苦參堿對大鼠肝缺血再灌注損傷的抑制作用及機制

白寧，王棟，歐陽錫武，周樂杜，王志明

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1. 急診科 2. 普通外科，湖南 長沙 410008）

在大多數(shù)肝臟手術(shù)中，如肝移植，規(guī)則肝葉切除等，需分次分段阻斷肝臟血流控制術(shù)中出血，以達到減少出血，同時減少其潛在的副損傷的目的。但該過程可造成肝臟的缺血再灌注損傷，引起肝細胞功能失調(diào)[1-2]。大量研究[3-5]表明，肝缺血再灌注損傷常造成肝竇內(nèi)細胞損傷，從而誘導(dǎo)活性氧自由基富集，釋放促炎癥反應(yīng)細胞因子，引起肝細胞壞死，也會引起肝細胞凋亡及自噬，表現(xiàn)出肝功能異常[6]。因此肝缺血再灌注損傷的防治一直是肝臟外科的重要研究領(lǐng)域。已有研究[7]證實中藥單體苦參堿（Sophocarpidine，matrine）具有抗炎、抗氧化、保肝等作用，對缺血再灌注損傷引起的炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、自噬及抗癌等可能有重要的調(diào)節(jié)作用[8-9]。另有研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，苦參堿對肝缺血再灌注損傷引起的炎癥反應(yīng)、肝纖維化及肝細胞異常凋亡具有明顯的抑制作用。但苦參堿抑制肝缺血再灌注損傷的機制尚未完全闡明。本研究在建立大鼠肝缺血再灌注損傷模型的基礎(chǔ)上，觀察苦參堿對肝臟缺血再灌注后的保護作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康成年雄性SD大鼠，清潔級，40只，9～12周齡，體質(zhì)量200～250 g，由中南大學(xué)實驗動物學(xué)部提供?？鄥A（M5319）購于美國Sigma公司。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒和IL-1β ELISA試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；TUNEL染色試劑盒由美國Promega公司生產(chǎn)；腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）、BAX、激活型caspase-3（cleaved caspase-3，Asp175）及內(nèi)參β-actin單克隆抗體均為英國Abcam公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 40只SD大鼠隨機均分為4組：⑴ 假手術(shù)組；⑵ 肝缺血再灌注損傷模型組（模型組）；⑶ 低劑量苦參堿（25 mg/kg）預(yù)處理+肝缺血再灌注損傷模型組（低劑量苦參堿組）；⑷ 高劑量苦參堿（50 mg/kg）預(yù)處理+肝缺血再灌注損傷模型組（高劑量苦參堿組）。

1.2.2 動物處理 術(shù)前12 h禁食，自由飲水，經(jīng)腹腔注射4%戊巴比妥鈉（40 mg /kg）麻醉，固定，常規(guī)消毒。取上腹正中切口入腹，低、高劑量苦參堿組大鼠在夾閉門靜脈和肝動脈前30 min，經(jīng)門靜脈主干注入各自劑量的苦參堿溶液，假手術(shù)組與模型組大鼠則以相同的方式注入等體積的生理鹽水；30 min后，模型組與低、高劑量苦參堿組大鼠用無創(chuàng)血管夾阻斷肝左、中葉脈管，造成約70%肝臟缺血，60 min后放開血管夾，恢復(fù)阻斷區(qū)血供再灌注120 min，建立肝切除肝缺血再灌注模型[12]，并切除未經(jīng)缺血處理的肝葉，約占全肝30%。假手術(shù)組僅行開腹手術(shù)，不行肝切除及肝缺血等處理。

1.2.3 標(biāo)本處理 再灌注120 min后，采集各組大鼠肝上下腔靜脈血，常溫1200r/min離心10 min，取血清保存待測；處死各組動物，切取右上葉肝組織，以中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟切片后用于組織病理學(xué)觀察，以及肝細胞凋亡檢測；另取5 g肝組織破碎離心后用于Western blot檢測。

1.2.4 血清學(xué)指標(biāo)檢測 大鼠血清ALT、AST含量檢測按照ALT、AST試劑盒說明進行，大鼠血清TNF-α、IL-1β的含量分別采用各自ELISA試劑盒檢測。

1.2.5 組織病理學(xué)檢測 HE染色后光鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)的改變。

