• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于甾體皂苷的襄麥冬塊根抑制性差減雜交文庫的構建

    2018-03-21 06:26:07余海忠王海燕趙慧君孫永林
    西南農(nóng)業(yè)學報 2018年2期
    關鍵詞:甾體泳道采收期

    余海忠,王海燕,趙慧君,孫永林

    (湖北文理學院化學工程與食品科學學院,湖北 襄陽 441053)

    【研究意義】襄麥冬Liriopespicatavar.proliferaY. T. Ma,百合科山麥冬屬植物,是《中華人民共和國藥典》收錄的山麥冬基原植物之一,其塊根與川麥冬、杭麥冬一樣,中藥處方均作麥冬同等入藥[1]。甾體皂苷是襄麥冬的主要活性成分之一,具有降血糖、增強免疫、抗腫瘤、防治心血管疾病、調節(jié)免疫力等多種活性[2-4]。但是,由于受到諸如種植面積、氣候條件、生長周期等因素影響,尤其是較低的含量水平,襄麥冬甾體皂苷的可持續(xù)利用受到了一定的制約?!颈狙芯壳腥朦c】研究表明,皂苷類成分的含量及組成,不僅隨植物遺傳背景、組織類型、生長年齡、生理狀況、環(huán)境因子的改變而發(fā)生顯著變化,而且還取決于皂苷合成酶及其表達水平[5]。由于襄麥冬甾體皂苷的含量變化,具有明顯的生長發(fā)育階段特性[6],提示與其相關的合成酶,在塊根生長發(fā)育階段進行了差異性表達,這為實驗室進行差異基因的篩選提供了理論可能?!厩叭搜芯窟M展】在尋找與某一性狀相關的基因時,抑制消減雜交(SSH)技術被認為是一種較為適合的常規(guī)技術,可在轉錄水平上發(fā)現(xiàn)兩樣品間差異表達的基因[7]。利用該技術,國內學者開展了一些與產(chǎn)苷調控基因篩選相關的基礎工作。和鳳美[8]構建了三七1年和3年生根cDNA的抑制消減文庫,用于尋找三七皂苷調控基因。羅志勇[9-10]通過SSH文庫鑒定出6個克隆(基因)在人參植物根生長發(fā)育階段差異表達。唐其[11]構建了羅漢果果實在不同生育時期皂苷生物合成相關基因的差減cDNA文庫,為提高羅漢果甜苷V的質量和產(chǎn)量奠定了基礎。王士杰[12]以茉莉酸甲酯誘導組與對照組人參發(fā)根為材料構建SSH文庫,獲得了誘導下的差異表達基因。【擬解決的關鍵問題】本實驗以始見期和采收期塊根為材料,構建襄麥冬不同生育期塊根的抑制性差減雜交文庫,以期能篩出一些參與甾體皂苷合成的酶或蛋白,為實現(xiàn)體外調控提高甾體皂苷含量提供理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 襄麥冬塊根

    塊根樣品分2次采集,第1次是2012年9月7日(始見期),第2次是2013年3月12日(采收期),均采自湖北襄陽歐廟襄麥冬GAP生產(chǎn)基地,整株帶土移栽于盆中迅速帶回實驗室,自來水和ddH2O大量沖洗后,塊根用滅菌濾紙蘸干,快速切下后用液氮速凍,置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 試劑和耗材

    PCR-Select cDNA Subtraction Kit、Advantage 2 Polymerase Mix,購自Clontech公司;QIAquick PCR Purification Kit,購自Qiagen公司;Taq酶、標準分子量、pMDl9-T載體購自TaKaRa公司;大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α購自上海生工;CTAB、LiCl、SSTE、DEPC、瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母粉、NaCl、NaOH、氨芐青霉素、Tris飽和酚、氯仿、乙醇、異戊醇、異丙醇等,購自國藥(上海)集團公司;各型號tip、離心管等,購置Axygen公司。

    1.3 主要設備

    SIGMA 3K15冷凍離心機,ABI 9700 PCR儀,Bio-Rad Power Pac HCTM電泳儀,Bio-Rad GelDoc XR凝膠成像儀,HZ-9211K恒溫振蕩器,GHP-9050隔水培養(yǎng)箱,SW-CJ-1FD超凈工作臺,DK-8D三孔電熱恒溫水槽,New Bruns-wick scientific U41086超低溫冰箱,Thermo Nano Drop 2000紫外分光光度計。

