毛竹幼苗抗氧化酶和AsA-GSH循環(huán)對(duì)高溫干旱及協(xié)同脅迫的響應(yīng)

韓一林，王鑫朝，許馨露，高 巖，溫國(guó)勝，張汝民，王玉魁

（1.國(guó)家林業(yè)局 竹子研究開發(fā)中心 浙江省竹子高效加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310012；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州311300）

在氣候變暖的背景下，高溫和干旱等災(zāi)害天氣出現(xiàn)更為頻繁。溫度和水分作為全球氣候變化的兩大重要表征，是影響植物生長(zhǎng)和分布的最重要的非生物因素［1］。兩者獨(dú)立或交互作用，都會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生極大影響［2］。 活性氧（ROS）如過(guò)氧化氫（H2O2）， 超氧陰離子（O2·-）， 羥自由基（·OH）和單線態(tài)氧（1O2）等，是植物中氧化還原級(jí)聯(lián)的有氧代謝產(chǎn)物，如果不能被及時(shí)清除，將產(chǎn)生很強(qiáng)的氧化性，導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物大分子產(chǎn)生永久性傷害，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡［3］。此外，隨著ROS的積累，生物膜不飽和脂肪酸分解產(chǎn)生的丙二醛（MDA）［4］，一方面加劇細(xì)胞質(zhì)膜過(guò)氧化程度，導(dǎo)致膜系統(tǒng)損傷，使細(xì)胞受到傷害［5］；另一方面植物細(xì)胞產(chǎn)量顯著減少，最終引起機(jī)體衰老［6］。植物處于逆境下并不是被動(dòng)承受傷害，而是主動(dòng)調(diào)節(jié)適應(yīng)。植物在進(jìn)化過(guò)程中形成了相應(yīng)的酶促保護(hù)系統(tǒng)［如超氧化物歧化酶（SOD），過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）等］，能有效清除ROS，提高植物耐受能力［7］。 RAMíREZ等［8］研究發(fā)現(xiàn)， 擬南芥Arabidopsis thaliana通過(guò)維持體內(nèi)非酶系統(tǒng)［抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)］快速有效運(yùn)轉(zhuǎn)，減輕逆境脅迫下植物的活性氧傷害，使植物更好地適應(yīng)環(huán)境。學(xué)者對(duì)單一逆境脅迫條件下植物抗氧化防御系統(tǒng)的研究已有報(bào)道，并被認(rèn)為是一個(gè)能夠反映植物抗性大小的普遍標(biāo)記［2，9］，但是高溫干旱復(fù)合脅迫對(duì)抗氧化防御系統(tǒng)的研究較為少見。毛竹Phyllostachys edulis在中國(guó)分布極廣，具有重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值［10］。目前，針對(duì)毛竹抗逆性的研究主要集中在光合作用［11］、生長(zhǎng)形態(tài)［12］和單一逆境下的抗氧化酶活性［13］等方面。本研究以毛竹為研究對(duì)象，通過(guò)設(shè)置高溫與干旱脅迫不同水平的處理，分析高溫和干旱疊加條件下毛竹體內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況，探討抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)抵御氧化脅迫的變化規(guī)律，揭示高溫和干旱雙重脅迫下毛竹生理生化響應(yīng)機(jī)制及其抗高溫和干旱的能力，為毛竹林培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗(yàn)材料為3年生毛竹實(shí)生苗，苗高為1.0 m左右。于2015年8月下旬，選取生長(zhǎng)良好形態(tài)相近的毛竹幼苗移栽于塑料花盆中（花盆高為50.0 cm，內(nèi)徑為60.0 cm），取浙江臨安當(dāng)?shù)氐狞S壤土作為栽培土壤，pH 6.9～7.0，1株·盆-1，在緩苗期間，用自來(lái)水澆灌。選取生長(zhǎng)良好，無(wú)病蟲害，長(zhǎng)勢(shì)相近的毛竹25盆，其中對(duì)照組10盆，其余隨機(jī)分成3組（處理），5盆·組-1（重復(fù)），在常溫條件下（25℃/20℃，晝/夜）栽培。將對(duì)照組中的10盆隨機(jī)分為2組，5盆·組-1，其中1組作為干旱處理的對(duì)照組，正常管理，另一組作為高溫處理組，正常管理。

