人參果莖尖脫毒與組培快繁技術(shù)研究

張麗芳　李榮瓊　包濤　李國昌　施林　蔣瑜　楊春利

人參果（Solanum muricatumAiton）原名為香瓜茄，又名香艷梨、艷果，屬茄科蔬菜、水果兼觀賞型草本植物。其成熟的果實呈奶油色或米黃色帶紫色條紋，呈橢圓形、卵圓形、心形或陀螺形。果肉為淡黃色，清香多汁，腹內(nèi)無核，風(fēng)味獨(dú)特，可食率達(dá)95%以上，具有高蛋白、低脂肪、低糖等特點(diǎn)，富含鈣、維生素C、鉬、鈷、硒等幾十種人體所需的微量元素，尤其是硒、鈣的含量大大高于其他的水果和蔬菜[1]，具有抗癌、抗衰老、降血壓、降血糖、消炎、補(bǔ)鈣、美容等功效，是一種較受歡迎的鮮食水果，也可作為蔬菜食用，人參果亦具有極高的觀賞價值，可作盆景在庭院、陽臺或房前屋后栽培。

人參果曾被醫(yī)學(xué)界稱為“生命之火”、“抗癌之王”[2，3]。近些年來，由于農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和發(fā)展高原特色農(nóng)業(yè)的要求，人參果作為高原特色水果在云南各地發(fā)展迅速，種植面積不斷擴(kuò)大。人參果常規(guī)繁殖是采用種子和扦插2種方法，但7～9月高溫期結(jié)的果中沒有種子，適溫期結(jié)的果中有少量的種子，但種子的發(fā)芽率較低，因此，在人參果種植區(qū)域，多采用扦插育苗，農(nóng)戶連年自留種自繁自用，這種無性繁殖容易導(dǎo)致病毒在種植過程中傳播和積累，加重了病毒病的發(fā)病幾率和為害程度，嚴(yán)重影響了人參果的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約了人參果的種植發(fā)展。通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行莖尖脫毒，可解決植物病毒引起的退化問題，恢復(fù)品種原有的優(yōu)良特性，用組培快繁技術(shù)進(jìn)行工廠化生產(chǎn)獲得大量脫毒組培苗，能滿足生產(chǎn)中對優(yōu)質(zhì)種苗的需要。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

從昆明市石林縣西街口鎮(zhèn)人參果種植地中選擇生長勢強(qiáng)、植物學(xué)特性明顯、無病蟲害的植株，剪取生長充實的新發(fā)枝條作為試驗材料。

1.2　試驗方法

①外植體的選擇與處理將從石林西街口鎮(zhèn)采來的人參果枝條進(jìn)行修剪，切取枝條頂端3～4 cm長的頂芽，用自來水沖洗30 min，在超凈工作臺上進(jìn)行消毒處理。先用剪刀將頂芽下的2～3臺較大葉片剪除，用70%酒精處理30 s，無菌水沖洗2次，然后放入已消毒的瓶中，再用0.1%的升汞浸泡10 min，浸泡時不間斷搖蕩瓶子，以確保外植體得到全面徹底的消毒，最后用無菌水反復(fù)沖洗5次。

②莖尖的剝?nèi)『蜔o菌接種在雙筒解剖鏡下由外向內(nèi)逐層剝?nèi)ビ兹~，直至半球體頂端分生組織充分暴露出來，迅速切取0.2～0.4 mm莖尖，快速接種于莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：a.MS+6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+GA30.1 mg/L；b.MS+6-BA 0.10 mg/L+NAA 0.01 mg/L+GA30.1 mg/L；c.MS+6-BA 0.20 mg/L+NAA 0.01 mg/L+GA30.1 mg/L。

③莖尖分生組織培養(yǎng)和病毒檢測莖尖分生組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4周后，明顯長大，然后轉(zhuǎn)入a培養(yǎng)基培養(yǎng)1～2個月，長成完整的小植株。將所獲得的小植株進(jìn)行病毒檢測，即抽提樣品負(fù)染色制片，JEM100CX-Ⅱ透射電子顯微鏡檢測。