    1.4 SSH文庫構建

    采用CTAB法和QIAquick PCR Purification Kit,完成襄麥冬塊根總RNA的提取與純化,經(jīng)質量檢測后,總RNA用于下一步的實驗。RNA的反轉錄及雙鏈DNA的合成參照SMART PCR cDNA Synthesis Kit進行。以襄麥冬始見期塊根cDNA為參照樣品,以采收期塊根cDNA為檢測樣品,按照ClontechTMPCR-Select cDNA Subtraction Kit說明,進行抑制差減雜交操作。SSH產(chǎn)物純化后,與pMD19-T載體連接過夜,轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞,采用藍白斑篩選陽性克隆,隨機挑取24個白色克隆進行Nested PCR以進一步鑒定陽性克隆。實驗中用到的引物和接頭序列見表1。

    表1 引物和接頭序列Table 1 The sequences of primers and adaptor

    表2 襄麥冬塊根總RNA的分光光度檢測結果Table 2 The results of pectrophotometric detection of total RNA from L. spicata var. prolifera

    1.5 EST序列分析

    從文庫中隨機選取400個陽性克隆,經(jīng)活化培養(yǎng)后提取質粒DNA,送上海生工測序。對EST序列進行Blast分析,利用Interproscan、COG、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫進行功能注釋和歸類。

    2 結果與分析

    2.1 總RNA質量檢測

    襄麥冬塊根總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測,得到始見期塊根的總RNA樣品OD260/OD280為2.1,采收期塊根的為2.2(表2),表明RNA的純度較高,可用于后續(xù)反轉錄的模板。

    由圖1可知,28S和18S rRNA條帶清晰、無彌散,表明提取的總RNA完整、無降解。同時,28S大約是18S條帶亮度的2倍,表明二者大致2倍的密度關系。此外,28S rRNA條帶上方無其它條帶出現(xiàn),表明RNA制備過程中無DNA污染。

    SJQ:始見期樣品,CSQ:采收期樣品;M:標準分子量SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber; M:DNA size markers圖1 襄麥冬塊根總RNA電泳圖Fig.1 The total RNA electrophoretogram of L. spicata var. prolifera

    2.2 SMART反轉錄

    利用SMART(Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript)技術合成cDNA,擴增循環(huán)數(shù)過低,cDNA表達豐度也過低,循環(huán)數(shù)過高,則會有非特異擴增,造成假陽性[13]。因此很有必要對合成的循環(huán)數(shù)進行優(yōu)化。如圖2所示,始見期樣品在第21個循環(huán)時顯示擴增效率降低,故采用18個循環(huán)進行cDNA擴增;而采收期樣品在第18個循環(huán)時顯示低擴增效率,所以采用21個循環(huán)進行cDNA擴增。

    2.3 酶切效率的檢測

    RsaI酶能將雙鏈cDNA 酶切成較小的cDNA片段,以降低雜交過程中形成的復雜二級結構對雜交的阻礙作用,既能提高不同基因的檢出率,又可防止長cDNA片段對消減雜交的干擾。取上述始見期和采收期塊根雙鏈cDNA片段,分別進行RsaI酶酶切,電泳檢測酶切結果。由圖3可知,酶切前,電泳條帶呈明顯的彌散狀,片段大小主要集中在500~3000 bp。而酶切后,雙鏈cDNA分布范圍明顯下移,片段被切成100~1000 bp多個小片段cDNA,這表明RsaⅠ已將較長的雙鏈cDNA消化成小片段,酶切比較充分,酶切效率較好,達到了實驗預期,確保了后續(xù)實驗操作的準確性。

    SJQ:始見期樣品,CSQ:采收期樣品;泳道1,4:15個循環(huán),泳道2,5:18個循環(huán),泳道3,6:21個循環(huán);M:標準分子量SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber. Lane 1 and 4, lane 2 and 5, lane 3 and 6 represent 15, 18, 21 cycles respectively. M:DNA size markers圖2 PCR循環(huán)數(shù)優(yōu)化Fig.2 The optimization experiment of PCR cycle parameter

    SJQ:始見期樣品,CSQ:采收期樣品;泳道1,3:酶切前的片段,泳道2,4:酶切后片段;M:標準分子量SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber; Lane 1 and 3:Before Rsa I digestion; Lane 2 and 4:After Rsa I digestion; M:DNA size markers圖3 Rsa I 酶切雙鏈cDNA效率檢測Fig.3 Analysis of Rsa I digestion