干旱處理：在緩苗30 d后進(jìn)行。設(shè)計(jì)4個(gè)梯度的處理：對(duì)照70.0%～80.0%田間持水量（FC），輕度干旱（60.0%～70.0%FC）， 中度干旱（40.0%～50.0%FC）和重度干旱（20.0%～30.0%FC）。 采用稱量法控制土壤水分含量，每天17：00-18：00稱量并補(bǔ)充消耗的水分，干旱處理10 d。選取毛竹植株中上部完整的功能葉片取樣，樣品用液氮迅速冷凍，置于-80℃低溫冰箱內(nèi)保存。溫度處理：在8：00時(shí)將其中1組對(duì)照組和干旱處理過(guò)的毛竹盆栽苗放入40℃/30℃（晝/夜）人工氣候箱，設(shè)定晝夜相隔時(shí)間12 h，光照強(qiáng)度設(shè)定為400 μmol·m-2·s-1，高溫處理48 h后取毛竹植株中上部完整的功能葉片進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.2 測(cè)試方法

1.2.1 O2·-，過(guò)氧化氫和MDA測(cè)定 O2·-測(cè)定參照SHAH等［14］的方法并略作改進(jìn)：取0.2 g冷凍樣品，加5.0 mL磷酸緩沖液（100.0 mmol·L-1，pH 7.2， 含1.0 mmol·L-1二乙基二硫代氨基甲酸鈉）研磨， 15 000 g離心30 min（4℃）。3.0 mL反應(yīng)體系包含：2.0 mL樣品提取液和1.0 mL氮藍(lán)四唑（NBT，0.25 mmol·L-1），在540 nm處測(cè)定3 min內(nèi)吸光度的變化。 結(jié)果表示為ΔD（540）·min-1·g-1。 過(guò)氧化氫測(cè)定參照 RAI等［15］的方法并略作改進(jìn)：取0.2 g冷凍樣品，加5.0 mL磷酸緩沖液（50.0 mmol·L-1，pH 6.5）磨碎，3.0 mL樣品提取液與體積分?jǐn)?shù)為20%的硫酸（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%硫酸鈦）1.0 mL混合，16 000 g離心15 min（4℃），取上清液測(cè)定410 nm處的吸光度。過(guò)氧化氫的質(zhì)量摩爾濃度用吸光系數(shù)0.28 μmol-1·cm-1來(lái)計(jì)算，結(jié)果表示為 μmol·g-1。 MDA 測(cè)定參照 HODGES 等［16］的方法。

1.2.2 抗氧化酶活性測(cè)定 取0.2 g冷凍樣品液氮研磨，加5.0 mL磷酸緩沖溶液（50.0 mmol·L-1，pH 7.8）勻漿，10 000 g離心10 min（4℃）。上清液用于SOD，POD和CAT活性的測(cè)定。SOD活性測(cè)定參照GIANNOPOLITIS等［17］的方法。POD活性測(cè)定參照KUMARI等［18］的愈瘡木酚法。CAT活性測(cè)定參照KUMARI等［18］的方法。

1.2.3 AsA和GSH測(cè)定 取0.2 g冷凍樣品液氮研磨，加50.0 g·L-1偏磷酸5.0 mL勻漿，15 000 g離心15 min（4℃），上清液用于AsA和GSH的測(cè)定。AsA和GSH測(cè)定參照RAI等［19］的方法。

1.2.4 AsA-GSH循環(huán)相關(guān)酶活性測(cè)定 取0.2 g樣品用5.0 mL磷酸緩沖溶液（pH 7.4，含1.0 mmol·L-1乙二胺四乙酸EDTA）冰浴研磨成勻漿，混勻后在16 000 g離心20 min（4℃）。上清液為毛竹AsA-GSH循環(huán)的相關(guān)酶活性測(cè)定的酶液?？箟难徇^(guò)氧化物酶（APX）活性測(cè)定參照NAKANO等［20］的方法。谷胱甘肽還原酶（GR）活性測(cè)定參照SCHAEDLE等［21］的方法。單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性測(cè)定參照HOSSAIN 等［22］的方法。 脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性測(cè)定參照 DOULIS等［23］的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分為2組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：一組為干旱脅迫處理，另一組為高溫干旱脅迫處理，高溫對(duì)照組即高溫處理組，所有的數(shù)據(jù)均取5次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。各組的數(shù)據(jù)利用Origin 9軟件（美國(guó)Origin Lab公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)，并進(jìn)行Turkey多重比較。采用雙因素方差分析（two-way ANOVA）評(píng)估高溫脅迫×干旱脅迫的協(xié)同作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 O2·-， 過(guò)氧化氫和 MDA 變化

