生物三維打印技術(shù)在肝組織工程的應(yīng)用與展望

游輔宇 綜述，高 毅 審校

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院肝膽二科，廣東珠江 510282)

肝臟是人體物質(zhì)代謝的中心，具有眾多的功能，糖原存儲(chǔ)、藥物代謝、血清蛋白合成、激素代謝等均在肝臟進(jìn)行。同時(shí)肝臟也是多種致病因素的攻擊靶點(diǎn)，急性肝衰竭、肝硬化等肝臟疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康，肝移植是治療這些疾病的惟一有效方法。然而供體的缺乏及免疫排斥等限制了肝臟移植的臨床應(yīng)用，肝組織工程是解決這一問題的希望[1]。

目前肝組織工程主要有兩種構(gòu)建策略：自上而下和自下而上[2]。自上而下技術(shù)注重對(duì)肝臟宏觀結(jié)構(gòu)及功能的模擬，而難以對(duì)肝臟微觀結(jié)構(gòu)及細(xì)胞微環(huán)境進(jìn)行模擬[3]；后者則注重對(duì)微觀結(jié)構(gòu)的模擬，卻難以規(guī)?；?。生物三維打印(three dimensional printing,TDP)技術(shù)因具備在微觀及宏觀兩種尺度構(gòu)建組織的特點(diǎn)，成為連接微觀與宏觀的希望[4-6]。本文就生物TDP技術(shù)在各尺度肝組織工程的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)，為生物TDP技術(shù)構(gòu)建兼具微觀與宏觀結(jié)構(gòu)及功能的肝組織提供參考。

1 生物TDP技術(shù)概述

生物TDP技術(shù)是以生物材料、細(xì)胞及生物學(xué)分子等為材料，通過逐層堆積精確構(gòu)建具有一定空間結(jié)構(gòu)和一定生物學(xué)功能組織的技術(shù)，是快速成型技術(shù)和增材制造技術(shù)的一種[7-8]。生物TDP能夠極大地提高細(xì)胞、生物材料和生物活性分子空間分布的精確性，精確控制體外模型的結(jié)構(gòu)。這一特性使其在構(gòu)建體外組織模型及組織工程受到越來越多的關(guān)注。

目前常用的生物TDP技術(shù)主要分為3種：噴墨式生物TDP、激光生物TDP、微擠出式生物TDP[7,9-10]。噴墨式生物TDP機(jī)及激光生物TDP機(jī)均能夠在微觀層次實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞及其微環(huán)境的操控；而微擠出式生物TDP機(jī)具備在宏觀層面對(duì)大量肝細(xì)胞進(jìn)行排布的能力。

2 生物TDP技術(shù)在微觀尺度構(gòu)建肝組織

噴墨生物TDP機(jī)通過熱能或聲壓控制一定體積的含細(xì)胞液滴分布到預(yù)設(shè)位置實(shí)現(xiàn)TDP，是最常用的打印機(jī)類型，具有價(jià)格低、高分辨率、打印速度快、能夠兼容多種生物材料、打印精度可調(diào)等眾多優(yōu)點(diǎn)[7]。2013年MATSUSAKI等[11]利用噴墨生物TDP機(jī)在單細(xì)胞層次實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行打?。怀晒?gòu)建了具有多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的肝組織芯片。檢測(cè)肝細(xì)胞功能顯示，相較于簡(jiǎn)單的三維培養(yǎng)、三明治培養(yǎng)，具備此種精確結(jié)構(gòu)的肝組織芯片具有更好的清蛋白分泌、細(xì)胞色素酶 P450(CYP450)同工酶誘導(dǎo)與代謝功能。Organovo公司利用自主研發(fā)的TDP機(jī)構(gòu)建出類似肝小葉結(jié)構(gòu)，具有良好的CYP酶活力的微肝組織[12-13]。

激光生物TDP機(jī)基于激光介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的原理，利用激光使黏附在平板上特定位置的細(xì)胞脫落，從而構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)。其具有打印精度高(可精確至單個(gè)細(xì)胞)，細(xì)胞活力高(達(dá)95%)、對(duì)細(xì)胞損害小、細(xì)胞打印密度高等優(yōu)點(diǎn)。2016年MA等[14]利用激光生物TDP機(jī)成功打印具有肝小葉結(jié)構(gòu)的肝組織模型，此組織中細(xì)胞具有良好的形態(tài)學(xué)特征，肝組織的分泌及代謝功能均得到了良好的表達(dá)?？梢?，生物TDP技術(shù)能夠在微觀層次，以細(xì)胞為“磚塊”進(jìn)行三維搭建，精確化、標(biāo)準(zhǔn)化的定義細(xì)胞位置及其微環(huán)境，從而構(gòu)建具有良好功能的微肝組織。