    2.4 接頭連接效率的檢測

    ds cDNA與接頭的連接效率是決定抑制性消減雜交成敗的關鍵步驟之一,連接效率高才能保證后面的雜交效率高,理論上,用2個特異引物和由1個特異引物與1個通用引物擴增目標片段的產(chǎn)物量相同,即產(chǎn)物亮度一致,接頭連接效率達100 %。由圖4可以看出,由Primer l和18S rRNA 3’ primer擴增得到片段的亮度,是由18S rRNA 3’及5’primer擴增片段亮度的50 %,說明連接效率大于25 %。

    2.5 差減效率的檢測

    進行2輪雜交和兩輪PCR以后,差異表達的基因得到了富集,由圖5可以看出,差減以后去除了共有的序列,富集了差異表達的基因,因此條帶亮度有所降低。同時,差減以后cDNA片段整體向下偏移(泳道1和泳道3),說明富集的差異表達片段集中在小片段范圍內,長度主要集中在250~1000 bp。此外,差減以后,條帶有些區(qū)域的亮度較集中,可能是由于相似長度的差異片段得到了最大程度的富集,符合cDNA文庫的構建要求。

    泳道1,3:以18S rRNA兩端為引物的PCR產(chǎn)物,泳道2,4:以Primer 1和18S-rRNA 3’端為引物的PCR產(chǎn)物;泳道1和2是以加接頭1的樣品為模板,泳道3和4是以加接頭2的樣品為模板;M:標準分子量Lane 1 and 3:PCR products using the primer 1 and 18S rRNA 3' primer; Lane 2 and 4:PCR products using the 18S rRNA 5' and 3' primers; Lane 1 and 2:PCR products using adaptor 1-ligated as template; Lane 3 and 4:PCR products using adaptor 2-ligated as template. M:DNA size markers圖4 接頭連接效率檢測Fig.4 Analysis of the ligation efficiency

    SJQ:始見期樣品,CSQ:采收期樣品;泳道1,3:以差減后產(chǎn)物為模板擴增的片段,泳道2,4:以差減前產(chǎn)物為模板擴增的片段;M:標準分子量SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber; Lane 1 and 3, PCR was performed using subtracted product as template. Lane 2 and 4:PCR was performed using unsubtracted product as template. M:DNA size markers圖5 差減效率驗證Fig.5 Analysis of subtraction efficiency

    2.6 差減文庫的PCR驗證

    經(jīng)SSH消減并富集得到的cDNA片段,轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞,篩選藍白班,分別隨機挑取24個白色克隆,進行巢式PCR檢測。由6圖可知,大多數(shù)插入片段長度約在250~900 bp,符合建庫要求。

    SJQ:始見期文庫,CSQ:采收期文庫;泳道1~24:以隨機挑選的白色克隆為模板的PCR擴增片段SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber; Lane 1-24, RCR products using the randomly selected clones as template圖6 差減文庫中插入片段檢測Fig.6 The cDNA inserts verified by PCR

    表3 樣本基因與公共數(shù)據(jù)基因對比結果統(tǒng)計Table 3 BLAST result of ESTs with the database of NR,SWISS-PROT, TREMBL, CDD and PFAM

    2.7 基因的生物信息學分析

    2.7.1 基因的同源性注釋 基因的同源性注釋,采用BLST方法,將樣本基因分別與SWISS-PROT、CDD、PFAM、NR和TREMBL公共數(shù)據(jù)庫進行比對,取相似度>30 %,且e<1e-5的注釋為有效注釋,合并基因得到的所有注釋詳細信息。BLAST結果顯示:能注釋上NR、SWISS-PROT、TREMBL、CDD、PFAM數(shù)據(jù)庫的樣本基因,分別有65.26 %、34.42 %、63.96 %、26.30 %、14.94 %,具體注釋上不同數(shù)據(jù)庫的基因數(shù)量分布見表3。

    2.7.2 基因的COG/KOG功能分類預測 對SSH文庫的Unigene分別進行COG與KOG功能分類預測(圖7),結果發(fā)現(xiàn)有23個Unigene能被注釋上12種COG分類中,包括:核苷酸運輸和代謝(Nucleotide transport and metabolism)、翻譯后修飾(Posttranslational modification)、蛋白質周轉與陪伴(protein turnover, chaperones)、信號轉導機制(Signal transduction mechanisms)、轉錄(Transcription)、細胞骨架(Cytoskeleton)、次生代謝產(chǎn)物生物合成、運輸和分解代謝(Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism)等類群。其中,脂質運輸和代謝(Lipid transport and metabolism)類群包含的基因最多,占比為17.39 %;同時,KOG功能分類預測也發(fā)現(xiàn),有103個Unigene能被注釋到核苷酸運輸和代謝(Nucleotide transport and metabolism)、碳水化合物運輸和代謝(Carbohydrate transport and metabolism)、轉錄(Transcription)、細胞骨架(Cytoskeleton)、次生代謝產(chǎn)物生物合成、運輸與分解代謝(Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism)等19個KOG分類中。其中,25個基因歸屬信號轉導機制(Signal transduction mechanisms)類群,占24.27 %。

