到上述四種刺激劑的檢測(cè)限（LOD）分別為0.1、0.5、5和0.5 ng/mL；定量限（LOQ）分別為0.3，1.5，15和1.5 ng/ mL；線性范圍（r2＞0.99）分別在0.3～5000、1.5～3000、15～3000和1.5～4500 ng/mL之間。每種刺激劑在低、中和高3個(gè)濃度范圍的基質(zhì)效應(yīng)均在98%～120%之間；準(zhǔn)確度誤差在9%以內(nèi)；日內(nèi)精密度的標(biāo)準(zhǔn)偏差低于7.7%，日間精密度的標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過(guò)10%。結(jié)論：本研究建立的檢測(cè)方法具有樣品前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確度好和基質(zhì)干擾較小等特點(diǎn)，滿足興奮劑檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的要求，并已經(jīng)應(yīng)用于常規(guī)檢測(cè)中。

液相色譜--串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用；刺激劑；方法驗(yàn)證；興奮劑控制

刺激劑包含能夠增加刺激性、暫時(shí)緩解疲勞以及可能增強(qiáng)競(jìng)技性、攻擊性等生理作用的各類物質(zhì)，如以苯丙胺為代表的中樞神經(jīng)刺激劑，以麻黃堿為代表的末梢交感神經(jīng)刺激劑等。刺激劑是競(jìng)技體育中濫用歷史最長(zhǎng)的興奮劑。刺激劑作用于中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)，可使運(yùn)動(dòng)員的行為和能力得到較快調(diào)整。刺激劑還可以提高肌肉的工作效率，減緩或加速消除疲勞，使運(yùn)動(dòng)員能夠進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間和大強(qiáng)度的訓(xùn)練。但使用刺激劑類藥物的副作用也是顯而易見(jiàn)的，此類藥物會(huì)降低使用者的身體感知能力，削弱部分人體的自我保護(hù)功能。服用后，人體亢奮狀態(tài)持續(xù)一段時(shí)間后會(huì)進(jìn)入極度疲勞狀態(tài)。服用大劑量的刺激劑更會(huì)影響心肺功能，使人體器官超負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)，造成器官損傷，嚴(yán)重者會(huì)引起血壓急劇上升和心律不齊等，更有甚者會(huì)導(dǎo)致死亡。

氣相色譜-氮磷檢測(cè)（GC-NPD）技術(shù)是刺激劑傳統(tǒng)的檢測(cè)方法[1-4]，但該方法具有檢測(cè)重現(xiàn)性較差和靈敏度低等缺點(diǎn)。也可將刺激劑衍生化后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）進(jìn)行檢測(cè)[5]，但該方法的前處理繁瑣，所用衍生化試劑毒性大，干擾因素多且方法穩(wěn)定性差。為簡(jiǎn)化樣品前處理步驟，實(shí)現(xiàn)高通量、快速的檢測(cè)目標(biāo)，文獻(xiàn)報(bào)道[6，7]將刺激劑在強(qiáng)堿性條件下用液液萃取的方法進(jìn)行提純后，用GC-MS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。為提高檢測(cè)靈敏度，近年來(lái)通常采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）檢測(cè)刺激劑[8-11]和其他禁用物質(zhì)[12-17]。

圖1 本研究4種刺激劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（WADA）曾經(jīng)于2015年初向各個(gè)WADA認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室發(fā)了一份列表，詢問(wèn)是否為列表上的刺激劑類禁用物質(zhì)建立了檢測(cè)方法。本研究包含的4種刺激劑甲磺美嗪、嗎拉宗、貝美格和阿拉明（圖1）也包含在此列表中。通過(guò)查閱文獻(xiàn)得知[18]，甲磺美嗪主要通過(guò)尿液排出體外，尿液中大概含56%-89%原形藥物。Shintani[19]和Kokot[20]報(bào)道用液相色譜法測(cè)定甲磺美嗪在血漿中的濃度，檢測(cè)限為2 ng/mL。Lho 等[21]發(fā)表過(guò)一篇文章，介紹了使用氣相色譜方法檢測(cè)兔尿和血漿中嗎拉宗含量的方法。1991年，Soto-Otero 等[22]曾在文章中介紹過(guò)使用液相色譜法測(cè)定兔子血清和腦組織中貝美格的濃度。還有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于阿拉明的液相色譜檢測(cè)方法的研究[23，24]，而在2000年Hill等報(bào)道了使用ACPI源的HPLC-MS/MS方法檢測(cè)馬尿中該藥物的含量[25]。

