乳品真菌污染及快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展

楊同香 常小靜 吳孔陽 費 鵬 陳俊亮 唐浩國 劉麗莉 康懷彬

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2. 河南三劍客農(nóng)業(yè)股份有限公司,河南 漯河 462000；3. 洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471934)

在食品加工和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，易受到真菌及其所產(chǎn)毒素危害，控制食品和飼料中霉菌和酵母菌數(shù)量仍然是一項重中之重的工作[1-2]。因此，盡早發(fā)現(xiàn)并確定微生物種類、數(shù)量、所產(chǎn)危害物質(zhì),監(jiān)視以及抑制真菌生長等研究工作顯得尤為重要[3]。乳及乳制品在生產(chǎn)加工過程中，由于受到原料乳質(zhì)量、加工工藝、加工環(huán)境條件、生產(chǎn)人員技術(shù)水平等因素影響，會發(fā)生微生物污染事件，另外產(chǎn)品在冷藏、運輸、銷售等環(huán)節(jié)也容易被微生物污染。盡管通過一些預(yù)防和控制方法，比如生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)以及技術(shù)改進(jìn)等，微生物污染問題仍然是生產(chǎn)商們面臨的重要問題[4-5]。近年來，研究人員對乳及乳制品中常見食源性致病菌檢測技術(shù)開展了廣泛的研究，主要包括針對沙門氏菌[6]、蠟樣芽孢桿菌[7]、阪崎腸桿菌[8]、李斯特菌[9]和志賀氏菌[10]等病原菌，同時對其檢測技術(shù)進(jìn)行了很好的歸納和分析[11-12]。針對乳及乳制品中常見真菌檢測技術(shù)方面研究概述則相對較少，而真菌對乳及乳制品的污染問題依然不能忽視，對其快速檢測技術(shù)開發(fā)一直以來也是相關(guān)研究人員關(guān)注的問題。因此，文章從乳及乳制品中常見的真菌類型、真菌污染概況、真菌檢測技術(shù)及污染的質(zhì)量控制等方面進(jìn)行概述。

1 乳品中真菌污染概況

全球乳產(chǎn)量持續(xù)增長，2016年估計為4.988 2×108t，消費群體分布在不同年齡段[13]。然而乳制品易受多種因素影響而引起污染，比如金屬、農(nóng)藥和微生物等。在乳品終端銷售環(huán)節(jié)，因發(fā)現(xiàn)菌絲體污染引起的產(chǎn)品召回事件頻發(fā)[14]。從李雨哲等[15]對中國東北地區(qū)市售干酪中霉菌、酵母的情況調(diào)查中也可以發(fā)現(xiàn)，大約有20%的干酪存在霉菌或酵母超過現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)(GB 5420—2010)要求的現(xiàn)象。Shokri等[16]通過對伊朗亞茲德省7個農(nóng)場的70份駱駝奶樣進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)存在酵母、霉菌及黃曲霉毒素污染。其中鑒定的酵母主要包括假絲酵母屬(占比48.2%)、紅酵母屬(占比22.3%)、絲孢酵母屬(占比13.4%)，鑒定的霉菌主要是絲菌屬(占比16.1%)。另外對奶樣黃曲霉毒素檢驗分析，發(fā)現(xiàn)其中20份奶樣存在污染，黃曲霉毒素的平均含量達(dá)到45.95 ng/L，最低和最高含量分別為5.19，150.17 ng/L。

