脆紅李“火燒葉”病原鑒定

伍文憲，劉 佳，張 蕾，黃小琴，劉 勇*

(1.四川省農業(yè)科學院植物保護研究所，農業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室，四川 成都 610066；2.四川省農業(yè)科學院園藝研究所，四川 成都 610066)

【研究意義】脆紅李(PrunussalicinaLindl.)屬于薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)果樹，是四川省樂山地區(qū)選育的一個地方李品種，該品種果實外觀艷麗、肉質硬脆、可溶性固形物含量高，具有較強的市場競爭力，該品種成熟期較晚，錯開了李子集中上市的季節(jié)，且較耐貯運[1]，正因為有上述諸多優(yōu)勢，果農對脆紅李種植熱情高漲，已成為四川地區(qū)主栽的晚熟李子品種。2016年5月，筆者在四川省宣漢縣廟安鄉(xiāng)、閬中縣文成鎮(zhèn)等地調查發(fā)現一種十分嚴重的病害，發(fā)病面積不斷擴大，受害葉片從葉緣開始發(fā)病，漸向葉片內部擴展、蔓延，導致葉片枯死凋落，由于感病葉片病斑為紅褐色，發(fā)病后期葉片失水，葉緣乃至整個葉片焦枯，遠看葉片呈火燒狀，因此果農將此病征稱為“火燒葉”，該病害嚴重發(fā)生時，極易造成李樹整株葉片枯死，提早脫落，從而削弱樹勢，降低果實產量和品質，嚴重者甚至導致整株絕產絕收。因此，確定脆紅李“火燒葉”病的病原，制定針對性的防治方案，對促進四川省脆紅李產業(yè)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】前人對脆紅李的相關研究多集于高產栽培和高效種植管理，而病蟲害防控相關的研究相對滯后，脆紅李“火燒葉”病害是近年來爆發(fā)的新病害，對該病害的研究鮮有報道?！颈狙芯壳腥朦c】“火燒葉”病害傳染性強、影響面廣、破壞性大，明確其病原是有效防控該病害的基礎?！緮M解決的關鍵問題】筆者從2016年6月起多地多次采樣，經鏡檢，室內病原分離純化培養(yǎng)，致病性測定，并用分子生物學結合傳統(tǒng)形態(tài)學方法進行了病原菌的分離和鑒定工作，為科學防治脆紅李“火燒葉”奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 葉病采集與癥狀描述

2016年6月至2016年8月，選擇四川宣漢縣廟安鄉(xiāng)、閬中縣文成鎮(zhèn)、丹棱縣城郊等地發(fā)病嚴重的果園采集脆紅李“火燒葉”病樣，每個果園隨機選取5株發(fā)病植株，每株樹按東、南、西、北4個方位隨機選擇10片發(fā)病較輕和10片發(fā)病較重的葉片，用自封袋裝好放入便攜式冷藏盒，帶回實驗室備用。

1.2 病樣檢鏡與分離培養(yǎng)

采用常規(guī)方法對發(fā)病的脆紅李葉進行顯微鏡觀察，如觀察到分生孢子，則用無菌水將病樣組織的孢子洗下，稀釋適當倍數后將該孢子懸浮液轉移涂布于同時含有鏈霉素(50 μg·mL-1)和氨芐青霉素(100 μg·mL-1)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar， PDA)中培養(yǎng)48 h左右，分生孢子萌發(fā)在培養(yǎng)基上形成微小菌落，用滅菌的接種針將單菌落菌絲移入另一PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得病原菌的單孢純化菌株[2]。如病樣在顯微鏡下未觀察到分生孢子，則用無菌剪刀取切病健交界處的病斑組織成0.5 cm×0.5 cm的小片，采用三步法進行消毒，然后用無菌水清洗3次。滅菌濾紙上充分吸干水分后置于含有鏈霉素和氨芐青霉素PDA培養(yǎng)基平板中，將平板置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌絲生長后，從新長出的菌落邊緣挑取少量菌絲接種到新的 PDA平板上進一步分離[3]。