隨干旱脅迫程度的增加毛竹葉片中的O2·-，過(guò)氧化氫和MDA質(zhì)量摩爾濃度逐漸上升（表1），其中在輕度干旱脅迫條件下，O2·-和MDA質(zhì)量摩爾濃度分別比對(duì)照高39.9%和68.8%（P＜0.01）；中度干旱脅迫時(shí)，O2·-，MDA和過(guò)氧化氫質(zhì)量摩爾濃度分別比對(duì)照高74.4%，94.5%和38.8%（P＜0.01）。在高溫脅迫條件下，O2·-，過(guò)氧化氫和MDA質(zhì)量摩爾濃度分別比對(duì)照高44.2%，21.9%和140.9%（P＜0.01）。在協(xié)同脅迫下，三者質(zhì)量摩爾濃度進(jìn)一步增加，在輕度干旱和高溫協(xié)同脅迫下，O2·-，過(guò)氧化氫和MDA質(zhì)量摩爾濃度分別比對(duì)照高67.6%，28.8%和170.5%（P＜0.01）。

2.2 SOD，POD與CAT活性變化

隨干旱脅迫程度的增加，毛竹葉片的SOD，POD和CAT活性均逐漸增加（圖1）。中度干旱脅迫下，SOD和POD活性分別比對(duì)照高1.7倍和1.7倍（P＜0.01）；輕度干旱脅迫下，CAT活性比對(duì)照高1.9倍（P＜0.05）。在高溫脅迫條件下，SOD，POD和CAT活性分別比對(duì)照高0.8倍、0.6倍和1.6倍，三者活性與其對(duì)照的差異均極顯著（P＜0.01）。協(xié)同脅迫使SOD和POD活性呈先增加后降低，且均在中度干旱水平的協(xié)同脅迫下達(dá)到峰值，分別比對(duì)照高2.9倍和3.2倍（P＜0.01）；CAT活性呈逐漸增加趨勢(shì)，在中度干旱和高溫協(xié)同脅迫下與對(duì)照的差異極顯著（P＜0.01）。

表1 干旱和高溫脅迫對(duì)毛竹活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的影響Table 1 Effects of high temperature and drought stress on ROS and MDA contents in Phyllostachys edulis

2.3 抗氧化物的變化

隨干旱脅迫程度的增加，毛竹葉片的AsA和二十二碳六烯酸（DHA）質(zhì)量摩爾濃度均呈逐漸上升趨勢(shì)（圖2），在中度干旱時(shí)AsA質(zhì)量摩爾濃度比對(duì)照高49.5%（P＜0.01）；在輕度干旱時(shí)DHA質(zhì)量摩爾濃度比對(duì)照高30.6%（P＜0.01）；ρAsA/ρDHA呈先下降后上升，在輕度干旱時(shí)達(dá)到最小值，比對(duì)照降低13.9%（P＞0.05）。在高溫條件下，AsA質(zhì)量摩爾濃度和ρAsA/ρDHA分別比對(duì)照高55.6%和34.1%（P＜0.01）；DHA質(zhì)量摩爾濃度比對(duì)照高15.6%（P＜0.05）。協(xié)同脅迫下，三者變化均不大：其中AsA質(zhì)量摩爾濃度呈先增加后降低，在中度干旱和高溫的協(xié)同脅迫時(shí)達(dá)最大值，比對(duì)照高72.9%（P＜0.01），隨后降低；DHA質(zhì)量摩爾濃度總體變化不大，輕度干旱和高溫協(xié)同脅迫時(shí)，比對(duì)照高22.3%（P＜0.05），其他變化不顯著；ρAsA/ρDHA變化不大，在輕度干旱和高溫協(xié)同脅迫時(shí)達(dá)最大值，比對(duì)照高37.3%（P＜0.01）。

在干旱脅迫條件下，毛竹葉片的還原型谷胱甘肽（GSH）質(zhì)量摩爾濃度變化與對(duì)照差異不顯著（P＞0.05）（圖3）；氧化型谷胱甘肽（GSSG）質(zhì)量摩爾濃度呈下降趨勢(shì)，中度干旱脅迫時(shí)其質(zhì)量摩爾濃度比對(duì)照降低30.6%（P＜0.01）；ρGSH/ρGSSG呈上升趨勢(shì)，中度干旱比對(duì)照高55.3%（P＜0.01）。在高溫脅迫及協(xié)同脅迫下，三者的變化與對(duì)照比較均不顯著（P＞0.05）。

2.4 AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)酶活性變化

隨干旱脅迫程度的增加，毛竹葉片的APX酶活性先逐漸增加后變化緩慢（圖4），在中度干旱脅迫下達(dá)到最大值，比對(duì)照高1.8倍（P＜0.01）；GR和MDHAR活性均呈上升趨勢(shì)，輕度干旱脅迫時(shí)其活性分別比對(duì)照高0.7倍和0.9倍（P＜0.01）；DHAR活性先增加后降低，中度干旱脅迫時(shí)達(dá)到最大值，比對(duì)照高2.3倍（P＜0.01）。高溫脅迫時(shí)，APX活性比對(duì)照高0.3倍（P＜0.05）；而GR，MDHAR和DHAR活性分別比對(duì)照高0.9倍、1.1倍和0.6倍（P＜0.01）。在高溫的基礎(chǔ)上，隨著干旱脅迫程度的加深，四者活性均呈先增加后降低，APX和GR活性增加緩慢，MDHAR和DHAR活性增加迅速，中度干旱和高溫協(xié)同脅迫時(shí)均達(dá)到最大值，分別比對(duì)照高1.2倍、1.9倍、3.9倍和1.9倍（P＜0.01），隨后降低。

