重組慢病毒攜帶酪氨酸羥化酶對(duì)大鼠帕金森病模型的干預(yù)研究

董小林，戰(zhàn)麗萍，鄔剛，李青蕓，魏歡，李建輝，李妍平

本研究背景和創(chuàng)新點(diǎn)：

帕金森病是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，病因是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡缺失，多巴胺合成減少是導(dǎo)致其震顫和運(yùn)動(dòng)障礙的主要原因，酪氨酸羥化酶（TH）是多巴胺能神經(jīng)元的主要分子標(biāo)記和功能分子。機(jī)體利用左旋酪氨酸（L-tyrosine），在TH的催化下生成左旋多巴，左旋多巴在芳香族脫羧酶的催化下脫去羧基最后生成左旋多巴胺。本研究分離、培養(yǎng)胎鼠原代神經(jīng)元，采過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）從多巴胺能神經(jīng)元中克隆大鼠TH（rTH） cDNA，將該片段包裝到重組慢病毒中。將Lv-rTH重組慢病毒感染大鼠成纖維細(xì)胞REF，體外檢測(cè)表明Lv-rTH重組慢病毒能在體外成功和高效地表達(dá)rTH。通過腦內(nèi)立體定位注射6羥多巴胺（6-OHDA）的方法建立了大鼠帕金森病模型，建模后進(jìn)行基因治療，給予Lv-rTH重組慢病毒腦內(nèi)注射，通過阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，免疫組化進(jìn)行神經(jīng)元恢復(fù)評(píng)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Lv-rTH重組慢病毒能顯著減少由阿撲嗎啡誘導(dǎo)的自體旋轉(zhuǎn)且能上調(diào)大鼠帕金森病模型TH表達(dá)陽性細(xì)胞所占比例。

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，患者的主要臨床表現(xiàn)為：運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直、靜止性震顫、姿勢(shì)步態(tài)異常等［1-2］。已有研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素和多種殺蟲劑是PD的重要危險(xiǎn)因素［3］。PD的病理特征主要是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少和壞死。多巴胺能神經(jīng)元主要是一類能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)元，能將神經(jīng)沖動(dòng)信號(hào)傳遞至紋狀體，而紋狀體主要控制骨骼肌的運(yùn)動(dòng)，因此多巴胺合成的減少導(dǎo)致了機(jī)體的運(yùn)動(dòng)障礙。基于該病理基礎(chǔ)，PD患者的治療主要通過維持紋狀體內(nèi)多巴胺和乙酰膽堿兩種遞質(zhì)的平衡，使臨床癥狀得以改善。左旋多巴最早用于治療PD，該藥物在治療早期病情緩解效果較好，但是隨著治療“蜜月期”的結(jié)束，左旋多巴會(huì)導(dǎo)致多種運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥［4］。而多巴胺激動(dòng)劑類藥物雖能一定程度緩解癥狀，但長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致消化道反應(yīng)和精神癥狀等不良反應(yīng)［5］。手術(shù)治療雖能改善癥狀，但不能根治疾病，術(shù)后仍需應(yīng)用藥物治療，也可能帶來相關(guān)并發(fā)癥，如舌頭和手的麻痹、辨距不清和意識(shí)不清等癥狀［6］，也存在一定局限性。