通過傳統(tǒng)平板分離培養(yǎng)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的研究，發(fā)現(xiàn)受污染的乳及其制品中多源于酵母菌和絲狀真菌存在而引起產(chǎn)品變質(zhì)[17-19]。Kalamaki等[20]通過分子鑒定研究發(fā)現(xiàn)開菲爾粒中酵母菌包括10個屬(Candidaspp.、Debaryomycesspp.、Galactomycesspp.、Issatchenkiaspp.、Kazachstaniaspp.、Kluyveromycesspp.、Pichiaspp.、Saccharomycesspp.、Wickerhamomycesspp.、Yarrowiaspp.)，酵母菌種類達(dá)14種。通過對各種動物乳、酸乳及奶酪中真菌的分離和鑒定，不難看出在乳品生產(chǎn)加工過程中，受酵母污染的乳品優(yōu)勢酵母種主要包括：Debaryomyceshansenii、Kluyveromycesmarxianus、Rhodotorulamucilaginosa、Saccharomycescerevisiae等。盡管有些乳制品中酵母數(shù)量適度增加，通常不會引起食品安全問題，但是普遍認(rèn)為其是引起食物腐敗的重要因素[21]。對于絲狀真菌污染情況的研究也發(fā)現(xiàn)眾多不同種屬真菌的存在。Lopandic等[22]通過隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA-PCR技術(shù)(RAPD-PCR)對奶酪、黃油、酸奶、酸奶油等進(jìn)行酵母菌的分離和鑒定研究，發(fā)現(xiàn)獲得的513個菌株中，460個屬于子囊菌酵母，53個屬于擔(dān)子菌酵母類。此外Buehler等[23]從原料奶、奶酪、酸奶等樣品中分離得到361株真菌，進(jìn)而對其ITS進(jìn)行DNA測序，并經(jīng)BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索和UNITE數(shù)據(jù)庫(https://unite.ut.ee/analysis.php)比對分析，可將這些真菌劃分為3門19屬，占比最多的3個屬分別是青霉屬(25%)、德巴利酵母屬(18%)和念珠菌屬(9%)。Banjara等[24-25]研究同樣發(fā)現(xiàn)，在奶酪中德巴利酵母屬真菌所占比例最高，青霉屬真菌也普遍存在。

實際上，原料乳及其制品在奶樣采集、生產(chǎn)加工、貯藏、運輸和銷售等環(huán)節(jié)均可能出現(xiàn)真菌污染問題，比如在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中，可能由于空氣、包裝材料、發(fā)酵劑、穩(wěn)定劑等污染而引入真菌孢子進(jìn)入酸奶中[14]。Kure等[26]為了找出引起挪威亞爾斯堡奶酪生產(chǎn)過程中霉菌污染的關(guān)鍵點，從不同的生產(chǎn)車間采集空氣、牛奶、鹽水、機(jī)器設(shè)備表面、塑料薄膜等樣品，通常引起奶酪污染的P.commune、P.palitans、P.solitum以及P.roquefortiss.Roqueforti等霉菌，可以在采集的空氣和機(jī)器設(shè)備表面樣品中發(fā)現(xiàn)。研究人員[26]認(rèn)為通過控制并提高車間空氣質(zhì)量，尤其是包裝車間，對于降低霉菌污染事件的發(fā)生非常重要。在埃及乳制品市場，奶酪占比最大，對于奶酪生產(chǎn)商來講，在奶酪貯藏期面臨最大的威脅是霉菌污染[27]。由于生產(chǎn)工藝差別，有些類型的酸奶更容易引起微生物污染，像希臘風(fēng)味酸奶，以其高蛋白(蛋白含量達(dá)9%～10%)、低脂等著稱，通常比其他酸奶生產(chǎn)更復(fù)雜，因此在生產(chǎn)中也增加了微生物污染的風(fēng)險[28]。當(dāng)然還有研究人員[29]發(fā)現(xiàn)在溫度較高的季節(jié)，加之缺乏有效的冷藏手段，乳品發(fā)生污染的可能性通常會更大些。

2 真菌的快速檢測技術(shù)

通常情況下，由酵母菌污染引起的酸奶產(chǎn)品變質(zhì)，主要可以通過產(chǎn)品外觀、滋味、氣味等進(jìn)行初步判斷，比如出現(xiàn)脹袋、酒香味，嚴(yán)重時在產(chǎn)品表面可看到酵母的菌落[30]。目前對于乳品中真菌的檢測，傳統(tǒng)檢測手段是利用平板培養(yǎng)分離和鑒定的方法，檢測時間通常為5～7 d，具有滯后性，一般很難滿足實際生產(chǎn)的需要，且已有眾多相關(guān)研究[31-33]，本文不再贅述，著重就微生物快速檢測技術(shù)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)進(jìn)行介紹。