3 討論

細(xì)胞膜對(duì)維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)具有至關(guān)重要的作用，而O2·-和過(guò)氧化氫是植物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的2種活性氧，對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)具有較強(qiáng)的氧化傷害作用；MDA作為膜脂過(guò)氧化作用的終極產(chǎn)物，其變化可解釋逆境脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜的破壞程度及植物對(duì)逆境的響應(yīng)［24］。本試驗(yàn)結(jié)果表明：干旱脅迫下，毛竹葉片中的O2·-和MDA產(chǎn)生速率明顯增加，而高溫脅迫下，過(guò)氧化氫、O2·-和MDA產(chǎn)生速率增加均極顯著，且高溫時(shí)MDA質(zhì)量摩爾濃度較中度干旱脅迫顯著增加。這與吳永波等［2］的研究結(jié)果不一致，表明高溫比干旱對(duì)毛竹的影響更大，可能是在不同溫度和水分條件下，不同植物體內(nèi)活性氧對(duì)植物產(chǎn)生的傷害程度不同導(dǎo)致的。協(xié)同脅迫下，隨著干旱程度的增加，三者質(zhì)量摩爾濃度逐漸增加，且在同等干旱程度下，高溫條件下的O2·-和MDA質(zhì)量摩爾濃度均比正常溫度下的質(zhì)量摩爾濃度顯著升高，表明協(xié)同脅迫較單一脅迫對(duì)毛竹傷害更大，可能協(xié)同脅迫已經(jīng)傷害到抗氧化物質(zhì)產(chǎn)生的機(jī)構(gòu)，削弱了對(duì)氧化物質(zhì)的清除作用，導(dǎo)致氧化物質(zhì)不斷累積。

毛竹處于逆境中，不僅體內(nèi)過(guò)氧化氫、O2·-和MDA的產(chǎn)量大量增加，還刺激抗氧化酶活性增強(qiáng)。SOD，POD和CAT是植物抗氧化系統(tǒng)重要組成部分［25］。其中SOD是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，可以使植物體內(nèi)過(guò)量的O2·-發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過(guò)氧化氫（H2O2）和氧氣（O2）；POD和CAT與SOD具有協(xié)同作用，將其氧化產(chǎn)生的H2O2和具有潛在危害的O2·-轉(zhuǎn)化為水和氧氣，從而阻止O2·-和過(guò)氧化氫在植物體內(nèi)的累積，減少對(duì)植物體的傷害。本研究發(fā)現(xiàn)：隨干旱高溫脅迫程度的增加，毛竹葉片產(chǎn)生過(guò)量的ROS，且抗氧化酶活性升高。說(shuō)明O2·-質(zhì)量摩爾濃度增加，它的積累刺激葉片中SOD應(yīng)激反應(yīng)使活性增強(qiáng)，催化O2·-歧化生產(chǎn)基態(tài)分子氧和過(guò)氧化氫；毛竹葉片中的過(guò)氧化氫和MDA逐漸增加，由于POD和CAT的作用，其質(zhì)量摩爾濃度增幅緩慢；而在重度干旱和高溫協(xié)同脅迫下，SOD和POD活性較中度干旱和高溫協(xié)同脅迫顯著降低，CAT活性降低不明顯，可能是SOD活性表達(dá)受到抑制，且過(guò)度脅迫導(dǎo)致一部分已經(jīng)表達(dá)的SOD失活［26］造成的，而POD和CAT酶活性分別在高溫干旱前期和后期對(duì)過(guò)氧化氫清除起主導(dǎo)作用［27］，表明在持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的高溫干旱條件下，CAT效率更高，耐性更穩(wěn)定。總之，在單一脅迫條件時(shí)，毛竹在抗氧化酶防御系統(tǒng)作用下，能有效消除因高溫干旱脅迫積累的ROS，使過(guò)氧化氫、O2·-和MDA質(zhì)量摩爾濃度增幅減緩，表明一方面脅迫條件下毛竹體內(nèi)產(chǎn)生的ROS能夠?qū)γ癞a(chǎn)生傷害，另一方面毛竹在遇到脅迫會(huì)刺激抗氧化酶活性增加，有效清除ROS，維持毛竹體內(nèi)活性氧平衡，防止氧化傷害，適應(yīng)環(huán)境變化。而在協(xié)同脅迫條件時(shí)，過(guò)氧化氫、O2·-和MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著增加，SOD，POD和CAT活性有降低趨勢(shì)，表明協(xié)同脅迫比單一脅迫對(duì)植物造成的傷害更大。