基因治療主要是將相關(guān)基因通過載體導(dǎo)入病灶部位，對(duì)靶點(diǎn)區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)、補(bǔ)償和校正，以恢復(fù)相關(guān)區(qū)域正常生理功能，基因治療主要適用于病灶區(qū)域單一和明確的疾病。國(guó)外有研究報(bào)道利用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)PD進(jìn)行基因治療，主要是通過導(dǎo)入神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子〔包括膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）、Neurturin和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）〕促進(jìn)和保護(hù)相關(guān)神經(jīng)元的存活［7］。但是，多數(shù)PD患者發(fā)病時(shí)大量的多巴胺神經(jīng)元丟失，因此，提升患者相關(guān)神經(jīng)核團(tuán)對(duì)多巴胺的合成可能是治療該疾病的關(guān)鍵。酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）表達(dá)于多巴胺能神經(jīng)元，是該類神經(jīng)元分子標(biāo)志物。TH是催化左旋多巴產(chǎn)生的加氧酶，是多巴胺合成中的關(guān)鍵限速酶［8］。慢病毒載體是一種廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)和基因治療的缺陷型載體，相比于其他載體，慢病毒載體具有能在機(jī)體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)、較低的免疫性和外源基因容量大的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于心血管疾病、腫瘤和自身免疫疾病的治療［9］。為了探索和評(píng)估利用TH作為PD基因治療的評(píng)價(jià)效果，本研究克隆了大鼠TH基因（rTH基因），構(gòu)建了攜帶rTH的慢病毒載體，并利用該載體對(duì)大鼠PD模型進(jìn)行基因治療，為PD基因治療提供新思路，為臨床研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 慢病毒載體LvX、pHelper和大腸埃希菌DH5α由本研究室保存，大鼠成纖維細(xì)胞REF和293T細(xì)胞由本研究室保存。限制性內(nèi)切酶NotI、BamHI、PrimeStar HS DNA Polymerase 和 T4 DNA Ligase購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。上游引物P1：5'-GCGGCCGC ACCATGCCCACCCCCAGCGCC-3'和 下 游 引 物 P2：5'-GGGGATCCTTAGCTAATGGCACTCAG-3'由北京六合華大基因科技有限公司合成。Anti-TH antibody（AF7566）和BDNF購(gòu)自R&D Systems。Western Chemiluminescent HRP底物和HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自Merck Millipore公司。Opti-MEM、Lipofectamine 2000、DMEM 高 糖、Neural Basal培 養(yǎng) 基、B27 Serum Free Supplement和 胎 牛 血清（FBS）等購(gòu)自ThermoFisher公司。成年Sprague-Dawley大鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。6羥多巴胺（6-OHDA）和阿撲嗎啡（apomorphine）購(gòu)自Sigma Aldrich。

1.2 方法

1.2.1 胎鼠原代神經(jīng)元的分離、培養(yǎng)和鑒定 2014年11月—2015年12月，取雌性和雄性Sprague-Dawley大鼠各10只，按照2∶1進(jìn)行合籠過夜飼養(yǎng)。第2天分籠飼養(yǎng)，記錄時(shí)間，動(dòng)態(tài)檢測(cè)雌性大鼠體質(zhì)量以確定雌性大鼠妊娠天數(shù)。準(zhǔn)確選取妊娠14 d雌性大鼠1只，處死后取出子宮。在預(yù)冷的Hank's平衡鹽溶液（HBSS）無菌培養(yǎng)皿中分離胎鼠大腦，從中腦腹側(cè)處取神經(jīng)組織，剪碎。將神經(jīng)組織平鋪于多聚賴氨酸包被的6孔板中，37 ℃，5% CO2孵育30 min。加入B27培養(yǎng)液〔Neural Basal，2% B27 Serum Free Supplement，1% 雙 抗，5%FBS和10 ng/ml BDNF〕，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，每3 d半量換液，于14 d得到大鼠原代神經(jīng)元，對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行鑒定。采用免疫組化法將大鼠原代神經(jīng)元用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，加入固定和透化液（2%多聚甲醛，0.2% Triton X-100，PBS pH=7.4）處理15 min；加入丙酮和甲醇混合物（7∶3），-20 ℃處理10 min。細(xì)胞固定和破膜后，用PBS洗滌3次。加入封閉液〔5%牛血清清蛋白（BSA）/0.05% Tween-20，PBS pH=7.4〕封閉30 min。封閉結(jié)束后加入封閉液稀釋的一抗，工作濃度為1 μg/ml，結(jié)合2 h，PBST洗滌3次，加入二抗（1∶1 000）孵育60 min，PBST洗滌3次后加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。