到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)表有關(guān)上述4種刺激劑分別或同時(shí)用HPLC-ESI-MS/MS技術(shù)的檢測(cè)方法。因此，為上述4種刺激劑建立靈敏度高、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法勢(shì)在必行。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

1290/6470 Triple Quad LC-MS/MS來(lái)自美國(guó)安捷倫公司（Agilent Technology）；氮吹儀購(gòu)自英國(guó)比比科技有限公司（Bibby Scientific Ltd）；低速離心機(jī)購(gòu)自北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；感量0.0001 g電子天平來(lái)自瑞士梅特勒-托利多公司（Mettler Toledo）；超純水系統(tǒng)（Milli-Q Advantage A10）由美國(guó)密理博公司生產(chǎn)（Millipore）；GENIE VORTEX-2渦旋混合器由美國(guó)科技工業(yè)公司制造（Scientific Industries）。

1.2 主要材料與試劑

甲磺美嗪和貝美格來(lái)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；嗎拉宗從加拿大全資公司（Toronto Research Chemi?cals INC）購(gòu)得；阿拉明、內(nèi)標(biāo)倍可降（mefruside）和色譜純甲醇購(gòu)自西格瑪奧德里奇科技有限公司；色譜純甲酸、甲酸銨和乙腈來(lái)自美國(guó)迪馬公司；醋酸鉛（分析純）來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)控樣品溶液的制備

儲(chǔ)備溶液：稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解制備成濃度為1 mg/mL的溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液：將儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至10 μg/mL。刺激劑質(zhì)控樣品溶液：在空白尿中用標(biāo)準(zhǔn)溶液倍比稀釋制備低、中和高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品溶液。

1.4 樣品前處理

采用本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)刺激劑的方式對(duì)尿樣進(jìn)行前處理：用1 mL可調(diào)式移液槍準(zhǔn)確移取1 mL尿樣于10 mL螺口試管中，再加入1 mL濃度為5%的醋酸鉛水溶液（其中含有濃度為200 ng/mL的內(nèi)標(biāo)），渦旋混勻，以4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘，倒出上清液，取10 μL進(jìn)樣分析。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；采用pH 3.5的甲酸銨緩沖液（A）和乙腈（B）流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.4 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積10 μL。梯度洗脫程序如下：

（1）0.00 min：90%solvent A

（2）5.00 min：90%solvent A

（3）10.00 min：50%solvent A

（4）15.00 min：10%solvent A

（5）16.00 min：10%solvent A

（6）色譜柱平衡時(shí)間：4 min

1.5.2 質(zhì)譜條件

用電噴霧離子源（ESI），采用正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式采集數(shù)據(jù)。霧化氣：20 psi；毛細(xì)管電壓：3000 V，離子源溫度：330℃；干燥氣流速：10 L/ min。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的前處理

由于興奮劑檢測(cè)大多收集運(yùn)動(dòng)員尿樣，含有的內(nèi)源性干擾物質(zhì)較多，所以通常需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，以達(dá)到純化和濃縮樣品的目的。樣品前處理方案通常需要根據(jù)選定的檢測(cè)方法和藥物的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和代謝方式確定。由于大部分刺激劑的代謝方式為原形代謝，所以比較常用的前處理方式為直接進(jìn)樣法。該方法操作簡(jiǎn)單、快捷，能最大程度地保留尿樣中的藥物，是較為理想的前處理手段。

2.2 HPLC-MS/MS檢測(cè)方法的建立

本研究用濃度為1 ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)全掃描發(fā)現(xiàn)，4種刺激劑在正離子模式下的靈敏度明顯優(yōu)于負(fù)離子。再依次對(duì)質(zhì)譜的加速電壓和碰撞電壓等進(jìn)行優(yōu)化，相關(guān)數(shù)據(jù)參見(jiàn)表1。