圖1 不同處理毛竹葉片抗氧化酶活性變化Figure 1 Changes of antioxidant enzyme activities in Phyllostachys edulis under different treatments

AsA-GSH循環(huán)是植物體內(nèi)清除自由基的重要途徑。AsA不僅可以直接清除活性氧，在AsA-GSH循環(huán)清除過(guò)氧化氫過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用［27］。APX是以AsA為電子供體的一種過(guò)氧化物酶，能夠快速清除細(xì)胞中產(chǎn)生的過(guò)量的過(guò)氧化氫，是植物體內(nèi)尤其是葉綠體中清除過(guò)氧化氫的關(guān)鍵酶［28］；植物通過(guò)維持較高的ρAsA/ρDHA和ρGSH/ρGSSG比值，使植物體內(nèi)抗壞血酸庫(kù)和谷胱甘肽庫(kù)保持較高的還原態(tài)［29-30］。本研究結(jié)果表明：在單一脅迫下，毛竹葉片產(chǎn)生過(guò)量的H2O2，AsA和DHA質(zhì)量摩爾濃度隨之增加，一方面直接消除過(guò)氧化氫降低傷害；另一方面通過(guò)AsA-GSH循環(huán)清除過(guò)氧化氫。但輕度干旱脅迫下，ρAsA/ρDHA比值最低，可能是由于干旱脅迫初期，毛竹葉片產(chǎn)生過(guò)量的過(guò)氧化氫，AsA清除過(guò)氧化氫有所消耗，而AsA-GSH循環(huán)不能及時(shí)補(bǔ)充AsA，使得ρAsA/ρDHA比值降低；隨脅迫程度增強(qiáng)，毛竹適應(yīng)此逆境后，AsAGSH循環(huán)達(dá)到一個(gè)新的穩(wěn)態(tài)，及時(shí)補(bǔ)充AsA的損失，維持較高的ρAsA/ρDHA比值，抵抗氧化脅迫；同時(shí)，GSH質(zhì)量摩爾濃度變化較對(duì)照不明顯，GR活性增加，與GSSG質(zhì)量摩爾濃度變化相反，說(shuō)明GR在還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的作用下，加速催化GSSG還原成GSH，使毛竹葉片中的ρGSH/ρGSSG比值增加，維持植物體內(nèi)較高的還原態(tài)，減緩毛竹氧化傷害。這與楊穎麗等［31］研究結(jié)果一致。在干旱和高溫協(xié)同脅迫下，AsA，DHA，GSH和GSSH質(zhì)量摩爾濃度變化不大，而APX，MDHAR，DHAR和GR活性先增加后降低，均在中度干旱和高溫協(xié)同脅迫時(shí)達(dá)到峰值，這是因?yàn)樵贏sA-GSH循環(huán)中，毛竹受到較強(qiáng)程度協(xié)同脅迫的刺激，使葉片中清除過(guò)氧化氫的APX和加快AsA循環(huán)再生的MDHAR和DHAR活性的增加，加快AsA和DHA大量快速生成，及時(shí)補(bǔ)充AsA清除過(guò)氧化氫的消耗；同時(shí)，毛竹葉片中GSSG在關(guān)鍵酶GR作用下催化產(chǎn)生GSH，DHAR利用GSH提供的電子供體將DHA還原成AsA，使AsA質(zhì)量摩爾濃度保持穩(wěn)定，進(jìn)而促進(jìn)AsA-GSH循環(huán)，使ρAsA/ρDHA比值維持在較強(qiáng)的還原性范圍內(nèi)，以利于抵御氧化脅迫；此時(shí)ρGSH/ρGSSG比值較為穩(wěn)定，說(shuō)明GSH循環(huán)比AsA循環(huán)對(duì)過(guò)氧化氫的還原作用更為穩(wěn)定，清除過(guò)氧化氫的作用更為持久有效，因此GR作為AsA-GSH循環(huán)中最后一步關(guān)鍵酶，在毛竹抵抗高溫干旱脅迫中發(fā)揮重要作用。但在重度干旱和高溫協(xié)同脅迫下，APX，MDHAR，DHAR和GR活性降低，AsA質(zhì)量摩爾濃度隨之降低，導(dǎo)致ρAsA/ρDHA比值也略有降低，說(shuō)明毛竹葉片在高強(qiáng)度的協(xié)同脅迫下，AsA-GSH循環(huán)中的酶受溫度和水分的影響，活性降低，此循環(huán)不能及時(shí)催化產(chǎn)生AsA，補(bǔ)充AsA清除過(guò)氧化氫產(chǎn)生的消耗，導(dǎo)致AsA-GSH循環(huán)效率降低，抵御逆境的能力降低。而DHA質(zhì)量摩爾濃度變化不大，這與MOSTOFA等［32］研究結(jié)果不一致，這可能是過(guò)度脅迫條件下，由于MDHA極不穩(wěn)定，既可還原成AsA，也可進(jìn)一步歧化為DHA，又因?yàn)檫^(guò)多的DHA積累對(duì)細(xì)胞有害，所以MDHAR能限制MDHA產(chǎn)生以及進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為DHA；此外，由于DHAR活性降低，無(wú)法利用GSH提供的電子供體把DHA還原成AsA［33］，使得毛竹葉片中的AsA循環(huán)被打破，形成新的動(dòng)態(tài)循環(huán)，也說(shuō)明這些酶對(duì)脅迫的反應(yīng)因物種而異。這也表明毛竹幼苗的AsA循環(huán)對(duì)逆境反應(yīng)較GSH循環(huán)更敏感，而GSH循環(huán)在抵御逆境的能力更穩(wěn)定。