1.2.2 rTH基因的克隆 取1×106個(gè)胎鼠原代神經(jīng)元，利用Qiagen RNeasy Mini Kit提取細(xì)胞總RNA。檢測(cè)RNA純度和濃度后進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄。取500 ng細(xì)胞總RNA，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。取模板cDNA，以rTH擴(kuò)增上下游引物，利用PrimeStar HS DNA Polymerase擴(kuò)增rTH基因。反應(yīng)體系為：5×PrimeSTAR Buffer 10 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μl，上、下游引物各10 pmol，cDNA 1 μl，Polymerase 0.5 μl，總體積 50 μl。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性 2 min；98 ℃變性 10 s，55 ℃復(fù)性 15 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min，16℃保存。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 Lv-rTH重組慢病毒的包裝 將rTH PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，純化產(chǎn)物和LvX載體進(jìn)行NotI和BamHI雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)過膠回收純化后用T4 DNA Ligase 16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。Lv-rTH重組質(zhì)粒通過酶切進(jìn)行鑒定。對(duì)Lv-rTH和pHelper質(zhì)粒進(jìn)行大量擴(kuò)增。使用Qiagen去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，測(cè)濃度后備用。復(fù)蘇293T細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至0.5×106cells/ml，接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)12 h。次日細(xì)胞密度達(dá)到70%融合度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用Opti-MEM培養(yǎng)液對(duì)293T細(xì)胞洗滌3次。取15 ml離心管，加入40 μg Lv-rTH和30 μg pHelper載體混合。加入Opti-MEM培養(yǎng)液至2.5 ml，孵育5 min。取200 μl Lipofectamine 2000，加入2.3 ml Opti-MEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。將載體混合液與脂質(zhì)體稀釋液進(jìn)行混合，室溫孵育20 min。將DNA與Lipofectamine 2000混合液均勻滴加至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，十字混勻后放置37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)過夜后換新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。收集上清液，4 ℃，4 000×g離心10 min。上清液使用0.45 μm濾器過濾，過濾上清液進(jìn)行濃縮和純化，最后測(cè)定滴度進(jìn)行保存。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）、免疫熒光實(shí)驗(yàn)和Western blotting法檢測(cè)大鼠成纖維細(xì)胞REF中rTH基因表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠成纖維細(xì)胞REF，以5×106/ml密度接種至6孔板，37 ℃5% CO2過夜培養(yǎng)。次日，以MOI=100的感染復(fù)數(shù)接種Lv-rTH重組慢病毒，以未攜帶基因的慢病毒Lv-NC為對(duì)照。加入終濃度5 μg/ml Polybrene增強(qiáng)感染，感染24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、免疫熒光實(shí)驗(yàn)和Western blotting檢測(cè)。RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參見1.2.2。免疫熒光實(shí)驗(yàn)二抗采用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記，采用封閉液稀釋（1∶250），37 ℃孵育60 min。PBST洗滌4次后熒光顯微鏡下觀察。Western blotting法檢測(cè)選取大鼠原代神經(jīng)元、接種Lv-rTH重組慢病毒、Lv-NC大鼠成纖維細(xì)胞REF，每種細(xì)胞取5×106個(gè)，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解。利用BCA法測(cè)定細(xì)胞裂解物蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度一致。10%十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白電轉(zhuǎn)至甲醇激活的聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。轉(zhuǎn)膜后將膜用PBS洗滌3次，5%脫脂奶4 ℃封閉過夜。加入anti-TH一抗，同時(shí)以anti β-actin抗體為內(nèi)參對(duì)照，濃度分別為0.5 μg/ml和0.1 μg/ml，PBST洗滌3次后加入二抗進(jìn)行孵育（1∶5 000）。PBST洗滌4次后加入Chemiluminescent HRP底物，暗室曝光顯影。

1.2.5 PD建模和基因治療 PD建模和基因治療分為對(duì)照組、Lv-NC治療組和Lv-rTH治療組，每組入選7只成年雌性Sprague-Dawley大鼠。采用腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg進(jìn)行麻醉，麻醉后，將大鼠固定于立體定位注射儀，雙耳固定耳桿并調(diào)節(jié)至相同刻度，固定鼻托。頭部備皮，消毒后切開暴露顱骨。Lv-NC治療組和Lv-rTH治療組大鼠右側(cè)紋狀體注射6-OHDA 20 μg，損毀多巴胺能神經(jīng)元，完成PD建模，注射坐標(biāo)：前囟=-1.0 mm，右側(cè)水平偏移=3.5 mm，深度=5.5 mm，緩慢注射、緩慢退針，注射后縫合大鼠頭皮；對(duì)照組大鼠注射等量0.9%氯化鈉溶液。造模14 d后評(píng)估和再次注射病毒進(jìn)行基因治療。每只大鼠注射損毀側(cè)紋狀體和黑質(zhì)2個(gè)點(diǎn)。紋狀體注射坐標(biāo)：前囟=0.8 mm，右側(cè)水平偏移=3.5 mm，深度=5.5 mm；黑質(zhì)核團(tuán)注射坐標(biāo)：前囟=5.5 mm，右側(cè)水平偏移=2.4 mm，深度=7.5 mm（見圖1）。每只大鼠每個(gè)點(diǎn)注射病毒1×109TU/ml，共注射 5 μl。