    A:COG;B:KOG圖7 ESTs序列COG與KOG功能預測分析結果Fig.7 COG and KOG functional analysis of EST sequences from SSH library

    表4 基因的KEGG注釋結果統(tǒng)計Table 4 KEGG analysis result of ESTs from SSH library

    2.7.3 基因的KEGG注釋 利用KAAS對基因注釋進行預測,可獲得基因對應的KO號,再由KO號可將基因對應到相關的KEGG pathway上,由此,便可得基因與KEGG中酶注釋的關系以及映射到pathway上的相關信息。經(jīng)KEGG分析,從本實驗構建的SSH文庫中,篩選出81個預測基因,它們能注釋到48個不同的EC號,參與到92個通路的代謝中(表4)。其中,ZB281822基因,對應酶編號為EC:2.3.1.9,能映射到13個pathway中,涉及萜類化合物骨架合成(ko00900)、脂肪酸代謝(ko00071)、酮體的合成與降解(ko00072)、纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸降解(ko00280)、賴氨酸降解(ko00310)、苯甲酸降解(ko00362)、色氨酸代謝(ko00380)、丙酮酸代謝(ko00620)、乙醛酸和二羧酸代謝 (ko00630)、丙酸代謝(ko00640)、丁酸甲酯代謝(ko00650)、固氮通路(ko00720)、雙組分系統(tǒng)(ko02020)等通路。

    2.7.4 基因的GO分類 利用Gene Ontology對構建的SSH文庫EST序列進行功能注釋,發(fā)現(xiàn)在生物過程(biological process)分類中,基因序列主要聚集于biological process、metabiolic process、cellular process、celluar metabolic process和primary metabolic process,基因個數(shù)均超過90個,其中Biological process達到338個;在細胞組成(cellular component)分類中,序列主要聚集于cell、cell part和intracellular;而在分子功能(Molecular Function)分類中,數(shù)量排在前三的基因序列依次為catalytic activity、binding、transferase activity。圖8顯示的是Levle2水平下的GO注釋分類結果,其中catalytic activity的基因數(shù)量最多,達到124個。

    甾體皂苷的生物合成,其前半部分與三萜皂苷生物合成一樣,共享甲羥戊酸代謝途徑,得到產(chǎn)物2,3-氧化鯊烯,經(jīng)環(huán)阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase,CAS)的作用形成環(huán)阿屯醇,然后再經(jīng)氧化、脫羧、還原等反應得到膽固醇,最后經(jīng)甾體的糖基轉移酶(Steroidal Glycosyltransferase, SGT)和β-糖苷酶(26-O-beta-glucosidase)的作用下形成各種甾體皂苷[14]。對甾體皂苷合成酶的研究,早期主要集中在甾體皂苷元部分,如3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(HMGR)、鯊烯合成酶(SQS)、環(huán)阿屯醇合成酶(CAS)等[15-17],后來研究發(fā)現(xiàn)糖鏈結構對其生理活性影響也比較大,隨后也逐漸加強了對諸如糖基轉移酶[18]、糖苷酶[19]等糖酶的研究。

    本實驗通過對EST序列進行生物信息學分析,從SSH文庫中篩選了一些與皂苷合成相關的酶或蛋白基因片段,它們分屬淀粉和蔗糖代謝、二萜類化合物的生物合成、類固醇生物合成、倍半萜類和三萜生物合成、萜類化合物骨架生物合成、糖酵解等代謝途徑,如β-呋喃果糖苷酶、環(huán)阿屯醇合酶、鯊烯單加氧酶、sterol 14-demethylase、UDP-glucosyl transferase 73C等,部分序列見表5。

    圖8 Level 2水平下的GO注釋分類gene數(shù)量分布Fig.8 Level 2 functional classification of sequenced cDNAs by Gene Ontology

    表5 SSH文庫中部分與皂苷合成相關的ESTs生物信息學分析Table 5 Bioinformatics analysis for a few ESTs related saponin synthesis from the SSH cDNA library