表1 4種刺激劑的色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

2.3 方法驗(yàn)證

根據(jù)WADA實(shí)驗(yàn)室國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)技術(shù)文件的要求，我們測(cè)定了4種刺激劑的檢測(cè)限、定量限和線性范圍，并驗(yàn)證了方法的日間和日內(nèi)精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)干擾效應(yīng)和方法的特異性等指標(biāo)。

2.3.1 檢測(cè)限（LOD） 和定量限（LOQ）

檢測(cè)限是指對(duì)某一特定的分析方法在給定的可靠程度內(nèi)可以從樣品中檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)的最小濃度，通常指信噪比S/N≥3時(shí)被測(cè)藥物的濃度。定量限是指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度，一般定義為信噪比S/N≥10時(shí)被測(cè)藥物的濃度。檢測(cè)限與定量限的測(cè)定需要先用一份尿樣初略估計(jì)，然后在10份不同的空白尿中添加接近或高于估算濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定（表2）。與WADA技術(shù)文件[26]中規(guī)定的刺激劑檢測(cè)能力最低要求（100 ng/mL）相比，本方法的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出對(duì)興奮劑樣品的檢測(cè)要求。

2.3.2 線性范圍

線性范圍指某一方法的校準(zhǔn)曲線的直線部分所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物質(zhì)濃度變化范圍。自LOQ開(kāi)始向上配制系列濃度的樣品，根據(jù)上述1.4的描述處理并上機(jī)檢測(cè)，測(cè)量直至曲線出現(xiàn)彎曲時(shí)的濃度，此時(shí)相關(guān)系數(shù)r2大于0.99。通過(guò)測(cè)定得知（表3），這4種刺激劑都具有很寬的定量線性范圍。

表2 4種刺激劑的方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)

表3 4種刺激劑的線性范圍

2.3.3 精密度和準(zhǔn)確度

精密度指一組測(cè)定的數(shù)據(jù)之間的接近程度，數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定越接近，顯示其精密度越高。準(zhǔn)確度是指檢測(cè)值與真值之間的偏離程度。本實(shí)驗(yàn)的精密度和準(zhǔn)確度測(cè)定是在低、中和高3個(gè)濃度級(jí)別進(jìn)行的。在10份空白尿中，分別添加上述3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依據(jù)1.4的描述進(jìn)行前處理并上機(jī)檢測(cè)，得出日內(nèi)精密度。按照日內(nèi)精密度的操作方法，每天操作1次，共做至少3次，計(jì)算得出日間精密度。通過(guò)工作曲線計(jì)算測(cè)量值，與真實(shí)值進(jìn)行比較再乘以百分比，即為準(zhǔn)確度（見(jiàn)表2）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4種刺激劑在3個(gè)濃度水平下日內(nèi)變異系數(shù)均小于7.7%，日間變異系數(shù)均小于10%，檢測(cè)的準(zhǔn)確度偏差均低于8.2%，符合興奮劑檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)的要求。

2.3.4 基質(zhì)效應(yīng)

尿樣中的基質(zhì)常常對(duì)待測(cè)物的分析過(guò)程有顯著干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，稱之為基質(zhì)效應(yīng)。在10份不同的空白尿中分別添加低、中和高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)研究。將空白尿按照上述1.4的描述進(jìn)行前處理后，在上清液中添加一定濃度的刺激劑和內(nèi)標(biāo)，上機(jī)檢測(cè)得到峰面積B。同時(shí)，將同體積的純水經(jīng)過(guò)前處理后，在上清液中添加相同濃度的刺激劑和內(nèi)標(biāo)，上機(jī)檢測(cè)得到峰面積A?；|(zhì)效應(yīng)的計(jì)算方式如下：

基質(zhì)效應(yīng) =刺激劑峰面積B/內(nèi)標(biāo)峰面積B÷刺激劑峰面積A/內(nèi)標(biāo)峰面積A×100%

表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4種刺激劑在低、中和高3個(gè)濃度下的基質(zhì)效應(yīng)均在可接受范圍內(nèi)（98%～120%）。