1.2.6 阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和免疫組化實(shí)驗(yàn) LvrTH重組慢病毒對(duì)大鼠基因治療的療效主要通過行為學(xué)和組織學(xué)進(jìn)行評(píng)估。注射Lv-rTH重組慢病毒前1周開始對(duì)大鼠進(jìn)行PD癥狀的行為學(xué)評(píng)估，主要通過肌肉注射阿撲嗎啡2.5 mg/kg進(jìn)行。肌肉注射后觀察每只大鼠60 min內(nèi)自發(fā)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，計(jì)算每分鐘自發(fā)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)進(jìn)行評(píng)估。行為學(xué)觀察進(jìn)行11周后處死大鼠。取出腦組織，采用10%甲醛溶液固定，固定后進(jìn)行脫水、透明和石蠟包埋，切片后進(jìn)行免疫組化，脫蠟、脫二甲苯，Tris-EDTA緩沖液抗原煮沸修復(fù)，修復(fù)后采用3%過氧化氫處理、封閉和一抗孵育。孵育結(jié)束后洗片4～5次，加入酶標(biāo)二抗進(jìn)行孵育，最后洗滌5～6次后加入DAB顯色。采用Image J圖形分析軟件計(jì)算大鼠中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元所占比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎鼠原代神經(jīng)元的培養(yǎng)和鑒定 選取胎鼠中腦原代神經(jīng)元（見圖2、3），免疫組化法檢測(cè)顯示，所獲得神經(jīng)元能表達(dá)TH（見圖4）。

2.2 rTH基因的克隆和Lv-rTH重組慢病毒的包裝RT-PCR檢測(cè)顯示得到分子量約為1 500 bp的特異擴(kuò)增基因片段（見圖5）?；驕y(cè)序結(jié)果與GeneBank中NM_012740.3所公布序列完全一致（見圖6）。

2.3 Lv-rTH重組慢病毒體外表達(dá)檢測(cè) RT-PCR檢測(cè)顯示rTH基因在大鼠成纖維細(xì)胞REF的轉(zhuǎn)錄（見圖7）。免疫熒光檢測(cè)顯示接種Lv-rTH重組慢病毒的大鼠成纖維細(xì)胞REF中有rTH基因表達(dá)，未攜帶基因的慢病毒Lv-NC的大鼠成纖維細(xì)胞REF中無熒光信號(hào)（見圖8）。Western blotting法檢測(cè)顯示接種Lv-rTH重組慢病毒的大鼠成纖維細(xì)胞REF中表達(dá)分子量約為60 kD的蛋白（見圖9）。

2.4 3組大鼠不同時(shí)間自發(fā)旋轉(zhuǎn)速率比較 3組大鼠治療前1周自發(fā)旋轉(zhuǎn)速率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3 組大鼠治療 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周自發(fā)旋轉(zhuǎn)速率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中治療 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周，Lv-NC治療組和Lv-rTH治療組大鼠自發(fā)旋轉(zhuǎn)速率較對(duì)照組增快，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療2、3、5、6、8、9、10周，Lv-rTH治療組大鼠自發(fā)旋轉(zhuǎn)速率較Lv-NC治療組減慢，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

圖1 大鼠紋狀體和黑質(zhì)腦內(nèi)立體定位注射坐標(biāo)Figure 1 Stereotactic coordinates of rat striatum and substantial nigra

圖2 分離胎鼠中腦原代神經(jīng)元Figure 2 Isolation of primary fetal rat neurons

圖3 胎鼠中腦原代神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)（×200）Figure 3 Morphology of primary rat neurons

圖4 免疫組化法檢測(cè)胎鼠中腦原代神經(jīng)元TH表達(dá)（×400）Figure 4 Detection of TH expression in primary rat neurons by immunohistochemistry

