棉鈴蟲唾液凝集素的初步研究

王雄雅 李星 白素芬 李欣

摘要 ：昆蟲唾液在成功取食寄主中發(fā)揮關(guān)鍵作用。而有關(guān)植食性昆蟲唾液（反吐液）的研究多集中在與寄主植物的互作關(guān)系上，鮮有涉及唾液免疫因子的研究。凝集素作為模式識別受體，在病原物的識別中發(fā)揮重要作用，是昆蟲重要的免疫因子。棉鈴蟲幼蟲血淋巴中已報道的凝集素種類至少有8種，但其唾液中是否存在凝集素卻未見報道。本文通過與雞血紅細(xì)胞的血凝反應(yīng)檢測到棉鈴蟲幼蟲唾液中含有凝集活性物質(zhì)，凝集效價高達29。顯微觀察顯示，唾液對雞血紅細(xì)胞具有明顯的凝集作用。經(jīng)35%和45%硫酸銨鹽析沉淀獲得的組分具有明顯凝集活性，表明唾液中的凝集活性物質(zhì)為蛋白質(zhì)。通過糖抑制試驗，發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲唾液凝集素與其血淋巴凝集素的糖結(jié)合譜存在差異，表明他們是不同的凝集素種類。棉鈴蟲唾液凝集素的揭示為理解植食性昆蟲唾液的免疫功能提供了新的證據(jù)。

關(guān)鍵詞 ：凝集素; 棉鈴蟲; 唾液（反吐液）; 凝集活性; 糖抑制試驗

中圖分類號：

Q 965文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019529

A preliminary study of lectin in the saliva （regurgitant） of Helicoverpa armigera

WANG Xiongya1，2， LI Xing1， BAI Sufen1， LI Xin1*

（1. College of Plant Protection， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China;

2. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract ：Insect saliva plays a major role in successful feeding on host. In recent years， the researches on salivary components of herbivory insects have mainly focused on the coevolution and relationships between insects and plants， and less attention have been paid to the factors involved in immunity. Lectins， as pattern recognition receptors， play important roles in recognizing foreign substances in the insect immune system. There are at least eight Ctype lectins in larval hemolymph of Helicoverpa armigera， but until now no lectin has ever been reported in its saliva （regurgitant）. In the present study， the agglutination activity of H.armigera saliva was detected by hemagglutination reaction with chicken erythrocytes. The agglutination reaction of chicken erythrocytes treated with H.armigera saliva was observed obviously under phase contrast microscope. By ammonium sulfate precipitation， the protein precipitated by 35% and 45% ammonium sulfate showed obvious agglutination activity， indicating that the substance with agglutination activity in saliva was a protein. The carbohydrateinhibition assay discovered the difference between saliva and hemolymph in carbohydratebinding profiles of lectin， suggesting that they were different lectins. The lectin identified in saliva of H.armigera adds new proof to the understanding of immunity of phytophagous insects.

Key words ：lectin; Helicoverpa armigera; saliva （regurgitant）; agglutination activity; carbohydrate inhibition agglutination test