④繼代增殖和生根將經(jīng)檢測后的不帶病毒的核心苗剪成帶1～2節(jié)的莖段，接種于繼代增殖培養(yǎng)基上。繼代增殖培養(yǎng)基為不加任何激素的MS培養(yǎng)基 和 MS+6-BA（0.05～0.2 mg/L）+NAA（0.01～0.05 mg/L）+GA30.1 mg/L，以上培養(yǎng)基均添加3%蔗糖（或食用白糖），用6.5 g/L瓊脂粉固化，pH值5.8，分裝于玻璃瓶中，每瓶注入40 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：光照 2 000～3 000 lx，12 h/d，溫度（25±2）℃。

⑤組培苗的馴化和移栽帶節(jié)莖段經(jīng)過25～30 d培養(yǎng)，長至6 cm左右，有6～7臺葉片的完整植株時，打開瓶口煉苗1～2 d，然后取出苗后洗凈其根部的培養(yǎng)基，移栽到裝有草炭土或過篩腐葉土的漂盤中，放置于漂池內(nèi)，移栽初期，漂池要套小拱棚。溫度保持15～25℃，相對濕度85%～90%，適當(dāng)遮蔭，后期逐漸通風(fēng)，增強(qiáng)光照。經(jīng)煉苗30～40 d，根系能夠攏住基質(zhì)坨，苗高15～20 cm時可移栽大田。

2　結(jié)果與分析

2.1　核心苗的獲得

將莖尖生長點(diǎn)接種于a、b及c 3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)基a上，15 d后生長點(diǎn)明顯長大變綠，30 d左右可長成0.5 cm小芽，45～50 d可長成具有2～3個莖節(jié)的完整植株。培養(yǎng)基b上的生長點(diǎn)培養(yǎng)30 d左右，愈傷組織膨大，繼續(xù)培養(yǎng)至60 d左右，從愈傷組織上形成小芽點(diǎn)，之后再緩慢長成完整植株。培養(yǎng)基c上的生長點(diǎn)比b上的愈傷組織更嚴(yán)重，成苗更慢。所以適宜的人參果莖尖生長點(diǎn)誘導(dǎo)成苗培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+GA30.1 mg/L。外植體通過消毒后剝?nèi)∏o尖生長點(diǎn)，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)，成苗率28%。隨機(jī)抽取植株進(jìn)行病毒檢測，JEM100CX-Ⅱ透射電子顯微鏡5萬倍下平均每視野未觀察到病毒粒體，即被確認(rèn)為不帶病毒，可作為脫毒核心種苗。脫毒成功率較低，一般只有5%左右。

2.2　繼代培養(yǎng)與快速繁殖

將經(jīng)檢測后的不帶病毒的核心苗剪成帶1～2節(jié)的莖段，接種于不加任何激素的MS培養(yǎng)基與添加不同濃度 6-BA（0.05～0.2 mg/L）、NAA（0.01～0.1 mg/L）和 GA30.1 mg/L的 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d，觀察苗的生長情況。結(jié)果表明，在不加任何激素的MS培養(yǎng)基，帶節(jié)莖段接入7 d左右每段有1～2條新根長出，頂芽段已明顯長高，中間莖段的腋芽已經(jīng)萌出，由莖段變成完整的植株。隨著培養(yǎng)時間的延長，植株長高、根系增多。培養(yǎng)25 d后，每株高達(dá) 6～7 cm，有 7～8 片葉，根系 4～6 條，葉色濃綠，莖稈粗壯。在添加激素的培養(yǎng)基上，當(dāng)6-BA和GA3濃度一定，NAA為0.01 mg/L時，帶節(jié)莖段的生根要比不加任何激素的MS培養(yǎng)基早2 d，莖段接入5 d時已有根長出，每莖段長根2～3條。隨NAA濃度的提高，生根變慢，莖段基部長出愈傷組織。NAA濃度越高，生根越慢，愈傷越嚴(yán)重。當(dāng)NAA和GA3濃度一定，6-BA濃度為0.05 mg/L時，植株生長勢最強(qiáng)，隨6-BA濃度的提高，植株長到 3～4 cm時，出現(xiàn)分枝現(xiàn)象，即從植株基部往上第2～3個莖節(jié)處長出側(cè)芽，每株分出1～2個分枝，植株分枝后，主干幾乎停止長高，側(cè)芽繼續(xù)生長，但長勢細(xì)弱。所以適宜的人參果繼代快繁的培養(yǎng)基為：不加任何激素的MS培養(yǎng)基或MS+6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+GA30.1 mg/L。