圖2 不同處理毛竹葉片抗壞血酸的變化Figure 2 Changes in the content of ascorbic acid in Phyllostachys edulis under different treatments

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（n=5）。根據(jù)Tukey檢驗(yàn)（P＜0.05），同列不同大寫字母表示25℃時(shí)不同處理類型間差異顯著，同列不同小寫字母表示40℃時(shí)不同處理類型間差異顯著。Fs表示不同溫度間的差異；Fm表示不同處理類型的影響，F(xiàn)s×Fm表示植物組織應(yīng)對(duì)高溫干旱脅迫的不同響應(yīng)。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，ns表示差異不顯著

圖4 不同處理毛竹葉片AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)酶活性變化Figure 4 Changes of enzyme activities in AsA-GSH cycle system in Phyllostachys edulis under different treatments

4 結(jié)論

隨高溫干旱單一處理強(qiáng)度的增加，毛竹葉片中的過(guò)氧化氫、O2·-與MDA質(zhì)量摩爾濃度增加，且協(xié)同脅迫下，三者質(zhì)量摩爾濃度進(jìn)一步增加，表明高溫干旱協(xié)同脅迫下較單一脅迫對(duì)毛竹傷害更大。干旱和高溫協(xié)同脅迫下，毛竹葉片內(nèi)抗氧化防御酶活性逐漸增強(qiáng)，且CAT清除過(guò)氧化氫較POD活性表現(xiàn)更為穩(wěn)定，說(shuō)明在抗氧化酶系統(tǒng)中CAT清除過(guò)氧化氫效果更為持久，在協(xié)同脅迫后期對(duì)防御氧化傷害起到主要作用；AsA-GSH循環(huán)相關(guān)酶活性隨處理的增強(qiáng)而增加，通過(guò)AsA和GSH的再生，AsA-GSH循環(huán)動(dòng)態(tài)平衡得以維持，有效消除過(guò)氧化氫，保護(hù)毛竹細(xì)胞不受損害，且在AsA-GSH循環(huán)中，ρGSH/ρGSSG比值較ρAsA/ρDHA比值更為穩(wěn)定，說(shuō)明GSH循環(huán)清除過(guò)氧化氫比AsA循環(huán)的效果更為持久，對(duì)持續(xù)協(xié)同脅迫起到重要防御作用。但是在重度干旱和高溫協(xié)同脅迫下，毛竹葉片抗氧化防御酶活性和AsA-GSH循環(huán)相關(guān)酶活性均表現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明毛竹的酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)對(duì)高溫干旱協(xié)同脅迫的抵御能力是有限的，在一定范圍內(nèi)可有效清除活性氧，超出一定范圍則降低。

［1］ GODOY O,LEMOS-FILHO J P D,VALLADARES F.Invasive species can handle higher leaf temperature under water stress than Mediterranean natives ［J］.Environ Exp Bot,2011,71（2）：207-214.

［2］ 吳永波，葉波.高溫干旱復(fù)合脅迫對(duì)構(gòu)樹幼苗抗氧化酶活性和活性氧代謝的影響［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2016，36（2）： 403-410.WU Yongbo,YE Bo.Effects of combined elevated temperature and drought stress on anti-oxidative enzyme activities and reactive oxygen species metabolism of Broussonetia papyrifera seedlings ［J］.Acta Ecol Sin,2016,36（2）：403-410.