植食性昆蟲在取食寄主植物時會分泌大量唾液，成分復(fù)雜，含有許多重要的生理功能因子，具有濕潤口器、消化、解毒、免疫、化學(xué)感受，以及調(diào)控寄主植物防御反應(yīng)等功能[1]。在植食性昆蟲與寄主植物長期協(xié)同進化的過程中，唾液發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。唾液成分中激發(fā)子、植食性昆蟲相關(guān)模式分子和效應(yīng)子等是二者之間起聯(lián)系作用的紐帶[2]。素有“超級害蟲”之稱的煙粉虱Bemisia tabaci在取食時，一種效應(yīng)子Bt56隨唾液進入植物韌皮部，通過與植物中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，誘導(dǎo)水楊酸信號途徑來抑制抗蟲物質(zhì)茉莉酸分泌，從而有利于自身的生存和繁殖[3]。不同的植食性昆蟲，會利用不同的唾液成分或含量來適應(yīng)不同的寄主，如多食性昆蟲棉鈴蟲Helicoverpa armigera下唇腺葡萄糖氧化酶活性顯著高于寡食性昆蟲煙夜蛾H. assulta[1， 4]。對鱗翅目昆蟲唾液的研究大多是用口腔分泌物又稱反吐液，是唾液腺分泌物和腸道分泌物的混合液[5]。張帥等通過構(gòu)建棉鈴蟲幼蟲唾液腺全長cDNA文庫，測序得到1 502條EST序列，而這些基因多與消化和植物互作相關(guān)[6]。也有學(xué)者對棉鈴蟲唾液腺和中腸內(nèi)分泌液進行轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一些免疫相關(guān)蛋白，如溶菌酶、蛋白酶抑制劑和β1，3葡聚糖蛋白等[78]，但未提及免疫識別因子凝集素。針對當(dāng)前有關(guān)植食性昆蟲唾液的研究多集中在與寄主植物的互作關(guān)系，而鮮有涉及唾液免疫因子的研究現(xiàn)狀，我們推測棉鈴蟲作為典型的多食性昆蟲，當(dāng)取食時，不僅面對來自不同寄主植物的抗蟲防御反應(yīng)要攻破，更要應(yīng)對眾多來自環(huán)境中的細(xì)菌、病毒、真菌、原生動物等病原物的侵染，其唾液中可能含有豐富的免疫因子。因此，棉鈴蟲唾液中有無免疫識別因子凝集素將是本文首要解決的問題。

凝集素廣泛分布于動物、植物和微生物中，是一類能凝集細(xì)胞、多糖或糖復(fù)合物的非源于免疫反應(yīng)的糖蛋白[9]。作為模式識別受體，凝集素能夠識別細(xì)胞膜表面的碳脂化合物決定簇，是重要的免疫識別因子。目前，已在許多種昆蟲中發(fā)現(xiàn)有凝集素，涉及鱗翅目、雙翅目、蜚蠊目、鞘翅目、直翅目等多個類群，僅果蠅基因組中就有30多種編碼凝集素的基因，已分離純化的昆蟲凝集素達40余種[1011]。大多數(shù)昆蟲凝集素屬于C型凝集素，也是研究最多的一類模式識別受體家族，在Ca2+存在下能夠特異性識別病原菌表面的糖基，引起一系列免疫反應(yīng)從而有效地清除病原菌，有些甚至可以直接殺滅細(xì)菌和病毒[12]。

目前，已在棉鈴蟲幼蟲血淋巴中發(fā)現(xiàn)至少8種C型凝集素，其可被病原菌誘導(dǎo)表達[11， 1315]。C型凝集素除了識別病原物外，還可能參與其他的生物過程，如參與蛻皮過程[16]、免疫激活[1718]、調(diào)理作用、溶血作用[19]等。因其功能的多樣性，眾多學(xué)者將研究的焦點集中在昆蟲血淋巴中的凝集素[2023]，而對植食性昆蟲唾液中凝集素的關(guān)注較少。本文首次在棉鈴蟲幼蟲唾液中發(fā)現(xiàn)凝集活性物質(zhì)，進一步通過糖抑制試驗，對棉鈴蟲唾液和血淋巴中凝集素進行糖結(jié)合譜比較。以期從唾液免疫角度為多食性昆蟲在取食多樣性和環(huán)境適應(yīng)性方面提供依據(jù)，并為進一步明確棉鈴蟲唾液凝集素的種類、理化特性和病原識別譜奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 昆蟲采集與飼養(yǎng)