圖5 RT-PCR檢測(cè)rTH基因Figure 5 Detection of rTH gene by RT-PCR

圖6 Lv-rTH重組慢病毒包裝圖Figure 6 Lv-rTH recombinant lentivirus vector packaging

圖7 RT-PCR檢測(cè)rTH基因在大鼠成纖維細(xì)胞REF中的表達(dá)Figure 7 Expression of rTH gene in rat fibroblasts REF detected by RT-PCR

2.5 3組大鼠中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元所占比例 免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示與Lv-NC治療組大鼠中腦黑質(zhì)相比，LvrTH治療組大鼠經(jīng)過治療后向正常大鼠中腦恢復(fù)（見圖10）。3組大鼠中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元所占比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中Lv-NC治療組和Lv-rTH治療組大鼠中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元所占比例較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Lv-rTH治療組大鼠中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元所占比例較Lv-NC治療組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

圖8 免疫組化檢測(cè)rTH基因在大鼠成纖維細(xì)胞REF中的表達(dá)（×200）Figure 8 Expression of rTH gene in REF detected by immunohistochemistry

圖9 Western blotting檢測(cè)rTH基因在大鼠成纖維細(xì)胞REF中的表達(dá)Figure 9 Expression of rTH gene in REF detected by Western blotting

表2 3組大鼠中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元所占比例比較（x±s，%）Table 2 Comparitson of the proportions of TH-positive neurons in the substantial nigra between the three groups

表1 3組大鼠不同時(shí)間自發(fā)旋轉(zhuǎn)速率比較（x±s，r/min）Table 1 Comparison of the spontaneous rotation rates of the rats in three groups at different time points

圖10 免疫組化檢測(cè)大鼠中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元（×200）Figure 10 TH-positive neurons in the substantial nigra detected by immunohistochemistry

3 討論

本研究體外分離、培養(yǎng)了胎鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元，免疫組化染色發(fā)現(xiàn)TH呈陽性表達(dá)，證明實(shí)驗(yàn)所分離和培養(yǎng)的神經(jīng)元為多巴胺能神經(jīng)元，通過RT-PCR從多巴胺能神經(jīng)元中成功克隆了約為1 500 bp的cDNA片段，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，該片段與理論片段序列完全一致，證明所獲得的基因?yàn)閞TH。將該rTH cDNA片段包裝到慢病毒中，并感染大鼠成纖維細(xì)胞REF，體外通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、免疫熒光實(shí)驗(yàn)和Western blotting法證明所包裝的rTH重組慢病毒能在體外成功和高效地表達(dá)rTH。通過腦內(nèi)立體定位注射6-OHDA的方法建立了大鼠PD模型，建模2周后，給予大鼠腦內(nèi)注射Lv-rTH重組慢病毒、未攜帶基因的慢病毒Lv-NC及0.9%氯化鈉溶液。通過阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，免疫組化進(jìn)行神經(jīng)元恢復(fù)評(píng)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Lv-rTH重組慢病毒能顯著減少由阿撲嗎啡誘導(dǎo)的自發(fā)旋轉(zhuǎn)速率，免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Lv-rTH能上調(diào)大鼠PD模型中腦黑質(zhì)TH表達(dá)陽性神經(jīng)元所占比例。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)PD的基因治療主要使用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF、Neurturin和BDNF）。研究報(bào)道通過基因載體或者重組蛋白遞送至模型后相關(guān)核團(tuán)能保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，抵抗造模藥物6-OHDA和MTPT的神經(jīng)損傷作用［9-11］。美國(guó)Ceregen公司研發(fā)了攜帶Neurturin基因的重組腺相關(guān)病毒，并對(duì)其臨床療效進(jìn)行了測(cè)試，表明患者在接受基因治療后，PD癥狀確實(shí)有明顯改善，但是正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像（PET-CT）掃描表明患者的紋狀體核團(tuán)對(duì)左旋多巴的利用沒有明顯上升［10，12］。