2.3.5 特異性

特異性是指在樣品介質(zhì)中有其它組分共存時(shí)，檢測(cè)方法對(duì)待測(cè)物準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力。當(dāng)樣品中含有被分析物時(shí)呈陽(yáng)性反應(yīng)，不含被分析物時(shí)呈陰性反應(yīng)。本研究選擇了50份空白尿樣，經(jīng)前處理并上機(jī)檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)尿樣中基質(zhì)對(duì)待測(cè)離子窗口無(wú)影響。

3 總結(jié)

本研究為WADA擬在檢測(cè)窗口中增加的4種刺激劑類禁用物質(zhì)建立了HPLC-ESI-MS/MS檢測(cè)方法，并對(duì)方法進(jìn)行了全面考察和驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法不僅具有靈敏度高和線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，還具有很好的精密度和準(zhǔn)確度，抗基質(zhì)干擾能力和特異性強(qiáng)也為該方法的實(shí)際應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。目前這4種刺激劑已經(jīng)添加到我們實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)窗口中。

[1]Lho DS，Shin HS，Kang BK，et al.Systematic analysis of stimulants and narcotic analgesics by gas chromatography with nitrogen specific detection and mass spectrometry.J Anal Toxicol，1990，14（2）：73-76.

[2]Merwe PJ，Kruger HSL，Pleterse JW，et al.Report on the doping controlduring the 7th AllAfrica Games in South Africa;Recent advances in doping analysis.Sport and Buch Straub，Koln，2000，8：245-252.

[3]Hemmersbach P，Torre R，Stimulants，narcotics and betablockers：25 yearsofdevelopmentin analyticaltech?niques for doping control.J Chromatogr B，1996，687（1）：221-238.

[4]Qiu L，Zheng X，You F，et al.Simultaneous determination of stimulant，narcotics and antiestrogen in urine by gas chromatography-nitrogen phosphorous detection.Se Pu，2009，27（3）：364-367.

[5]Van Thuyne W，Van Eenoo P，Delbeke FT.Comprehen?sive screening method for the qualitative detection of nar?cotics and stimulants using single step derivatisation.J Chromatogr B，2007，857（2）：259-265.

[6]Van Thuyne W，Van Eenoo P，Delbeke FT.Implementa?tion of gas chromatography combined with simultaneously selected ion monitoring and full scan mass spectrometry in doping analysis.J Chromatogr A，2008，210（2）：193-202.

[7]Strano Rossi S，de la Torre X，Botrè F.A fast gas chro?matography/mass spectrometry method for the determina?tion of stimulants and narcotics in urine.Rapid Commun Mass Spectrom，2010，24（10）：1475-1480.

[8]Hsu KF，Chien KY，Chang-Chien GP，et al.Liquid chro?matography-tandem mass spectrometry screening method for the simultaneous detection of stimulants and diuretics in urine.J Anal Toxicol，2011，359（9）：665-674.

[9]Guddat S，Solymos E，Orlovius A，et al.High-throughput screening for various classes of doping agents using a new 'dilute-and-shoot'liquid chromatography-tandem mass spectrometry multi-target approach.Drug Test Anal，2011，3（11-12）：836-850.

[10]Mazzarino M，F(xiàn)iacco I，de la Torre X，et al.Screening and confirmation analysis of stimulants，narcotics and be?ta-adrenergic agents in human urine by hydrophilic inter?action liquid chromatography coupled to mass spectrome?try.J Chromatogr A，2011，1218（45）：8156-8167.

[11]Girón AJ，Deventer K，Roels K，et al.Development and validation of an open screening method for diuretics，stim?ulants and selected compounds in human urine by UH?PLC-HRMS for doping control.Anal Chim Acta，2012，721：137-146.

[12]陸江海，秦旸，楊樹(shù)民，等.采用LC-MS/MS檢測(cè)人尿中睪內(nèi)脂方法研究.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2010，29（3）：338-339.

[13]楊志勇，何根業(yè)，陸江海，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定性檢測(cè)人尿中八種違禁藥物.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2014，33 （7）：721-724.

[14]閆寬，馬艷華，董穎，等.用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)人尿中三種普坦類興奮劑控制藥物.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2015，34（10）：989-993.

[15]申利，吳筠，楊志勇，等.興奮劑檢測(cè)中嗎啡和可待因的LC-MS/MS定量方法研究.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2015，34 （11）：1089-1093.