人參果組培每個增殖周期一般為25～30 d，增殖倍數(shù)4～5倍。經(jīng)過幾個繼代周期后，數(shù)以萬計的脫毒優(yōu)質(zhì)人參果苗即可長成。

2.3　生根培養(yǎng)

人參果組培苗的生根較容易，帶節(jié)莖段在萌芽長高的同時長出根系，增殖和生根同步進(jìn)行，一次成苗，不需要單獨(dú)進(jìn)行生根階段。

2.4　組培苗的移栽

人參果組培苗移栽前首先在溫室中自然光條件下煉苗1～2 d，再從瓶中取出小苗，用自來水洗凈附在苗上的培養(yǎng)基，移栽于基質(zhì)為草炭土或過篩的腐葉土的漂盤中，移栽好的漂盤放置于漂池內(nèi)，移栽后一周內(nèi)蓋小拱棚保濕并加蓋遮陽網(wǎng)，30 d后觀察組培苗的生長情況和統(tǒng)計移栽成活率。草炭土和過篩的腐葉土2種不同的基質(zhì)上苗的成活率沒有明顯的區(qū)別，都超過94%，但是草炭土上苗的長勢明顯優(yōu)于腐葉土，草炭土上的苗平均株高比腐葉土上的多1.6 cm，苗的顏色濃綠，葉片大，根更發(fā)達(dá)。試管苗經(jīng)過40 d左右煉苗后，就可以移栽到大田了。

3　討論與結(jié)論

人參果的脫毒過程中，通過直接從植株上選取新發(fā)枝條作為剝?nèi)∏o尖生長點(diǎn)的外植體，這樣做不僅需要大量的外植體材料，而且脫毒率也較低，只有5%左右。用植株上剪取的枝條經(jīng)消毒處理后，切成帶節(jié)莖段直接接種于不加激素的MS培養(yǎng)基或MS+6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+GA30.1 mg/L上，培養(yǎng)成完整的植株（無菌苗）。把無菌苗剪成帶節(jié)莖段，在同一培養(yǎng)基上繼代2～3個周期，等無菌苗繁殖到一定數(shù)量后，再用這些無菌苗的頂芽來剝?nèi)∩L點(diǎn)并培養(yǎng)成完整的植株，隨機(jī)抽取生長點(diǎn)長成的植株進(jìn)行病毒檢測，不帶病毒的植株即可作為核心種苗來快繁。這種先經(jīng)過無菌苗培養(yǎng)后再用無菌苗脫毒的方法，剝?nèi)∩L點(diǎn)較容易，成苗率高，脫毒率也高。

人參果組培苗繼代快繁過程中對激素的需求不明顯，植株在無激素的MS培養(yǎng)基中就能長得很好。6-BA和NAA的濃度直接影響莖段長成完整植株的速度和質(zhì)量。在6-BA濃度一定的情況下，NAA濃度超過0.01 mg/L時，隨著濃度增加，莖基部接觸培養(yǎng)基部分出現(xiàn)白色疏松愈傷組織越多，植株長勢變慢。當(dāng)NAA濃度為0.01 mg/L時，6-BA濃度超過0.05 mg/L，隨著6-BA濃度增加，植株分杈增多，主莖生長變慢，甚至頂芽干枯壞死，枝干和葉片變脆。因此，適宜人參果繼代快繁的培養(yǎng)基為不加任何激素的MS培養(yǎng)基或低濃度的6-BA和NAA配比。

[1]李榮瓊，李國昌.云南高原特色人參果無公害生產(chǎn)技術(shù)[M].昆明：云南科技出版社，2014：1-3.

[2]陳健，管其寬.人參果栽培與利用[M].北京：金盾出版社，2002：3.

[3]符偉玉，張建和.香瓜茄微量元素含量的分析[J].廣州微量元素科學(xué)，2004，11（8）：51-53.