通過慢病毒作為載體遞送TH對(duì)PD進(jìn)行基因治療的機(jī)制是：TH是催化多巴胺合成的關(guān)鍵酶［13］。TH是一種單加氧酶，其是催化生物體自身合成左旋多巴胺系列反應(yīng)的第一步反應(yīng)的限速酶，機(jī)體利用左旋酪氨酸（L-tyrosine），在TH的催化下生成左旋多巴，左旋多巴在芳香族脫羧酶的催化下脫去羧基最后生成左旋多巴胺。本研究在動(dòng)物模型上證實(shí)了通過重組慢病毒在與多巴胺合成相關(guān)的神經(jīng)核團(tuán)中過表達(dá)rTH基因，促進(jìn)核團(tuán)多巴胺的合成，能改善動(dòng)物模型的PD癥狀，降低了阿撲嗎啡誘導(dǎo)的自發(fā)旋轉(zhuǎn)。同時(shí)，免疫組化證實(shí)多巴胺合成相關(guān)核團(tuán)TH的表達(dá)增強(qiáng)。

流行病學(xué)調(diào)查報(bào)道：全球PD在65～69歲中患病率為0.6%，80歲及以上患病率為4%；中國(guó)65歲及以上PD的患病率為2.06%，男性高于女性［14］。據(jù)估算我國(guó)大約有200萬PD患者，每年新發(fā)病例約10萬人。我國(guó)已進(jìn)入人口老齡化社會(huì)，PD已成為僅次于糖尿病和心血管疾病的影響我國(guó)人口健康的重大疾病?？诜笮喟褪窃缙谥委烶D的理想藥物，能顯著緩解PD癥狀，但是長(zhǎng)期使用左旋多巴可能帶來癥狀波動(dòng)和異動(dòng)癥，這種癥狀波動(dòng)和異動(dòng)癥有可能對(duì)患者造成更為嚴(yán)重的損傷。外科手術(shù)治療法主要分為神經(jīng)核團(tuán)損毀術(shù)、腦深部電刺激術(shù)和神經(jīng)組織移植術(shù)3種，丘腦損毀術(shù)會(huì)導(dǎo)致舌與手的麻木、辨距不良和意識(shí)混亂，蒼白球損毀術(shù)術(shù)后會(huì)導(dǎo)致視野缺損和偏癱［15-16］。腦深部電刺激有導(dǎo)致顱內(nèi)出血的風(fēng)險(xiǎn)，與刺激有關(guān)的不良反應(yīng)有對(duì)側(cè)肢體抽搐、麻木、眼球凝視等癥狀［17］。神經(jīng)組織移植治療由于使用人類胚胎組織，存在倫理學(xué)方面的問題。

慢病毒載體已經(jīng)發(fā)展到產(chǎn)業(yè)化階段，國(guó)內(nèi)已有專業(yè)開展慢病毒制備的公司和成熟的病毒制備、濃縮和純化工藝，制備成本較低；慢病毒已被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤CAR-T細(xì)胞的制備等，具有一定的安全性［18］。因此使用慢病毒作為基因治療載體具有較好的產(chǎn)業(yè)化基礎(chǔ)。其次，慢病毒系統(tǒng)較好地滿足了人類疾病基因治療的要求：能感染大部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞；可插入較大的外源基因；能夠整合，且持續(xù)和穩(wěn)定的表達(dá)。其他病毒載體主要包括：腺病毒系統(tǒng)和腺相關(guān)病毒系統(tǒng)。腺病毒系統(tǒng)由于屬于瞬時(shí)表達(dá)載體，且免疫原性加大，通常不適宜用于基因治療。腺相關(guān)病毒具有較低的免疫原性，且能持續(xù)表達(dá)，但是由于其基因組限制，只能容納3 kb的外源基因片段。

綜上所述，本研究通過重組慢病毒載體在目標(biāo)核團(tuán)過表達(dá)rTH基因，該方案能快速增強(qiáng)多巴胺的合成，緩解模型動(dòng)物PD癥狀，同時(shí)上調(diào)大腦黑質(zhì)TH表達(dá)陽性神經(jīng)元所占比例。盡管如此，該方法不能再生多巴胺能神經(jīng)元。因此，利用胚胎干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化潛能，同時(shí)通過慢病毒載體遞送相關(guān)誘導(dǎo)基因的表達(dá)，促進(jìn)目標(biāo)核團(tuán)的神經(jīng)元再生可能是今后PD基因治療努力的方向。

作者貢獻(xiàn)：戰(zhàn)麗萍進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，論文的修訂；董小林進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，撰寫論文；鄔剛進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；魏歡進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；李青蕓進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；李建輝進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；李妍平負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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