    3 結 論

    采用抑制性差減雜交技術,本實驗室構建了襄麥冬參與甾體皂苷代謝調控基因的SSH文庫:始見期塊根消減文庫和采收期塊根消減文庫,有效基因序列308條,長度主要分布在250~1000 bp左右,片段平均長度586.99 bp;文庫樣本序列注釋上NR、SWISS-PROT、TREMBL、CDD、PFAM庫的基因分別有65.26 %、34.42 %、63.96 %、26.30 %、14.94 %;樣本中分別有23和103個Unigene可注釋上12個COG分類與19個KOG分類中;樣本中有81個預測基因,可以注釋到48種酶與映射到92個代謝通路上;樣本基因功能在Biological Process分類中聚集于cellular process和metabiolic process,在Cellular Component主要聚集于cell、cell part和intracellular,在Molecular Function分類中主要聚集于catalytic activity、binding和transferase activity。該文庫的構建,非常有助于探索和揭示甾體皂苷生物合成途徑的分子基礎。

    4 討 論

    抑制消減雜交是建立在抑制性PCR基礎上的一種高效的差減雜交技術,可使高豐度與低豐度mRNA達到均衡,起到富集稀少mRNA的作用,有利于篩選低拷貝差異表達基因[20],可一次檢出上百個差異表達基因。盡管目前已經(jīng)出現(xiàn)了基于第二、三代測序技術的組學研究,但是筆者認為,SSH成本低、速度快的技術特點,非常適合樣品差異表達基因的初步篩選和探索,可作為組學大規(guī)模篩選研究的有益補充。

    [1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2015.

    [2]李蘭青, 張麗娟. 麥冬的藥理作用[J]. 河北中醫(yī)藥學報, 2000,15 (2):34-35.

    [3]Kou J, Tian Y, Tang Y, et al. Antithrombotic activities of aqueous extract from Radix Ophiopogon japonicus and its two constituents[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2006, 29(6):1267-1270.

    [4]Chen X H, Bai X, Liu Y H, et al. Anti-diabetic effects of water extract and crude polysaccharides from tuberous root ofLiriopespicatavar.proliferain mice[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2009, 122:205-209.

    [5]Haralampidis K, Trojanowska M, Osbourn A E. Biosynthesis of triterpenoid saponins in plants[J]. Adv Biochem Eng Biotechnol, 2002, 75:31-49.

    [6]吳 弢, 余伯陽, 程志紅,等. HPLC-ELSD法測定湖北麥冬中主要皂苷的含量[J]. 中草藥, 2000, 31(3):175-177.

    [7袁 芳, 甄梓娟, 徐元江,等. 西藏八角蓮與桃兒七根及根莖SSH文庫的建立[J]. 西北植物學報, 2016, 36(3):467-471.

    [8]和鳳美. 三七消減文庫構建和皂苷合成關鍵酶基因克隆及表達[D]. 四川大學, 2006.

    [9]羅志勇, 劉水平, 陸秋恒,等. 人參植物與皂苷生物合成相關的差減cDNA文庫構建及基因差異表達分析[J]. 生命科學研究, 2003(4):324-328.

    [10]羅志勇, 陸秋恒, 劉水平,等. 人參植物皂苷生物合成相關新基因的篩選與鑒定[J]. 生物化學與生物物理學報, 2003(6):554-560.

    [11]唐 其, 邱德有, 馬小軍,等. 羅漢果果實不同發(fā)育時期SSH文庫的構建[J]. 廣西植物, 2011(3):388-392.

    [12]王士杰. 茉莉酸甲酯誘導的人參發(fā)根培養(yǎng)及SSH文庫構建研究[D].吉林農(nóng)業(yè)大學, 2011.

    [13]武小霞, 孫 晶, 蘇安玉,等.大豆再生抑制消減雜交文庫的構建[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2014, 45(7):38-44.

    [14]秦玉芝, 趙小英, 鄧克勤,等. 甾醇生物合成中的關鍵酶——環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶的分子生物學研究[J]. 生命科學研究, 2007, 11(1):10-15.

    [15]Caelles C,F(xiàn)errer A,Balcells L,et al. Isolation and structural characterization of a cDNA encodingArabidopsisthaliana3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase[J]. Plant Mol Biol,1989,13:627-628.

    [16]Jennings S M,Tsay Y H,F(xiàn)isch T M,et al. Molecular cloning and characterization of the yeast gene for squalene synthetase[J].Proc Natl Acad Sci,1991,88:6038-6042.

    [17]Zhong H W,Trevor Y,Hong H,et al.Cloning and Characterization of oxidosqualene cyclases fromKalanchoedaigremontiana[J]. J Biol Chem,2010,285:29703-29711.

    [18]Esders T W, Light R J.Occurrence of a uridine diphosphate glucose:sterol glucosyltransferase inCandidabogoriensis[J].J Biol them,1972,247:7494-7497.