2.1 流式細(xì)胞儀快速分析法

在水果制品行業(yè)，對于酵母和霉菌污染的評測是一項關(guān)鍵的指標(biāo)，由Chemunex開發(fā)的一款ChemFlow細(xì)胞儀計數(shù)系統(tǒng)可以快速對水果制品中的微生物污染情況進(jìn)行評測[34]。利用該系統(tǒng)可以在24～48 h內(nèi)實現(xiàn)對10 g水果制品中含有1個及以上酵母細(xì)胞的檢出水平，這也很適合用于水果風(fēng)味酸奶樣品中酵母的檢測[35]。

2.2 微生物快速檢測系統(tǒng)

隨著微生物快速檢測系統(tǒng)的完善和發(fā)展，乳及其制品中酵母菌和霉菌的檢測手段也變得更加快捷。鄭東輝[36]利用WKJ-Ⅱ微生物快速檢測儀，該系統(tǒng)是基于計算機(jī)視覺技術(shù)檢測乳制品中的細(xì)菌總數(shù)、酵母菌和霉菌。在上機(jī)測試過程中，通過比色法和微濾富集快速檢測酸奶中酵母菌，通過微濾富集、涂片染色快速檢測酸奶中霉菌。原銓[37]利用美國BioLumix微生物熒光光電檢測系統(tǒng)對酸奶樣品檢測，可以將原先5～7 d的檢測時間縮短至48 h，該檢測系統(tǒng)通過染色技術(shù)監(jiān)測霉菌和酵母菌代謝過程，將染色、新光源、光傳感器結(jié)合在一起的光電檢測系統(tǒng)。

2.3 分子生物學(xué)快速檢測技術(shù)

通過分子生物學(xué)技術(shù)檢測食品中的真菌，已經(jīng)取得顯著成效，并廣泛應(yīng)用于實際生產(chǎn)。目前主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)了不同的PCR技術(shù)，比如反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、熒光定量PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性-PCR以及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)等[38-40]。這些技術(shù)都體現(xiàn)出對特定基因以及特異性引物的選擇和設(shè)計，通過合理的試驗設(shè)計，可以很好地擴(kuò)增出所需要的目標(biāo)DNA，從而利用相關(guān)分析方法，判斷乳品中微生物菌群的數(shù)量和種類。

Vaitilingom等[38]利用RT-PCR擴(kuò)增延伸因子(EF-Tu或者EF-1α)，實現(xiàn)了對巴氏殺菌奶中細(xì)菌、霉菌和酵母的檢測。在4 h內(nèi)，輕易檢測出的細(xì)胞在10個/mL，另外還證實該方法可以用在酸奶、啤酒等產(chǎn)品中。Mayoral等[41]同樣利用RT-PCR技術(shù)成功地檢測出酸奶樣品中有活性的馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)，利用該方法可以檢出酵母的下限為102CFU/mL。Mayoral等[30]還開發(fā)了一種利用PCR-培養(yǎng)技術(shù)檢測酸奶樣品活性的馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)方法，通過對污染酵母的酸奶樣品(不少于10 CFU/g)恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行DNA提取，擴(kuò)增18S rRNA，可以得到一個251 bp的特異性條帶，而未培養(yǎng)的對照酸奶樣品則檢測不到目標(biāo)條帶。針對馬克思克魯維酵母，Kim等[39]報道了一種新穎的基于Taqman探針的熒光定量PCR技術(shù)，用于快速靈敏地檢測開菲爾酸奶發(fā)酵過程中該酵母的污染情況，通過試驗研究發(fā)現(xiàn)，利用該方法可以在2 h內(nèi)檢測出開菲爾酸奶中的馬克思克魯維酵母。相比之下，根據(jù)美國FDA細(xì)菌學(xué)分析手冊所提供的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法用于檢測乳制品中酵母的污染，至少需要5～7 d的分離培養(yǎng)時間以及另外2～3 d的時間用于基于基因測序和生化分析鑒定酵母，Kim等[42]所做的研究工作在乳品工業(yè)上具有更好的應(yīng)用價值。另外通過疊氮溴化丙錠(PMA)結(jié)合qPCR對乳制品樣品中活菌DNA進(jìn)行定量也能快速檢測發(fā)酵乳中酵母菌。蓋冬雪[43]通過建立的PMA-qPCR方法與標(biāo)準(zhǔn)法(GB 19302—2010)檢測酵母菌比較發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳中酵母菌PMA-qPCR活菌檢測結(jié)果與國標(biāo)法符合率大于86.6%，檢測時間約為4 h，該方法作為檢測發(fā)酵乳中是否存在酵母菌的有力工具，適合乳品加工企業(yè)生產(chǎn)線的現(xiàn)場評價。