1.2.6 TUNEL法檢測肝細胞凋亡 按試劑盒說明進行凋亡檢測，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。在顯微鏡下觀察、計數(shù)、拍照。評判標(biāo)準(zhǔn)：陽性細胞核和細胞碎片呈深淺不一的棕黃色。每張切片隨即選取10個高倍視野，計數(shù)凋亡細胞。凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）=視野內(nèi)凋亡細胞數(shù)/視野內(nèi)肝細胞數(shù)×100%。

1.2.7 Western blot檢測 新鮮肝臟組織采用RIPA裂解液冰上完全裂解，12 000r/min，4 ℃離心15 min，取上清收集總蛋白。5×上樣緩沖液混合煮沸5 min。垂直板電泳分離條帶，轉(zhuǎn)膜，分別加入TRAIL、BAX、cleaved caspase-3單克隆抗體（一抗1:1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜后用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1:5 000）孵育2 h，利用化學(xué)發(fā)光儀曝光，采集目標(biāo)蛋白條帶。Western blot圖像灰度值采用Quantity One 2.4軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù)，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組轉(zhuǎn)氨酶與炎癥因子水平

血清學(xué)檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，其余各組血清ALT、AST、TNF-α、IL-1β水平均明顯升高（均P＜0.05），但低、高劑量苦參堿組以上指標(biāo)的升高程度均低于模型組（均P＜0.05），且高劑量苦參堿組以上指標(biāo)升高程度均低于低劑量苦參堿組（均P＜0.05）（表1）。

表1 各組轉(zhuǎn)氨酶與炎癥因子水平比較（n=10，±s）Table 1 Comparison of the levels of transaminases and in fl ammatory factors among groups (n=10, ±s)

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與低劑量苦參堿組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs. sham operation group; 2) P＜0.05 vs. model group; 3) P＜0.05 vs. low dose matrine group

組別 ALT（U/L） AST（U/L） TNF-α（ng/L） IL-1β（ng/L）假手術(shù)組 49.3±5.7 150.1±11.4 2.11±0.47 1.37±0.25模型組 555.6±46.11) 796.1±57.21) 14.22±1.401) 7.64±0.831)低劑量苦參堿組 267.4±30.81),2) 445.7±37.81),2) 10.37±0.981),2) 4.92±0.941),2)高劑量苦參堿組 197.4±33.51),2),3) 408.9±44.41),2),3) 8.32±1.741),2),3) 2.55±1.111),2),3)

2.2 各組肝缺血再灌注損后肝組織病理學(xué)變化

光學(xué)顯微鏡下可見，假手術(shù)組肝組織無病理改變，模型組肝細胞腫脹、肝細胞空泡變性和點狀壞死，大量炎性細胞浸潤；低、高劑量苦參堿組肝組損傷程度及范圍均明顯小于模型組，表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)尚清楚，肝細胞輕、中度濁腫，點狀嗜酸性變性，輕度肝細胞淤膽，少量炎性細胞浸潤，且高劑量苦參堿組肝組織損傷程度輕于低劑量苦參堿組（圖1）。

圖1 各組肝組織病理學(xué)檢測（HE×200） A：假手術(shù)組；B：模型組；C：低劑量苦參堿組：D：高劑量苦參堿組Figure 1 Histopathological examination in each group (HE×200) A: Sham operation group; B: Model group; C: Low dose matrine group; D: High dose matrine group

2.3 各組缺血再灌注后的肝細胞凋亡情況

TUNEL染色結(jié)果觀察顯示，假手術(shù)組僅有少量的凋亡陽性細胞，模型組可見大量胞核黃染的陽性細胞，2個劑量苦參堿組陽性細胞明顯少于模型組，高劑量苦參堿組陽性細胞減少數(shù)量更為明顯；比較各組的AI，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2-3）。

圖2 各組TUNEL染色結(jié)果（×200） A：假手術(shù)組；B：模型組；C：低劑量苦參堿組：D：高劑量苦參堿組Figure 2 TUNEL staining results in each group (×200) A: Sham operation group; B: Model group; C: Low dose matrine group; D: High dose matrine group

圖3 各組AI比較 注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與低劑量苦參堿組比較，P＜0.05Figure 3 Comparison of AI among groups Note: 1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs. model group;3) P＜0.05 vs. low dose matrine group

