纖維素降解菌的篩選及酶活力條件優(yōu)化研究

韓耀洋

（成都七中嘉祥外國語學(xué)校，四川 成都 610000）

世界上平均每年大約生成1 000億t植物纖維素物質(zhì)，如秸稈、廢棄纖維產(chǎn)品等，其中僅有一小部分能夠被回收利用，其他絕大多數(shù)都采用焚燒或者填埋等手段進(jìn)行處理，不僅造成資源的浪費(fèi)，還會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生巨大的破壞[1～3]。因此，如何有效地處理這些纖維素廢棄物已經(jīng)成為熱門課題之一。木質(zhì)纖維素降解菌是一類具有高效降解纖維素或堆肥發(fā)酵能力的微生物，具有無污染、成本小、速度快等優(yōu)點(diǎn)，因此篩選出活性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、適用環(huán)境廣的纖維素降解菌是當(dāng)前研究的重難點(diǎn)之一[4～7]。通過對(duì)腐殖土壤中分離篩選的高效纖維素降解菌在不同環(huán)境下的活性情況進(jìn)行研究，旨在通過其在不同溫度、不同pH值條件下的活性，合理優(yōu)化、構(gòu)建高效的纖維素降解菌，為處理纖維素廢棄物提供參考[8，9]。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 菌株材料來源

試驗(yàn)用纖維素降解菌來自實(shí)驗(yàn)室前期篩選的菌株S2，經(jīng)鑒定為木霉菌（Trichoderma sp.）。

1.2 培養(yǎng)基

纖維素剛果紅培養(yǎng)基：稱取羧甲基纖維素鈉 2 g、（NH4）2SO42 g、NaCl 0.5 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、剛果紅0.4 g、瓊脂12 g，加蒸餾水950 mL加熱溶解后，用1 mol/L NaOH或HCl將pH值調(diào)至 7.0，定容至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min后待用。

LB液體培養(yǎng)基：稱取酵母浸粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g，加蒸餾水950 mL加熱溶解后，再用1 mol/L NaOH或HCl將pH值調(diào)至 7.0，定容至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min后待用。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：稱取羧甲基纖維素鈉10 g、 蛋 白 胨 2 g、NaCl 0.5 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、酵母膏0.5 g和瓊脂粉10 g，加蒸餾水950 mL加熱溶解后，用1 mol/L NaOH或HCl將pH值調(diào)至 7.0，定容至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min后待用。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將純化后的纖維素降解菌S2接種到培養(yǎng)基中（每250 mL錐形瓶中裝有100 mL液體培養(yǎng)基），于35℃恒溫?fù)u床中175 rpm/min培養(yǎng)48 h。

1.4 試劑配制

3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取 6.3 g DNS加入262 mL 2 mol/L NaOH溶液（作為A液）中，另稱取182 g酒石酸鉀鈉加入500 mL蒸餾水中，加熱溶解（作為B液）。將A液加入B液后，再加5 g結(jié)晶酚和5 g亞硫酸鈉，完全溶解后定容到1 000 mL，貯存于棕色瓶中保存。

1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取烘干后的葡萄糖1 g，加蒸餾水定容到100 mL。

1.5 酶活力的檢測(cè)

取發(fā)酵培養(yǎng)48 h后的發(fā)酵液，4 000 rpm/min離心10 min后取上清液作為粗制酶液，經(jīng)過試驗(yàn)適量稀釋。取0.5 mL酶液加入試管中，加入1 mL 1%羧甲基纖維素鈉與0.5 mL PBS，于37℃水浴30 min后，加入1 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后加入5 mL蒸餾水，混勻后用分光光度計(jì)在540 nm處檢測(cè)吸光值[10]。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：按表1依次加入各種試劑后，加入0.5 mL滅活后的酶液，其余步驟同上。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

酶活力：即為每毫升酶液在此反應(yīng)條件下1 min內(nèi)使底物降解生成1μmol葡萄糖所需的酶量。

1.6 最適條件的優(yōu)化

最適pH的培養(yǎng)：將S2分別接種到初始pH值為4、5、6、7、8、9、10 的液體培養(yǎng)基中，于 35 ℃恒溫?fù)u床中175 rpm/min培養(yǎng)48 h，檢測(cè)酶活力。

最適培養(yǎng)溫度的檢測(cè)：在最適pH值的情況下，將S2分別在不同溫度下（29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃）恒溫?fù)u床中175 rpm/min培養(yǎng)48 h，檢測(cè)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知不同葡萄糖濃度所對(duì)應(yīng)的吸光值（mg/mL），公式為 y=0.024x+0.006 66(R2=0.993 05)，后續(xù)試驗(yàn)可根據(jù)這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出不同pH值和溫度下的葡萄糖濃度，從而計(jì)算出酶活力。

2.2 不同初始pH值對(duì)S2酶活力的影響

不同初始pH值對(duì)S2酶活力的影響如圖2所示。

圖2 不同初始pH值對(duì)S2酶活力的影響

由圖2可以看出，纖維素降解菌S2在酸性條件下（pH值=4或5）吸光值均小于0.3，酶活力較低；S2吸光值在pH值=6時(shí)吸光值達(dá)到最大值0.64，說明此時(shí)酶活力最高；而隨著初始pH值的增加，吸光值逐步降低，在pH值=10時(shí)吸光值達(dá)到最小值0.12。

2.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)S2酶活力的影響

不同培養(yǎng)溫度對(duì)S2酶活力的影響如圖3所示。

由圖3可以看出，纖維素降解菌S2在較高和較低溫度下吸光值較低，表示酶活力較低；在33℃時(shí)吸光值達(dá)到最大值0.41，說明此時(shí)酶活力最高；隨著培養(yǎng)溫度的增加，吸光值逐步又降低到0.29。說明33℃是S2最佳培養(yǎng)溫度。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)S2酶活力的影響

綜上所述，纖維素降解菌在降解功能的篩選中根據(jù)目的和階段的不同，應(yīng)采用不同的培養(yǎng)基；而不同種屬的微生物特性不同，表現(xiàn)出的酶活力在不同初始pH值和培養(yǎng)溫度下完全不一樣。研究表明，細(xì)菌和真菌對(duì)纖維素的降解機(jī)理存在不同，細(xì)菌主要通過細(xì)胞表面酶進(jìn)行降解，所以需要附著在纖維素表面進(jìn)行；而真菌是直接分泌多種細(xì)胞外酶進(jìn)行降解[11]。在本研究中，木霉菌S2對(duì)纖維素具有較好的降解效果，同時(shí)通過對(duì)其培養(yǎng)條件的優(yōu)化，旨在提高其降解效果[12]。通過試驗(yàn)證明，S2的最佳初始pH值為6，最佳培養(yǎng)溫度為33℃。