除此之外，Kasahara 等[44]建立了一種LAMP技術(shù)用于快速檢測乳品中致病酵母菌(C.albicans、C.glabrata、C.tropicalis、T.asahii、T.mucoides、C.parapsilosis)，結(jié)果表明該方法靈敏、省時、高效，可以作為一種監(jiān)測食品質(zhì)量的簡便快速方法。另外利用PCR技術(shù)還可以用于快速評估奶酪成熟過程中菌群的動態(tài)特征及比例，例如Callon等[45]借助單鏈構(gòu)象多態(tài)性-PCR(SSCP-PCR)指紋圖譜分析奶酪中酵母菌群情況，主要是通過設(shè)計酵母特異性引物，擴(kuò)增18S rRNA 的V4區(qū)達(dá)到SSCP分析的目的。

3 乳及乳制品中微生物污染的質(zhì)量控制

隨著中國食品質(zhì)量安全市場準(zhǔn)入制度的建立，食品生產(chǎn)企業(yè)面臨著嚴(yán)峻考驗。對于很多生產(chǎn)企業(yè)來說，由于工藝裝備簡單，技術(shù)力量薄弱，控制微生物的污染成為工作的難點，其中溫度控制是非常重要的[46]。Ombarak等[27]研究發(fā)現(xiàn)可以通過那他霉素和山梨酸鉀的協(xié)同作用抑制霉菌的生長，從而延長奶酪的貯藏期。Ollé Resa等[47]研究則發(fā)現(xiàn)那他霉素對酵母菌也有很好的抑菌效果。此外，水活度是影響食品中真菌發(fā)育的非生物因素之一， Nguyen Van Long等[48]建立了基于氯化鈉或甘油減少水活度的模型，闡述其在奶酪中對絲狀真菌分生孢子萌發(fā)和徑向生長的影響效果，結(jié)果表明通過氯化鈉降低水活度能夠顯著起到抑制真菌效果。

4 展望

開發(fā)具有抗真菌活性的優(yōu)良乳酸菌輔助發(fā)酵劑，不僅可以解決酸奶中霉菌和酵母菌污染的問題，還可以適當(dāng)延長發(fā)酵乳制品貨架期，有望成為提高酸乳產(chǎn)品穩(wěn)定性及品質(zhì)的一把利劍[49-51]。而作為監(jiān)測乳品生產(chǎn)過程中是否存在真菌污染的檢測技術(shù)，今后仍然有很多值得研究和探討的地方。由于各個乳品生產(chǎn)企業(yè)規(guī)模、效益、技術(shù)水平有較大差異。經(jīng)濟(jì)實力雄厚的企業(yè)可以通過購置先進(jìn)的微生物快速檢測系統(tǒng)用于真菌風(fēng)險評估，而對于中小型乳企業(yè)而言，受資金、技術(shù)及人才等因素影響，更希望獲得簡單、快速、低廉的檢測方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，利用熒光定量PCR可以很好地解決這一問題。今后可以進(jìn)一步完善熒光定量PCR體系，比如篩選DNA結(jié)合試劑、開發(fā)其他引物用于檢測更多潛在的微生物[52]。

隨著新科學(xué)技術(shù)和工具的發(fā)展，比如全基因組測序技術(shù)將會給尚未認(rèn)知的乳品微生物研究提供全新的視角，可以用來研究分析那些對產(chǎn)品質(zhì)量或公眾健康有風(fēng)險的微生物[53]。本課題組已著手開展乳品中真菌分子標(biāo)記的開發(fā)，借助新的測序技術(shù)，探索一種快速檢測乳品真菌的方法，以期為乳品真菌污染檢測提供新的思路。