［3］ 閆慧芳，毛培勝，夏方山.植物抗氧化劑谷胱甘肽研究進(jìn)展［J］.草地學(xué)報(bào)，2013，21（3）：428-435.YAN Huifang,MAO Peisheng,XIA Fangshan.Research progress in plant antioxidant glutathione （review） ［J］.Acta Agrest Sin,2013,21（3）：428-435.

［4］ WANG Qinghai,QUE Xiaoe,ZHENG Ruilun,et al.Phytotoxicity assessment of atrazine on growth and physiology of three emergent plants ［J］.Environ Sci Pollut Res,2015,22（13）：9646-9657.

［5］ GILL S S,TUTEJA N.Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants［J］.Plant Physiol Biochem,2010,48（12）：909-930.

［6］ PAW?OWSKA B,BICZAK R.Evaluation of the effect of tetraethylammonium bromide and chloride on the growth and development of terrestrial plants ［J］.Chemosphere,2016,149：24-33.

［7］ 李春燕，徐雯，劉立偉，等.低溫條件下拔節(jié)期小麥葉片內(nèi)源激素含量和抗氧化酶活性的變化［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2015， 26（7）： 2015-2022.LI Chunyan,XU Wen,LIU Liwei,et al.Changes of endogenous hormone contents and antioxidative enzyme activities in wheat leaves under low temperature stress at jointing stage ［J］.Chin J Appl Ecol,2015,26（7）：2015-2022.

［8］ RAMíREZ L,BARTOLI C G,LAMATTINA L.Glutathione and ascorbic acid protect Arabidopsis plants against detrimental effects of iron deficiency ［J］.J Exp Bot,2013,64（11）：3169-3178.

［9］ WUJESKA-KLAUSE A,BOSSINGER G,TAUSZ M.The concentration of ascorbic acid and glutathione in 13 provenances of Acacia melanoxylon ［J］.Tree Physiol,2016,36（4）：524-532.

［10］ KUEHL Y,LI Y,HENLEY G.Impacts of selective harvest on the carbon sequestration potential in moso bamboo（Phyllostachys pubescens） plantations ［J］.For Tree Livelihoods,2013,22（1）：1-18.

［11］ 王玉魁，郭慧媛，閻艷霞，等.酸雨脅迫對(duì)毛竹葉片光合速率和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響［J］.生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2015， 24（9）： 1425-1433.WANG Yukui,GUO Huiyuan,YAN Yanxia,et al.Effect of acid rain stress on photosynthetic rate and chlorophyll fluorescence parameters in leaves of Phyllostachys pubescens ［J］.Ecol Environ Sci,2015,24（9）：1425-1433.

［12］ 沈蕊，白尚斌，周國(guó)模，等.毛竹種群向針闊林?jǐn)U張的根系形態(tài)可塑性［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2016，36（2）：326-334.SHEN Rui,BAI Shangbin,ZHOU Guomo,et al.The response of root morphological plasticity to the expansion of a population of Phyllostachys edulis into a mixed needle-and broad-leaved forest［J］.Acta Ecol Sin,2016,36（2）：326-334.

［13］ LI Song,CHEN Junren,ISLAM E,et al.Cadmium-induced oxidative stress， response of antioxidants and detection of intracellular cadmium in organs of moso bamboo （Phyllostachys pubescens） seedlings ［J］.Chemosphere,2016,153：107-114.

［14］ SHAH K,KUMAR R G,VERMA S,et al.Effect of cadmium on lipid peroxidation， superoxide anion Generation and activities of antioxidant enzymes in growing rice seedlings ［J］.Plant Sci,2001,161（6）：1135-1144.

［15］ RAI A C,SINGH M,SHAH K.Effect of water withdrawal on formation of free radical,proline accumulation and activities of antioxidant enzymes in ZAT12-transformed transgenic tomato plants ［J］.Plant Physiol Biochem,2012,61（4）：108-114.

［16］ HODGES D M,DELONG J M,FORNEY C F,et al.Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds ［J］.Planta,1999,207（4）：604-611.

［17］ GIANNOPOLITIS C N,RIES S K.Superoxide dismutases （Ⅰ） occurrence in higher plants ［J］.Plant Physiol,1977,59（2）：309-314.

［18］ KUMARI G J,REDDY A M,NAIK S T,et al.Jasmonic acid induced changes in protein pattern,antioxidative enzyme activities and peroxidase isozymes in peanut seedlings ［J］.Biol Plant,2006,50（2）：219-226.

［19］ RAI G K,RAI N P,RATHAUR S,et al.Expression of rd29A：：AtDREB1A/CBF3 in tomato alleviates drought-induced oxidative stress by regulating key enzymatic and non-enzymatic antioxidants ［J］.Plant Physiol Biochem,2013,69（8）：90-100.