棉鈴蟲采自鄭州郊區(qū)菜田，并飼養(yǎng)在（28±1）℃，RH（70±10）%，光周期為L∥D=14 h∥10 h的人工氣候箱中。根據(jù)Zhao等[24]的配方配制的人工飼料飼養(yǎng)棉鈴蟲幼蟲。用已消毒的小毛筆將初孵的棉鈴蟲幼蟲輕輕挑到人工飼料上飼養(yǎng)，于3齡初進行分管單頭飼養(yǎng)，在指形管（長8.0 cm，直徑1.5 cm）中放入一長方體人工飼料，管口塞入經(jīng)過消毒的棉塞。棉鈴蟲化蛹后，放入飼養(yǎng)籠內(nèi)，待成蟲羽化產(chǎn)卵。

1.2 幼蟲唾液（反吐液）的提取

將棉鈴蟲末齡取食期幼蟲用鑷子輕微固定，同時用移液器吸頭輕微觸碰幼蟲口器部位，刺激幼蟲反吐唾液，并用移液器及時吸取收集到一個預(yù)冷的離心管中，加入少量晶體苯基硫脲（PTU）以防止唾液黑化。從約100頭末齡幼蟲中采集約1 000 μL唾液（反吐液）樣品供試。在4℃下14 000 g離心10 min，收集不含固體雜質(zhì)的唾液樣品（上清液），儲存在-20℃，備用。

1.3 幼蟲血淋巴的提取

挑取約50頭棉鈴蟲末齡取食期幼蟲，用剪刀剪掉幼蟲一對腹足，將血淋巴樣品滴入一個預(yù)冷的離心管中，并加入少量晶體苯基硫脲（PTU）以防止血淋巴黑化。收集約1 000 μL血淋巴樣品，并在4℃下，14 000 g離心10 min，收集不含固體雜質(zhì)的相應(yīng)樣品，儲存在-20℃，備用。

1.4 腸液的制備

解剖60～100頭棉鈴蟲末齡取食期幼蟲，將完整的消化道露出，用濾紙吸凈血淋巴，并用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS， pH 7.4）將消化道清洗3遍并用濾紙擦干。前腸較短且腸壁較薄，可直接用移液器吸頭刺破腸壁吸取收集前腸液樣品。中腸腸壁較厚，將完整中腸組織的腸壁縱向剪開并置于離心管內(nèi)，在4℃下8 000 g離心10 min，收集上清液。所有腸液樣品均置于一個預(yù)冷的離心管中并加入少量晶體苯基硫脲（PTU）以防止腸液黑化。在4℃下，14 000 g離心10 min，收集不含固體雜質(zhì)的相應(yīng)樣品，儲存在-20℃，備用。

1.5 脊椎動物紅細(xì)胞的制備

選健康雞采集血液，在4℃下1 000 g離心10 min收集紅細(xì)胞，并通過10倍體積預(yù)冷的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS， pH 7.4）清洗3遍，每次清洗后，在4℃下1 000 g離心5 min。獲得的紅細(xì)胞用0.01 mol/L PBS配制成2%的紅細(xì)胞懸浮液用于血凝活性檢測。

1.6 血凝活性測定與血凝現(xiàn)象觀察

血凝活性測定：凝集活性通過96孔V底微量反應(yīng)板進行檢測，將25 μL的唾液或腸液樣品在96孔V底微量反應(yīng)板中通過0.01 mol/L PBS（pH 7.4）進行連續(xù)倍比稀釋，然后加入25 μL 2%的雞紅細(xì)胞懸浮液混勻，室溫下進行反應(yīng)。用PBS做對照，每個處理重復(fù)3次。室溫反應(yīng)1 h后，待對照組紅細(xì)胞完全沉淀，讀取樣品的凝集效價。以具有凝集活性的樣品最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)作為該樣品的凝集效價，并作為一個凝集活性單位[25]。

血凝現(xiàn)象觀察：預(yù)先用25 μL 2%的雞紅細(xì)胞懸浮液與用PBS連續(xù)倍比稀釋的等體積唾液樣品在96孔反應(yīng)板中室溫反應(yīng)1 h。觀測各孔紅細(xì)胞凝集情況，將觀察到有凝集現(xiàn)象的孔中反應(yīng)混合液取出，并在Leica倒置相差顯微鏡下用Canon Power Shot A650 IS相機觀察和拍照。用PBS代替唾液樣品與雞紅細(xì)胞混勻作為陰性對照。