[16]馬艷華，閆寬，董穎，等.用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)研究禁用物質(zhì)氫氯噻嗪在人尿中的代謝情況.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2016，35（1）：67-70.

[17]洪宇，徐友宣.阿卡地新（AICAR）的LC-MS/MS檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2016，35（3）：274-278.

[18]Starke K.Amezinium：A novel pattern of effects on the sympathetic nervous system.Trends Pharmacol Sci，1983，4（6）：269-272.

[19]Shintani H，Hayashi F.HPLC validation of ameziniumme?tisulfate in human plasma from uremia patient treated by dialysis.Chromatographia，2001，53：574-578.

[20]Kokot Z，Prawdzik I.Determination of amezinium in plas?ma by RP HPLC and its application to bioequicalence studies.Acta Pol Pharm，2001，58（5）：315-318.

[21]Lho D，Shin H，Park J.Simultaneous determination of morazone and phenmetrazine in rat plasma an urine us?ing an on-column injection technique with fused-silica capillary column gaschromatography.JAnalToxicol，1990，14（2）：113-115.

[22]Soto-Otero V，Aguilar-Veiga E，Sierra-Marcuno G.Re?versed-phase high-performance liquid chromatography method for the determination of bemegride in serum and brain tissue：pharmacokinetics and brain distribution of an intraperitoneal subconvulsive dose in rats.J Pharm Biomed Anal，1991，9（2）：77-182.

[23]田潔，余倩，車寶泉，等.反相高效液相色譜法測(cè)定重酒石酸間羥胺及其注射液的有關(guān)物質(zhì)和含量.中國(guó)藥學(xué)雜志，2010，45（17）：1316-1319.

[24]Martin CJ，Saxena SJ.High-performance liquid chromato?graphic determination ofmetaraminolbitartrate in the presence of parabens.J Pharm Sci，1980，69（12）：1459-1461.

[25]Hill DW，Hyde WG，Kind AJ，et al.Development of ana?lytical methods for the detection of metaraminol in the horse.J Anal Toxicol，2000，24（4）：281-288.

[26]World Anti-Doping Agency：WADA Technical Document. http：//www.wada-ama.org.

The Developed LC-MS/MS Method for the Detection of Four Prohibited Stimulants

Ding Jinglin2，Dong Ying1，Zhang Lijuan2，Zhao Jun2，Ma Yanhua1，Yan Kuan1
1 National Anti-Doping Laboratory，China Anti-Doping Agency，Beijing 100029，China
2 Faculty of Science，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China

Dong Ying，Email：dongying@chinada.cn Zhang Lijuan，Email：dazlj@mail.buct.edu.cn

ObjectiveTo develop and validate a liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LCMS/MS）method for the detection of 4 stimulants including amezinium methylsulfate（I），morazone（II），3-ethyl-3-methylglutarimide（III）and metaraminol（IV）to be added to the detection window by World Antidoping Agency.MethodAn equal volume of 5%lead acetate aqueous solution was employed to pre?cipitate the proteins in urine samples.After centrifugation for 10 min，the supernatant was introduced directly into the LC-MS/MS system using positive electrospray ionization with multiple reaction monitor?ing（MRM）mode.ResultsThe limit of detections（LODs）for stimulants I-IV were 0.1，0.5，5 and 0.5 ng/ mL respectively，while the limit of quantifications（LOQs）were 0.3，1.5，15 and 1.5 ng/mL accordingly. The assays were linear（r2＞0.99）over the concentration ranges of 0.3-5000，1.5-3000，15-3000 and 1.5-4500 ng/mL in human urine respectively.The established method also achieved satisfactory results in terms of intra-and inter-day precisions（CV＜10%），accuracies（bias＜9%），matrix effect（98-120%）and specificity at low，medium and high concentration levels.ConclusionsThe developed method is precise，sensitive and accurate with minimum sample preparation.It is a fit-for-purpose approach and has been applied in the National Anti-Doping Laboratory for doping-control sample analysis.

LC-MS/MS，stimulants，method validation，doping control

2016.4.19

董穎，Email：dongying@chinada.cn；張麗娟，Email：dazlj@mail.buct.edu.cn