1.3 致病性測定

選擇大小一致、健康無病、無蟲傷的脆紅李葉片，進行離體葉片接種試驗。葉片用70 %乙醇進行表面消毒，晾干后置于保濕培養(yǎng)皿(直徑150 mm)中，每皿4～5片葉片。用無菌水沖洗繼代培養(yǎng)后供試菌株上的分生孢子，將分生孢子稀釋至106個孢子/mL，吸取孢子懸浮液20 μl滴在葉片靠近邊緣處接種，同時接種無菌水作為對照，6次重復。置恒溫恒濕培養(yǎng)箱下誘導發(fā)病，每天觀察發(fā)病情況[4-5]。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)學鑒定 光學顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)獲得的病原菌菌絲、分生孢子形態(tài)及色澤特征，觀察葉上片菌落正反面特征。記錄病原菌形態(tài)，使用顯微鏡自帶軟件測量病原菌分生孢子大小，根據病原菌的產孢特征及其在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊》[6]對病原菌進行鑒定。

1.4.2 分子生物學鑒定 根據菌落培養(yǎng)性狀和分生孢子形態(tài)特征，可初步判斷病原菌屬于鏈格孢屬(Alternariasp.) 真菌。為準確鑒定病原菌種屬，本文對病菌進行了分子鑒定。

切取0.5 cm大小的新鮮菌絲塊于鋪有玻璃紙的PDA平板上，置于25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后，進行菌絲收集、液氮速凍和研磨，采用真菌基因組E.Z.N.A.TMFungal DNA Mini Kit(OMEGA真菌基因組DNA提取試劑盒)提取病原菌基因組DNA。用引物ITS4與ITS5[7](ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′; ITS5:5′-GGAAGTAA AAGT CGTA ACAAGG-3′)以及PG3和PG2[8-9](PG3:5′-TACCATGGTTCTTTCCGA-3′; PG2:5′-RCARTCRTCYTGRTT-3′)進行PCR擴增。反應總體積為50 μl，反應體系為：25 μl 2×supermix(北京全式金生物技術公司)，2 μl模板DNA，10μmol·L-1的引物(成都擎科梓熙生物技術有限公司)各2 μl，ddH2O補足到總體積，用BIO-RAD T100TMPCR擴增儀進行擴增反應，其反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，總計35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

擴增產物于1.0 %瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像儀上檢測，ITS4/ITS5引物擴增產物約為570 bp期望片段，PG3/PG2引物擴增產物約為500 bp，紫外燈下切取目的基因片段，使用凝膠純化試劑盒(AXYGEN公司提供)純化后連接到 pMD18-T 載體(大連TaKaRa公司提供)上，轉入大腸桿菌 DH-5菌株(北京全式金生物技術公司)，經菌落PCR鑒定，挑選陽性克隆測序，獲得的序列到https://blast.ncbi.nlm.nih.gov進行比對，根據病菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀和致病性，結合序列分析，對病原菌進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀和危害性

2016年5-9月對發(fā)病嚴重的脆紅李果園進行持續(xù)觀察，發(fā)現病原菌首先從葉緣或者葉尖開始侵入，受害葉片表現為葉緣或葉尖失綠泛紅，病斑近圓形、橢圓形或不規(guī)則形，病斑常沿支脈、側脈和主脈向葉片內部擴展。后期病斑連成一起，整片葉的邊緣均受害呈紅褐色，感病時間較長葉緣部位失水后枯焦，葉片逐漸卷曲，背面可見褐色霉層，最終葉片枯萎凋落，由于葉片感病后表現為紅褐色病斑，遠看葉片呈火燒狀，因此果農將此病征稱為“火燒葉”。嚴重受害的脆紅李植株不僅葉片枯焦脫落，病原菌還侵染枝干，表現為枝干韌皮部、髓腔失水變褐，導致枝條枯死，嚴重削弱樹勢。果實感病初期出現紅色斑圈，果面完整無凹陷，后期果實變軟，果柄失水萎縮，果實未成熟即脫落，嚴重降低果實產量和品質，甚至導致絕收。

2.2 病原菌的態(tài)學特征

脆紅李“火燒葉”葉病保濕培養(yǎng)3 d后刮取病斑上的病原物進行顯微鏡觀察，發(fā)現有2種不同的分生孢子，一種為典型的鏈格孢菌屬(Alternariasp.)真菌分生孢子，另一種為炭疽菌屬(Colletotrichumsp.)真菌分生孢子，鏈格孢菌屬分生孢子梗單生或簇生，頂端微彎曲，有分隔，色澤為淡褐色和深褐色不等，分生孢子形狀變化極大，呈倒梨形、近橢圓形，倒棍棒形、卵形或紡錘形，單生或短鏈生，褐色，具縱橫隔膜，大小為(5.0～13.5) μm× (15.5～45.5) μm，平均為7.5 μm×28.5 μm，喙柱狀或錐狀。炭疽菌屬真菌分生孢子圓柱形，近橢圓形，無色，單孢，大小為 (2.5～4.5) μm× (9.0～19.5) μm，平均為4.0 μm×16.0 μm。