1.7 唾液樣品硫酸銨鹽析

用飽和硫酸銨溶液分別與50 μL唾液樣品混勻，使混合液中硫酸銨飽和度分別達到20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%和80%，置于冰上沉淀出唾液中的蛋白，在4℃下，14 000 g離心10 min，沉淀的蛋白用0.01 mol/L的PBS緩沖液再溶解。沉淀獲得的蛋白經(jīng)過透析脫鹽并冷凍干燥，用50 μL 0.01 mol/L PBS重新溶解，處理后的樣品通過V底微量反應(yīng)板檢測凝集活性。

1.8 糖抑制試驗

用0.01 mol/L PBS分別配制0.3 mol/L的半乳糖、甘露糖、N乙酰葡萄糖胺、麥芽糖、L阿拉伯糖、乳糖、L鼠李糖、乳果糖和對硝基苯βD吡喃半乳糖苷（PNPG）的糖溶液。將在35%和45%硫酸銨飽和度下鹽析獲得的唾液蛋白透析，所獲唾液蛋白樣品以及幼蟲血淋巴樣品分別與0.3 mol/L的不同糖溶液按1∶1比例混勻，室溫孵育3 h，獲得不同糖處理后的樣品。各樣品通過V底微量反應(yīng)板檢測凝集活性的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉鈴蟲唾液凝集素的檢測

棉鈴蟲唾液樣品通過V底微量反應(yīng)板法檢測其凝集活性。唾液樣品稀釋倍數(shù)在21～24出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，能夠使雞紅細(xì)胞完全溶解，而在26～29雞紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。作為陰性對照的PBS，所有孔中的紅細(xì)胞全部沉淀到底部。該結(jié)果表明棉鈴蟲唾液中存在凝集活性物質(zhì)。

通過相差顯微鏡觀察，雞紅細(xì)胞與稀釋倍數(shù)在26～29的唾液樣品反應(yīng)后，紅細(xì)胞之間出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，唾液樣品在稀釋高達29倍后，依然可以檢測到凝集活性（圖1a），而PBS對照組紅細(xì)胞分布均勻，沒有凝集現(xiàn)象發(fā)生（圖1b）。

2.2 唾液凝集素的來源

因檢測的唾液樣品為口腔反吐液，為明確唾液中凝集活性物質(zhì)的發(fā)生來源，進一步對前腸液和中腸液進行了凝集活性測定。發(fā)現(xiàn)唾液和前腸液具有凝集活性，凝集效價均達到了29（圖2a、b），而中腸液和PBS對照則沒有凝集活性（圖2c、d）。另外唾液、前腸液和中腸液在稀釋21～24倍時對雞紅細(xì)胞均出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

2.3 唾液凝集活性物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)

唾液樣品經(jīng)不同飽和度的硫酸銨溶液分段鹽析，在35%和45%的硫酸銨飽和度下鹽析沉淀獲得的樣品對雞紅細(xì)胞具有較強的凝集活性，凝集效價分別為25和26。結(jié)果表明，唾液中存在的凝集活性物質(zhì)為蛋白質(zhì)。

2.4 凝集素的糖結(jié)合特性

凝集素通過識別異物表面糖鏈實現(xiàn)凝集活性，不同凝集素對糖鏈的結(jié)合譜存在差異，預(yù)先通過與不同糖分子結(jié)合處理，可使凝集素原糖結(jié)合位點被占據(jù)，阻礙其對異物表面糖鏈的識別，抑制凝集活性，進而說明凝集素與糖類的結(jié)合譜。經(jīng)35%和45%硫酸銨鹽析獲得的唾液蛋白樣品與血淋巴樣品對糖的結(jié)合譜存在差異（表1）。麥芽糖能夠抑制35%硫酸銨鹽析蛋白的凝集活性，而不能抑制45%硫酸銨鹽析蛋白和棉鈴蟲血淋巴的凝集活性。L阿拉伯糖和乳糖只能抑制棉鈴蟲血淋巴中的凝集素活性。而乳果糖和PNPG只對45%硫酸銨鹽析蛋白凝集素有抑制作用。半乳糖和L鼠李糖則對這3種樣品的凝集活性均有抑制作用。