    [19]Inouc K, Shibuya M,Yamamoto K,et a1.Molecular cloning and bacterial expression of a cDNA encoding furestanol glycoside 26-O-beta-glucosidase ofCostusspeciosus[J]. FEBS Letters,1996,378:157-160.

    [20]黃 鑫, 戴思蘭, 孟 麗,等. 抑制性差減雜交(SSH)技術在分離植物差異表達基因中的應用[J]. 分子植物育種, 2006(5):735-746.

    猜你喜歡
    甾體泳道采收期
    得分一瞬
    睿士(2023年9期)2023-09-20 05:47:07
    非節(jié)肢類海洋無脊椎動物中蛻皮甾體及其功能研究
    海洋通報(2020年2期)2020-09-04 09:22:10
    家蠶色氨酸羥化酶 (TRH) 基因的克隆及表達特性分析
    厚樸葉營養(yǎng)成分隨不同采收期的變化分析
    海洋微生物來源的甾體化合物及其生物活性研究進展
    紫玉簪活性甾體皂苷的制備工藝研究
    5個采收期女貞子中5種成分的動態(tài)變化
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    改良CLSI M38-A2應用于皮膚癬菌對甾體皂苷敏感性的測定
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:45
    HPLC法同時測定5個采收期蛇莓中5種黃酮成分
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:37
    游泳池里的航母
    法律面前人人平等表现在哪些方面| 免费看a级黄色片| 亚洲七黄色美女视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲人与动物交配视频| 国产69精品久久久久777片 | 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| www日本在线高清视频| 国产高清videossex| 夜夜夜夜夜久久久久| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| av片东京热男人的天堂| 国产一区二区三区视频了| 免费看十八禁软件| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲avbb在线观看| av中文乱码字幕在线| 后天国语完整版免费观看| 一级黄色大片毛片| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99热这里只有是精品50| 久久这里只有精品中国| 成人鲁丝片一二三区免费| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 女人被狂操c到高潮| 又粗又爽又猛毛片免费看| 一本一本综合久久| 亚洲中文字幕日韩| 最近最新免费中文字幕在线| 国产免费男女视频| 嫩草影院精品99| 国产精品野战在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 18禁观看日本| 最近在线观看免费完整版| 女同久久另类99精品国产91| 两个人视频免费观看高清| 亚洲av成人一区二区三| 国产午夜精品久久久久久| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲片人在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 波多野结衣巨乳人妻| 999精品在线视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美zozozo另类| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产一区二区激情短视频| 成人一区二区视频在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产精品,欧美在线| 免费看光身美女| av在线天堂中文字幕| 亚洲av成人一区二区三| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 一级毛片高清免费大全| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲av成人一区二区三| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 老汉色av国产亚洲站长工具| 中文字幕熟女人妻在线| 18禁国产床啪视频网站| 日韩免费av在线播放| 亚洲最大成人中文| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美中文综合在线视频| АⅤ资源中文在线天堂| 国产熟女xx| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久香蕉精品热| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日本黄色片子视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 伦理电影免费视频| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 黄色成人免费大全| 脱女人内裤的视频| 国产单亲对白刺激| 麻豆av在线久日| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产亚洲av高清不卡| bbb黄色大片| 美女免费视频网站| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产黄a三级三级三级人| 搡老熟女国产l中国老女人| 69av精品久久久久久| 久久精品91蜜桃| 久久这里只有精品19| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 级片在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 日韩精品中文字幕看吧| tocl精华| 欧美av亚洲av综合av国产av| svipshipincom国产片| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 人人妻人人看人人澡| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲人成伊人成综合网2020| 一区福利在线观看| 日日夜夜操网爽| 性色av乱码一区二区三区2| 麻豆成人av在线观看| 久久这里只有精品19| 国产主播在线观看一区二区| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲精品456在线播放app | 国产真人三级小视频在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 免费在线观看日本一区| 窝窝影院91人妻| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 色综合婷婷激情| 日本成人三级电影网站| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产高潮美女av| 国产69精品久久久久777片 | 欧美在线一区亚洲| 大型黄色视频在线免费观看| 成人18禁在线播放| 中文字幕熟女人妻在线| 午夜两性在线视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 男女床上黄色一级片免费看| 无限看片的www在线观看| 毛片女人毛片| 