2.4 Western blot檢測結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，各組肝組織TRAIL、BAX、cleaved caspase-3蛋白的表達水平均明顯高于假手術(shù)組（均P＜0.05），其中模型組以上蛋白的上調(diào)最為明顯，2個劑量苦參堿組以上蛋白上調(diào)程度均明顯低于模型組，且高劑量苦參堿組上調(diào)程度低于低劑量苦參堿組（均P＜0.05）（圖4-5）。

圖4 各組Western blot檢測結(jié)果Figure 4 Western blot results of each group

圖5 各組各蛋白相對表達量比較 注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與低劑量苦參堿組比較，P＜0.05Figure 5 Comparison of the relative protein expression levels among groups Note: 1) P＜0.05 vs. sham operation group; 2) P＜0.05 vs. model group; 3) P＜0.05 vs. low dose matrine group

3 討 論

中藥單體苦參堿具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫抑制和保肝等作用[7]。已用于臨床治療，主要用于治療慢性乙型病毒性肝炎[8]，對多種原因引起的肝損傷及肝纖維化均有較好的治療作用[8-9]。本研究通過大鼠肝缺血再灌注損傷模型，觀察苦參堿的干預(yù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參堿對大鼠肝缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用，表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶水平、炎癥介質(zhì)水平較模型組明顯降低，肝組織病理損傷明顯減輕，且呈明顯的劑量依懶性。

為進一步探討苦參堿抑制肝缺血再灌注損傷的機制，本研究檢測了各組再灌注后肝細胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，苦參堿能明顯減少缺血再灌注后肝組織的肝細胞凋亡。細胞凋亡是動物界及人類重要的細胞死亡模式，受多種因素的調(diào)控。TRAIL是近年來發(fā)現(xiàn)的新的TNF家族成員[13]，TRAIL參與T細胞、NK細胞對集體的免疫監(jiān)視，阻止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，因此在腫瘤治療方面?zhèn)涫荜P(guān)注。另外發(fā)現(xiàn)，TRAIL通過結(jié)合靶細胞相應(yīng)的受體，發(fā)揮凋亡誘導(dǎo)作用。諸多研究證實，TRAIL對多種實體腫瘤細胞存在殺傷作用，如NF-κB可誘導(dǎo)TRAIL信號調(diào)節(jié)肝癌細胞凋亡[14]，腫瘤免疫耐受過程中，TRAIL起重要的調(diào)節(jié)作用，許多海洋藥類可通過TRAIL途徑調(diào)節(jié)細胞凋亡[15]。近年越來越多的證據(jù)顯示，在正常人細胞中，TRAIL具有調(diào)節(jié)細胞凋亡的作用。梁艷等[16]研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL可誘導(dǎo)正常人肝細胞線粒體損傷，促進肝細胞凋亡，而且人角質(zhì)細胞凋亡可通過TRAIL途徑[17]。本研究結(jié)果顯示，大鼠肝缺血再灌注后肝組織TRAIL蛋白表達明顯升高，表明TRAIL途徑在大鼠缺血再灌注引起的肝細胞凋亡過程中起重要作用。

TRAIL途徑可通過誘導(dǎo)促凋亡蛋白BAX的表達，而BAX的激活可抑制肝細胞線粒體轉(zhuǎn)膜能力，進而釋放細胞色素C，促進凋亡關(guān)鍵因子caspase-3[18]，最終引起細胞凋亡[17,19-21]。本研究證實，大鼠肝缺血再灌注后BAX蛋白以及激活型caspase-3的表達均明顯上調(diào)，可見，在大鼠肝缺血再灌注損傷中，TRAIL-BAX-caspase-3途徑的活化是肝細胞凋亡的重要原因?？鄥A預(yù)處理同樣明顯降低了缺血再灌注后肝組織BAX蛋白的表達以及激活型caspase-3水平。由此可有推測，苦參堿可能是通過抑制缺血再灌注后TRAIL的表達，進而減少了BAX與caspase-3的活化，減輕大鼠肝缺血再灌注后肝細胞的凋亡，從而有效抑制肝缺血再灌注損傷。

總之，苦參堿對大鼠肝缺血再灌注損傷有明顯的抑制作用，本研究初步探討了其作用機制，認為其抑制TRAIL-BAX-caspase-3途徑引起的肝細胞凋亡可能是重要的作用機制之一。因而，進一步闡明其作用機制，并將其進一步開發(fā)利用，將有望對臨床肝缺血再灌注損傷的防治提供有效手段。

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