3 結(jié)論與討論

目前，有關(guān)昆蟲凝集素的報道主要集中于血漿、血細(xì)胞、脂肪體、肌肉和體壁等多個組織和器官中，主要是由脂肪體和血細(xì)胞合成并分泌到血淋巴中[2629]。本研究證實植食性昆蟲棉鈴蟲幼蟲唾液（反吐液）中存在凝集活性物質(zhì)。通過對唾液、前腸液和中腸液凝集活性分析，發(fā)現(xiàn)凝集素只在唾液和前腸液中存在，我們推斷唾液中的凝集素可能是由棉鈴蟲幼蟲下唇腺合成分泌的，后續(xù)我們通過對棉鈴蟲下唇腺轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了多個凝集素基因（未發(fā)表資料）。凝集素作為模式識別受體，能夠最先發(fā)現(xiàn)并結(jié)合存在于病原物表面的糖蛋白或糖脂，這對病原物的識別和清除起著至關(guān)重要的作用[30]。

唾液是昆蟲內(nèi)部與外界環(huán)境接觸的橋梁，唾液中存在的凝集素有利于昆蟲盡早識別病原物，清除因取食所帶來的病原物。唾液樣品通過不同飽和度的硫酸銨鹽析，獲得的蛋白組分具有凝集活性，這說明唾液中存在的凝集活性物質(zhì)即為蛋白質(zhì)。昆蟲凝集素除了受到正常生理的調(diào)控外，一些外源因素也能誘導(dǎo)其表達水平的變化，如病原菌、寄生蟲、機械損傷和物理因子等[11， 13， 1516]。棉鈴蟲唾液中凝集素是否受到這些因素的影響還有待進一步研究。

凝集素能識別病原物或動物紅細(xì)胞等異物，其本質(zhì)就是對細(xì)胞膜表面糖鏈信息的識別，通過糖抑制試驗即糖分子直接與凝集素糖識別結(jié)構(gòu)域競爭性結(jié)合，抑制凝集素對紅細(xì)胞的凝集作用，獲知不同凝集素的糖結(jié)合特性。本文通過對棉鈴蟲血淋巴和唾液凝集素的糖結(jié)合譜進行比較，發(fā)現(xiàn)兩者對糖的結(jié)合譜存在差異，這說明唾液中的凝集素不同于血淋巴中的凝集素。棉鈴蟲血淋巴中報道至少有8種凝集素，這8種凝集素不僅在結(jié)構(gòu)上存在差異，其時空表達模式也有不同[11]。目前，已有多種昆蟲凝集素的糖結(jié)合譜被報道，它們對糖的結(jié)合特性各有不同[14， 3132]。對糖結(jié)合譜的差異也代表了凝集素對病原物的識別譜存在差異。植食性昆蟲通過唾液與復(fù)雜的外界環(huán)境直接接觸，面臨的病原物種類和數(shù)量可能都要高于血淋巴，這就要求唾液中應(yīng)有更為豐富的凝集素來完成特定的免疫識別作用。有關(guān)棉鈴蟲唾液中凝集素的種類、理化特性及抗菌作用還有待進一步揭示。

參考文獻

[1] RIVERAVEGA L J， ACEVEDO F E， FELTON G W. Genomics of Lepidoptera saliva reveals function in herbivory [J]. Current Opinion in Insect Science， 2017， 19： 6169.