一a级毛片在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 97碰自拍视频| 九色国产91popny在线| 国产黄色小视频在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲性夜色夜夜综合| 色哟哟哟哟哟哟| 99热这里只有精品一区 | 国产精品女同一区二区软件 | 热99re8久久精品国产| 国产私拍福利视频在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 成人性生交大片免费视频hd| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲中文日韩欧美视频| 两性夫妻黄色片| 国产免费av片在线观看野外av| 中文资源天堂在线| 后天国语完整版免费观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 18禁美女被吸乳视频| 久久午夜亚洲精品久久| 国产97色在线日韩免费| 中文字幕久久专区| 亚洲色图av天堂| 无遮挡黄片免费观看| 淫秽高清视频在线观看| 日本 欧美在线| 日本一二三区视频观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| av国产免费在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 热99re8久久精品国产| 哪里可以看免费的av片| 国产精华一区二区三区| 欧美一级毛片孕妇| 午夜免费激情av| 国产精品av视频在线免费观看| 黑人操中国人逼视频| 一二三四在线观看免费中文在| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久九九热精品免费| www.www免费av| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一a级毛片在线观看| 国产一区二区三区视频了| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产美女午夜福利| 久久久久久国产a免费观看| 男人舔奶头视频| 亚洲av成人一区二区三| 两人在一起打扑克的视频| 黄色视频,在线免费观看| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲熟妇熟女久久| 午夜两性在线视频| 动漫黄色视频在线观看| 在线观看一区二区三区| 热99在线观看视频| 久久99热这里只有精品18| 久久天堂一区二区三区四区| 午夜免费观看网址| 88av欧美| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久久久久大精品| 色在线成人网| 黄色日韩在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 搡老岳熟女国产| 国产精品1区2区在线观看.| 日韩欧美国产在线观看| 成年人黄色毛片网站| 国产一区二区激情短视频| 午夜免费成人在线视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 老司机福利观看| 麻豆av在线久日| 国产av不卡久久| 国产av在哪里看| 国产毛片a区久久久久| 午夜久久久久精精品| 99精品久久久久人妻精品| 午夜福利免费观看在线| 精华霜和精华液先用哪个| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 在线永久观看黄色视频| 国产极品精品免费视频能看的| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 日本 欧美在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产男靠女视频免费网站| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国内精品久久久久久久电影| 无限看片的www在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 91久久精品国产一区二区成人 | 男人和女人高潮做爰伦理| av在线天堂中文字幕| 在线永久观看黄色视频| 国产乱人视频| 曰老女人黄片| 99热精品在线国产| 少妇的丰满在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 男人舔女人下体高潮全视频| 色哟哟哟哟哟哟| 天天一区二区日本电影三级| 精品久久久久久久久久免费视频| 最新在线观看一区二区三区| 十八禁人妻一区二区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久99热这里只有精品18| 91字幕亚洲| 免费av不卡在线播放| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲男人的天堂狠狠| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲中文av在线| 国产乱人视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲国产精品成人综合色| 国产一区二区激情短视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲在线观看片| 欧美极品一区二区三区四区| 真人一进一出gif抽搐免费| 黄频高清免费视频| 国产成人福利小说| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲乱码一区二区免费版| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 免费看光身美女| 少妇的逼水好多| 久久热在线av| 国产激情久久老熟女| 久久久久性生活片| 男人的好看免费观看在线视频| 日本免费a在线| 国产精品九九99| 丰满人妻一区二区三区视频av | 久久亚洲真实| 露出奶头的视频| 亚洲熟妇熟女久久| 宅男免费午夜| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 美女黄网站色视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 最好的美女福利视频网| 国产精品,欧美在线| 日本免费a在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 看片在线看免费视频| 丁香六月欧美| 国产探花在线观看一区二区| xxx96com| 国产 一区 欧美 日韩| 国产精品 欧美亚洲| 校园春色视频在线观看| 99久国产av精品| 欧美3d第一页| x7x7x7水蜜桃| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲欧美日韩高清专用| 这个男人来自地球电影免费观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 精品欧美国产一区二区三| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲av片天天在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 在线观看一区二区三区| 嫩草影院精品99| 精品一区二区三区视频在线 | 丝袜人妻中文字幕| 丝袜人妻中文字幕| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精华一区二区三区| 青草久久国产| 两性夫妻黄色片| 1024手机看黄色片| 久久久国产成人免费| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品一区二区三区视频在线 | 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久精品影院6| 久久香蕉国产精品| 