3 生物TDP技術(shù)在宏觀尺度構(gòu)建肝組織

微擠出式生物TDP機(jī)通過氣壓、活塞、螺旋等方式將液體或凝膠狀生物墨水連續(xù)擠出從而構(gòu)建三維模型[7]。適用于微擠出的生物TDP機(jī)材料包括水凝膠、具有生物相容性的聚合物材料，細(xì)胞球等。此種生物TDP機(jī)可兼容較高的細(xì)胞密度，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)大量細(xì)胞的宏觀排布，在組織工程規(guī)?；矫婢哂泻艽蟮膬?yōu)勢(shì)[7]。WANG等[15]利用微擠出式生物TDP技術(shù)打印細(xì)胞凝膠混合物構(gòu)建具有多層空間結(jié)構(gòu)的肝組織，此組織細(xì)胞能夠保持至少2個(gè)月的活力及功能，表明其具備規(guī)?；瘶?gòu)建人工肝組織的可能。此后多個(gè)研究利用擠出式生物TDP機(jī)進(jìn)行肝組織打印，且構(gòu)建的肝組織具有良好的功能[3,6,16-18]。2017年JEON等[19]利用微擠出式生物TDP技術(shù)構(gòu)建的肝組織塊細(xì)胞數(shù)量可達(dá)到1×107/mL水平，接近體內(nèi)組織細(xì)胞數(shù)量級(jí)水平。此外有研究將擠出式生物TDP機(jī)構(gòu)建的肝組織塊移植入肝損傷模型小鼠體內(nèi)，肝組織表現(xiàn)出更好的活力及功能[20]。綜上所述，擠出式生物TDP機(jī)具有規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化的構(gòu)建出可用于移植的人工肝組織的可能。

4 生物TDP技術(shù)連接宏觀與微觀的橋梁

模塊化構(gòu)建肝組織工程技術(shù)便是基于生物TDP技術(shù)特性所提出的一種新型組織工程策略[21]。這種策略的基本方法為大規(guī)模構(gòu)建組織器官的基本功能/結(jié)構(gòu)單元，而后對(duì)這些基本單元為模塊進(jìn)行仿生組裝，從而得到兼具微觀與宏觀結(jié)構(gòu)功能的組織[21]。生物TDP技術(shù)因其在微觀和宏觀層次均能夠規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化精確構(gòu)建具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的組織而成為此種策略的重要工具，成為連接微觀與宏觀之間的橋梁。

2017年YANAGI等[22]提出了一種利用生物TDP技術(shù)將肝芽樣細(xì)胞球組裝為宏觀肝組織的方法；作者首先大規(guī)模構(gòu)建由肝細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合組成的肝芽樣細(xì)胞球(直徑500～600 μm)；以細(xì)胞球?yàn)榛灸K進(jìn)行打印組裝從而構(gòu)建規(guī)?；母谓M織。構(gòu)建的肝組織具備體外自我修重能力，并有向肝組織結(jié)構(gòu)方向演化的可能。將構(gòu)建的肝組織移植入小鼠體內(nèi)后檢測(cè)到組織具備清蛋白分泌功能及CYP酶活性；并具有再發(fā)生成膽小管的可能。目前利用TDP技術(shù)連接微觀與宏觀構(gòu)建肝組織的文獻(xiàn)報(bào)道較少，然而仍可看出生物TDP技術(shù)相較于傳統(tǒng)組織工程技術(shù)，其具備成為連接微觀與宏觀橋梁的可能性，是肝組織工程重要的技術(shù)方法。