[2] 禹海鑫， 葉文豐， 孫民琴， 等. 植物與植食性昆蟲防御與反防御的三個層次[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2015， 34（1）： 256262.

[3] XU Hongxing， QIAN Lixin， WANG Xingwei， et al. A salivary effector enables whitefly to feed on host plants by eliciting salicylic acidsignaling pathway [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2019， 116（2）： 490495.

[4] YANG Lihong， WANG Xiongya， BAI Sufen， et al. Expressional divergence of insect GOX genes： From specialist to generalist glucose oxidase [J]. Journal of Insect Physiology， 2017， 100： 2127.

[5] 殷海娣， 黃翠虹， 薛堃， 等. 昆蟲唾液成分在昆蟲與植物關(guān)系中的作用[J]. 昆蟲學(xué)報， 2006， 49（5）： 843849.

[6] 張帥， 崔金杰， 王春義， 等. 棉鈴蟲幼蟲唾液腺cDNA文庫的構(gòu)建及EST分析[J]. 昆蟲學(xué)報，2012， 55（6）： 625633.

[7] CELORIOMANCERA M D L P， COURTIADE J， MUCK A， et al. Sialome of a generalist Lepidopteran Herbivore： identification of transcripts and proteins from Helicoverpa armigera labial salivary glands [J/OL]. PLoS ONE， 2011， 6（10）：e26676.DOI：10.1371/journal.pone.0026676.

[8] PAUCHET Y， MUCK A， SVATOS A， et al. Mapping the larval midgut lumen proteome of Helicoverpa armigera， a generalist herbivorous insect [J]. Journal of Proteome Research， 2008， 7（4）： 16291639.

[9] KENNEDY J， PALVA P， CORELLA M， et al. Lectins， versatile proteins of recognition： a review [J]. Carbohydrate Polymers， 1995， 26（3）： 219230.

[10]蔣蕓蕓. 鱗翅目昆蟲內(nèi)外凝集素的研究概況[J]. 華東昆蟲學(xué)報， 2006， 15（1）： 2529.

[11]WANG Jialin， LIU Xusheng， ZHANG Qi， et al. Expression profiles of six novel Ctype lectins in response to bacterial and 20E injection in the cotton bollworm （Helicoverpa armigera） [J]. Developmental & Comparative Immunology， 2012， 37（2）： 221232.

[12]WEIS W I， TAYLOR M E， DRICKAMER K. The Ctype lectin superfamily in the immune system [J]. Immunological Reviews， 1998， 163（1）： 1934.

[13]WANG Xiongya， BAI Sufen， LI Xin， et al. Differential responses of Helicoverpa armigera Ctype immulectin genes to the endoparasitoid Campoletis chlorideae [J/OL]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology， 2017， 94（3）： e21379.DOI：10.1002/arch.21379.

[14]范金水， 羅志良. 棉鈴蟲血淋巴凝集素的性質(zhì)研究[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 1997， 43（6）： 781784.

[15]KEEBAUGH E S， SCHLENKE T A. Adaptive evolution of a novel Drosophila lectin induced by parasitic wasp attack [J]. Molecular Biology and Evolution， 2012， 29（2）： 565577.

[16]CHAI Lianqin， TIAN Yuanyuan， YANG Dantong， et al. Molecular cloning and characterization of a Ctype lectin from the cotton bollworm， Helicoverpa armigera [J]. Developmental & Comparative Immunology， 2008， 32（1）： 7183.

[17]YU Xiaoqiang， KANOST M R. Immulectin2， a pattern recognition receptor that stimulates hemocyte encapsulation and melanization in the tobacco hornworm， Manduca sexta [J]. Developmental & Comparative Immunology， 2004， 28（9）： 891900.

[18]LING Erjun， YU Xiaoqiang. Cellular encapsulation and melanization are enhanced by immulectins， pattern recognition receptors from the tobacco hornworm Manduca sexta [J]. Developmental & Comparative Immunology， 2006， 30（3）： 289299.