［20］ NAKANO Y,ASADA K.Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts［J］.Plant Cell Physiol,1981,22（5）：867-880.

［21］ SCHAEDLE M.Chloroplast glutathione reductase ［J］.Plant Physiol,1977,59（5）：1011-1012.

［22］ HOSSAIN M A,NAKANO Y,ASADA K.Monodehydroascorbate reductase in spinach chloroplasts and its participation in regeneration of ascorbate for scavenging hydrogen peroxide ［J］.Plant Cell Physiol,1984,25（3）：385-395.

［23］ DOULIS A G,DEBIAN N,KINGSTONSMITH A H,et al.Differential localization of antioxidants in maize leaves［J］.Plant Physiol,1997,114（3）：1031-1037.

［24］ 李力，劉玉民，王敏，等.3種北美紅楓對(duì)持續(xù)高溫干旱脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，34（22）： 6471-6480.LI Li,LIU Yumin,WANG Min,et al.Physiological response mechanism of three kinds of Acer rubrum L.under continuous high temperature and drought stress ［J］.Acta Ecol Sin,2014,34（22）：6471-6480.

［25］ 朱啟紅，夏紅霞.淹水脅迫對(duì)石菖蒲抗氧化酶系統(tǒng)的影響［J］.水生態(tài)學(xué)雜志，2012，33（4）：138-141.ZHU Qihong,XIA Hongxia.Effect of flooding stress on antioxidant enzyme system of Acorus tatarinowii Schott ［J］.J Hydroecol,2012,33（4）：138-141.

［26］ 王曉鵬，葉梅榮，王松華，等.梯度水分對(duì)魚腥草生長(zhǎng)和抗氧化酶活性的影響［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011， 39（11）： 50-52.WANG Xiaopeng,YE Meirong,WANG Songhua,et al.Effect of moisture gradient on growth and antioxidase activity of Houttuynia cordata ［J］.J Northeast For Univ,2011,39（11）：50-52.

［27］ 郭欣欣，李曉鋒，朱紅芳，等.淹水脅迫對(duì)不結(jié)球白菜抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的影響［J］.植物生理學(xué)報(bào)，2015， 51（12）： 2181-2187.GUO Xinxin,LI Xiaofeng,ZHU Hongfang,et al.Effects of waterlogging stress on ascorbate-glutathione cycle in Brassica campestris ssp.chinensis ［J］.Plant Physiol J,2015,51（12）：2181-2187.

［28］ 李澤琴，李靜曉，張根發(fā).植物抗壞血酸過(guò)氧化物酶的表達(dá)調(diào)控以及對(duì)非生物脅迫的耐受作用［J］.遺傳，2013， 35（1）：45-54.LI Zeqin,LI Jingxiao,ZHANG Genfa.Expression regulation of plant ascorbate peroxidase and its tolerance to abiotic stresses ［J］.Hereditas,2013,35（1）：45-54.

［29］ TURAN S,TRIPATHY B C.Salt and genotype impact on antioxidative enzymes and lipid peroxidation in two rice cultivars during de-etiolation ［J］.Protoplasma,2013,250（1）：209-222.

［30］ GILL S S,ANJUM N A,HASANUZZAMAN M,et al.Glutathione and glutathione reductase：a boon in disguise for plant abiotic stress defense operations ［J］.Plant Physiol Biochem,2013,70（1）：204-212.

［31］ 楊穎麗，馬婷，呂麗榮，等.鹽脅迫對(duì)黃花補(bǔ)血草幼苗葉片抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的影響［J］.西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2016， 52（3）： 84-89.YANG Yingli,MA Ting,Lü Lirong,et al.Effects of salinity stress on ascorbate-glutathione cycle in the leaves of Limonium aureum （L.） Hill seedlings ［J］.J Northwest Norm Univ Nat Sci Ed,2016,52（3）：84-89.

［32］ MOSTOFA M G,HOSSAIN M A,FUJITA M.Trehalose pretreatment induces salt tolerance in rice （Oryza sativa L.）seedlings：oxidative damage and co-induction of antioxidant defense and glyoxalase systems ［J］.Protoplasma,2015,252（2）：461-475.

［33］ 楊衛(wèi)東，李廷強(qiáng)，丁哲利，等.旱柳幼苗抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)及谷胱甘肽代謝對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版）， 2014，40（5）：551-558.YANG Weidong,LI Tingqiang,DING Zheli,et al.Responses of ascorbate-glutathione cycle and glutathione metabolism to cadmium stress in Salix matsudana Koidz seedlings ［J］.J Zhejiang Univ Agric Life Sci,2014,40（5）：551-558.