5 生物TDP技術(shù)在構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)中的應(yīng)用

血管化是限制宏觀組織構(gòu)建的重要因素[23]。合理的血管分布是保證人工組織能夠獲取足夠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、排出廢物、存活并表達(dá)相應(yīng)功能的重要保證[24]。近年來生物TDP技術(shù)已經(jīng)被用于構(gòu)建內(nèi)皮化、可灌注的三維血管網(wǎng)絡(luò)。MILLER等[25]利用TDP技術(shù)將直徑為200 μm的糖玻璃網(wǎng)絡(luò)打印在包埋有小鼠原代肝細(xì)胞的凝膠組織中，而后將糖玻璃溶解并內(nèi)襯于內(nèi)皮細(xì)胞從而成功構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)。2017年MASSA等[26]結(jié)合水凝膠支架、生物TDP技術(shù)及微流控技術(shù)構(gòu)建了一種含血管的肝組織芯片，利用肝組織芯片進(jìn)行藥物篩選表明含有人工血管的組織具有更接近體內(nèi)的性質(zhì)。目前利用生物TDP技術(shù)構(gòu)建肝組織血管網(wǎng)絡(luò)的報(bào)道較少，但可看出生物TDP技術(shù)具備構(gòu)建具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的血管網(wǎng)絡(luò)的能力與前景。

6 生物TDP肝組織動(dòng)物體內(nèi)移植

目前生物TDP技術(shù)構(gòu)建的宏觀肝組織塊只進(jìn)行了少量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。由于對(duì)微觀結(jié)構(gòu)、宏觀組織、血管網(wǎng)絡(luò)三者現(xiàn)階段無法進(jìn)行良好的整合，在移植進(jìn)行過程中無法實(shí)現(xiàn)有效的血管吻合。因此，目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所采用的主要移植方式是將打印的肝組織塊種植于小鼠肝臟表面或大網(wǎng)膜中。2017年KANG等[20]將生物TDP的肝組織塊植入肝損傷小鼠網(wǎng)膜之中，結(jié)果表明，與體外比較，植入小鼠體內(nèi)的肝組織表現(xiàn)出更好的功能。盡管生物TDP肝組織技術(shù)仍不成熟，然而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明了其應(yīng)用于移植的可能。

7 展 望

生物TDP技術(shù)仍然處于其發(fā)展的初期[7]。盡管其在各尺度的肝組織工程均表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，然而利用生物TDP技術(shù)消除微觀與宏觀的鴻溝，構(gòu)建具有功能并可用于移植的肝組織仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。當(dāng)前限制生物TDP肝組織面臨的挑戰(zhàn)主要集中在3個(gè)方面：打印技術(shù)、生物材料與種子細(xì)胞、打印策略。

微觀肝組織的構(gòu)建需要在打印精度、打印速度、細(xì)胞活力三者間尋找合適的平衡；在快速構(gòu)建微肝組織的同時(shí)需具備足夠精度及保證較高細(xì)胞活力，才可為宏觀構(gòu)建肝組織提供足夠可用的微模塊。而宏觀組織同樣具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。目前的生物TDP技術(shù)均難以同時(shí)在多方面滿足構(gòu)建需求；由此研發(fā)新的、具備平衡上述各種要求能力的打印機(jī)是促進(jìn)生物TDP技術(shù)的重要方面。生物TDP技術(shù)是對(duì)種子細(xì)胞及生物材料的有序組裝過程。種子細(xì)胞是決定TDP肝組織功能的基石，目前用于打印的細(xì)胞有腫瘤細(xì)胞系、原代細(xì)胞、干細(xì)胞等，這些細(xì)胞有著各自的特點(diǎn)與缺陷；近年來干細(xì)胞因具有分化為不同特定功能細(xì)胞的特性，是近年來最受關(guān)注的細(xì)胞來源之一。特別是誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞能夠從患者組織中獲取細(xì)胞，經(jīng)過重新編程獲得，解決了來源的限制；且由于與患者細(xì)胞同源，不存在免疫排斥的問題。TDP技術(shù)生物材料的物理化學(xué)性質(zhì)在很大程度上限制了生物TDP方法選擇，間接限制了打印的速度、精度等。同時(shí)良好的生物材料具備保護(hù)種子細(xì)胞，促進(jìn)種子細(xì)胞功能表達(dá)與維持等重要作用。

目前生物TDP技術(shù)規(guī)?；瘶?gòu)建策略單一，可選擇的生物TDP機(jī)及兼容的打印微肝組織模塊少。研制可兼容微肝組織模塊及血管網(wǎng)絡(luò)的新型打印機(jī)，制訂合理的、標(biāo)準(zhǔn)化的構(gòu)建策略是當(dāng)前的重要方向。盡管生物TDP技術(shù)仍然存在著許多不足，但隨著技術(shù)的發(fā)展，生物TDP技術(shù)在空間與時(shí)間精度上的提升，生物材料及種子細(xì)胞的優(yōu)化，生物TDP技術(shù)將成為有效、可靠、快速的肝組織構(gòu)建方法。