單孢分離獲得的鏈格孢純培養(yǎng)菌株27個，炭疽菌純培養(yǎng)菌株14個，人工培養(yǎng)條件下2種真菌產生的分生孢子形態(tài)與病樣直接鏡檢觀察一致。在PDA培養(yǎng)基上，鏈格孢菌落灰色至橄欖色或淡褐色，平均生長速率8.7 mm·d-1，菌絲發(fā)達，灰色至淡褐色不等，顯微鏡下觀察菌絲有隔膜，多分枝，PDA培養(yǎng)基上不易產孢。PCA或TWA+WS(或濾紙)培養(yǎng)基，在光(日光燈和近紫外光燈)、暗交替條件下培養(yǎng)10 d左右，即可檢查到大量分生孢子的產生[10]。27株鏈格孢菌分生孢子梗和分生孢子形狀與大小一致，根據這些特征，初步確定鏈格孢菌為交鏈格孢Alternariaalternata(Fr.:Fr.) Keissler。

菌落呈鼠灰色的炭疽菌屬真菌較鏈格孢菌生長快，在PDA培養(yǎng)基上菌落呈圓形生長，邊緣整齊，平鋪，菌絲初期為白色，后變深灰色，絮狀或絨狀，后期菌落中央涌出橘紅色奶油狀分生孢子團。根據上述炭疽菌培養(yǎng)性狀和形態(tài)學特征，參照相關文獻的描述[11-12]，初步確定為膠孢炭疽菌(Colletortrichumgloeosporiodes)。

2.3 致病性測定

基于分離得到的鏈格孢和炭疽菌形態(tài)學與培養(yǎng)特性一致，因此本研究選取鏈格孢菌AA5和炭疽菌CG9菌株進行致病性測定。結果表明，鏈格孢菌孢子懸浮液接種脆紅李新鮮葉片后，72 h即可萌發(fā)成菌絲，10 d后可觀察到近圓形紅褐色病斑，隨著時間的推移病斑形成紅褐色輪紋逐漸向外擴展。鏈格孢孢子懸浮液接種脆紅李葉片發(fā)病率高達100 %，接種青脆李葉片的發(fā)病率為43.0 %，且較脆紅李葉片發(fā)病時間晚5 d。為了證實病原物上檢測到的膠孢炭疽菌是否也是“火燒葉”的致病菌之一，筆者使用同樣的方法接種106個孢子/mL膠孢炭疽菌CG9菌株孢子懸浮液，接種后的炭疽菌孢子懸浮液雖能萌發(fā)成菌絲，但葉片沒有觀察到任何病變。

A：整株癥狀；B：感病葉片；C：發(fā)病葉片病斑上的分生孢子；D：病原菌在脆紅李葉片葉片上的致病性測定；E、F：分生孢子梗及分生孢子；G：分生孢子；H、I：分生孢子側面萌生次生分生孢子梗A，B:Symptoms in field; C:The conidia of nature infected leaves; D:Symptoms of Prunus salicina Lindl. CV. Cuihongli leaves after inoculation with Alternaria alternate; E，F：Conidiophores of mycelium and conidia; G:Conidia on TWA+WS plate; H, I:Side germination of secondary conidiophores from conidia圖1 脆紅李“火燒葉”病害的典型癥狀、病原菌形態(tài)特征及致病性測定Fig.1 Symptoms of ‘flaming leaves disease’ caused by Alternaria alternate and morphology of the pathogen

2.4 病原菌分子生物學鑒定

以真菌核糖體基因轉錄間隔區(qū)通用引物 ITS4/ITS5以及鏈格孢菌的多聚半乳糖醛酸酶基因部分序列的兼并引物 PG3/PG2對鏈格孢菌AA5進行擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測、割膠回收、克隆和測序后，將2條片段序列登錄到http://www. ncbi.nlm.nih.gov數據庫中進行比對，發(fā)現由引物ITS4/ITS5擴增的ITS1-5.8SrDNA-ITS2片段與細極鏈格孢(Alternariatenuissima；登錄號：LC134323)、交鏈格孢(Alternariaalternata；登錄號：KX384640.1)、蕓薹鏈格孢(Alternariabrassicicola；登錄號：KU293595.1)的同源性均達到100 %。由引物 PG3/ PG2擴增的多聚半乳糖醛酸酶基因部分序列片段與交鏈格孢(A.alternata)的多聚半乳糖醛酸酶基因 (aapg-1) (登錄號：AB047682) 的相似度高達99.9 %，與陳昌勝等[4]報道的紅橘褐斑病病原MDB1(A.alternata)多聚半乳糖醛酸酶基因片段(登錄號：HQ641564)相似度達99.6 %，與其他種的鏈格孢菌相似度較低。因此，分子鑒定結合形態(tài)學和培養(yǎng)形狀，脆紅李“火燒葉”病原鑒定為交鏈格孢Alternariaalternata(Fr.:Fr.) Keissler。

3 討 論

通過對脆紅李植株“火燒葉”病害癥狀的系統(tǒng)觀察，以及對分離病菌的形態(tài)學、培養(yǎng)性狀以及致病性研究，初步確定“火燒葉”病原為交鏈格孢菌(Alternariaalternata)，為了進一步確認病原，采用真菌分子鑒定通用引物ITS4/ITS5對病原菌ITS1-5.8SrDNA-ITS2片段進行擴增，以期對ITS序列分析驗證形態(tài)學鑒定的結果[14]，結果表明交鏈格孢、細極鏈格孢和蕓薹鏈格孢ITS區(qū)rDNA的序列差異很小，不能根據對所選ITS區(qū)的序列分析加以區(qū)分。伍文憲等在對鐮刀菌分子鑒定時也同樣遇到ITS序列并不是總有足夠多的位點來區(qū)分所有的病原菌問題[15]，需針對交鏈格孢設計特異性引物加以鑒定，根據Peever等[8]的研究，鏈格孢菌的多聚半乳糖醛酸酶基因部分序列可作為小孢子型鏈格孢菌種的分類鑒定的分子依據，因此采用多聚半乳糖醛酸酶基因部分序列的兼并引物PG3/PG2對脆紅李“火燒葉”病原進行擴增，NCBI數據庫比對結果表明，引起脆紅李“火燒葉”的病原為交鏈格孢菌(A.alternata)，與形態(tài)學鑒定結果一致。

在病原菌分離過程中雖然也能分離到膠孢炭疽病菌(C.gloeosporioides)，但致病性測定結果未能證實該真菌的致病性。Marín等的文獻報道認為膠孢炭疽菌普遍存在于健康無癥的果樹葉片等組織[16]，因此筆者認為，伴隨交鏈格孢存在的膠孢炭疽菌并非是“火燒葉”的真正致病菌，而極可能是脆紅李在交鏈格孢為害后，潛伏的炭疽菌生長發(fā)育產孢，其結果可能加重病害的發(fā)生。

交鏈格孢(A.alternata)是一個對植物基質具有廣適性的鏈格孢種，廣泛分布自然界中，在自然情況下常生于植物的枯死部分(病斑、傷、死部位等)或衰弱瀕死組織上，或腐生于多種有機物質或土壤中[10]，因此人們在病害研究過程中認為交鏈格孢菌僅是腐生真菌，或是其他病原菌侵染之后的寄生菌，往往忽視交鏈格孢的重要作用。本研究的實驗結果表明交鏈格孢菌在特定的條件下亦能成為某些植物的重要致病菌，且交鏈格孢菌具有極強的、多變的環(huán)境條件和基質適應能力，在生產實際中防治難度大，在此望引起研究人員的重視。

實地調查“火燒葉”病害及室內致病性測定實驗中發(fā)現，發(fā)病園區(qū)的脆紅李“火燒葉”病害發(fā)病率達70 %以上，而青脆李的發(fā)病率在5 %以下，室內接種交鏈格孢菌，脆紅李葉片發(fā)病率高達100 %，而接種青脆李葉片的發(fā)病率只有43 %，并且較脆紅李葉片發(fā)病時間晚5 d。以上數據表明脆紅李較青脆李抗性差，因此，當地在大力推廣脆李種植的同時，還需在品種選擇上加以審慎考慮。

4 結 論

經病原菌柯赫氏法則鑒定、形態(tài)學鑒定、和分子生物學鑒定，回接病原等實驗，確定四川省宣漢縣、閬中縣等地的脆紅李“火燒葉”病原菌為交鏈格孢菌，建議脆紅李大面積種植地區(qū)，注意加強注重對該病原菌引起的“火燒葉”病進行及時有效的防控。

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