淫秽高清视频在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久香蕉国产精品| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲性夜色夜夜综合| 日韩欧美免费精品| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美在线一区亚洲| 麻豆av在线久日| 桃红色精品国产亚洲av| 久久午夜亚洲精品久久| 成人av在线播放网站| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 免费在线观看成人毛片| www国产在线视频色| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美国产日韩亚洲一区| 中文在线观看免费www的网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 看片在线看免费视频| 在线国产一区二区在线| 国产精品99久久久久久久久| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品久久久久久久电影 | 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 久久久久久久久久黄片| 99在线人妻在线中文字幕| 久久精品综合一区二区三区| 成在线人永久免费视频| 免费看美女性在线毛片视频| 听说在线观看完整版免费高清| 成人午夜高清在线视频| 男插女下体视频免费在线播放| 精品一区二区三区视频在线 | 国产精品av视频在线免费观看| 欧美午夜高清在线| 成年女人永久免费观看视频| 黄色视频,在线免费观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 丝袜人妻中文字幕| 在线观看免费午夜福利视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲一区高清亚洲精品| www.精华液| 成人欧美大片| 老司机深夜福利视频在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲黑人精品在线| 国产精品一区二区免费欧美| 国产乱人视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 1024手机看黄色片| 亚洲精品456在线播放app | 国产一区二区激情短视频| 91在线精品国自产拍蜜月 | 日本精品一区二区三区蜜桃| 午夜福利免费观看在线| 老鸭窝网址在线观看| 久久九九热精品免费| 色视频www国产| 国产综合懂色| 国产午夜精品论理片| 亚洲中文字幕日韩| 村上凉子中文字幕在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久午夜亚洲精品久久| 后天国语完整版免费观看| 熟女人妻精品中文字幕| 精品久久久久久成人av| 国产精品野战在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产爱豆传媒在线观看| 久久99热这里只有精品18| 综合色av麻豆| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久久久性生活片| 久久人妻av系列| 一个人看视频在线观看www免费 | 国产成人av激情在线播放| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产伦人伦偷精品视频| 看免费av毛片| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| a级毛片a级免费在线| 好男人在线观看高清免费视频| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲成人久久性| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | a级毛片在线看网站| 欧美3d第一页| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 九九在线视频观看精品| 搡老岳熟女国产| 亚洲无线在线观看| 一本一本综合久久| 在线播放国产精品三级| 免费看光身美女| av天堂在线播放| or卡值多少钱| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品1区2区在线观看.| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产午夜精品久久久久久| 美女cb高潮喷水在线观看 | 视频区欧美日本亚洲| 欧美成人免费av一区二区三区| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品电影一区二区三区| 97碰自拍视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久热在线av| 神马国产精品三级电影在线观看| 嫩草影院入口| 99久久99久久久精品蜜桃| ponron亚洲| 亚洲中文av在线| 在线观看日韩欧美| 怎么达到女性高潮| 999精品在线视频| 天堂动漫精品| 一本一本综合久久| 高潮久久久久久久久久久不卡| 午夜两性在线视频| 国产91精品成人一区二区三区| av视频在线观看入口| 很黄的视频免费| 国产伦精品一区二区三区四那| 12—13女人毛片做爰片一| 黄色女人牲交| 精品久久久久久久末码| 特大巨黑吊av在线直播| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一级a爱片免费观看的视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲成人久久爱视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 成年女人看的毛片在线观看| 黄片小视频在线播放| 午夜免费激情av| 99热这里只有是精品50| 国产午夜福利久久久久久| 天堂动漫精品| 午夜精品久久久久久毛片777| 可以在线观看毛片的网站| 我的老师免费观看完整版| 麻豆国产97在线/欧美| 国产成人av教育| 欧美高清成人免费视频www| av天堂在线播放| 日本免费a在线| 老司机福利观看| 国产精品1区2区在线观看.| 精品国产美女av久久久久小说| 俺也久久电影网| 中文字幕久久专区| 大型黄色视频在线免费观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲无线观看免费| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲国产精品成人综合色| 久久久久精品国产欧美久久久| 熟女电影av网| 亚洲精品粉嫩美女一区| x7x7x7水蜜桃| 欧美精品啪啪一区二区三区| 99久久精品热视频| 成年人黄色毛片网站| 麻豆一二三区av精品| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 成人av在线播放网站| 国产亚洲精品一区二区www| 美女大奶头视频| 国模一区二区三区四区视频 | 此物有八面人人有两片| 久久中文字幕一级| 女人被狂操c到高潮| 亚洲色图av天堂| 国产高清视频在线观看网站| 在线观看免费午夜福利视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲精华国产精华精| 久久久精品大字幕| 国产三级中文精品| 欧美日韩乱码在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 午夜视频精品福利| 日韩欧美免费精品| 欧美国产日韩亚洲一区| 身体一侧抽搐| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美中文综合在线视频| 动漫黄色视频在线观看| 午夜福利免费观看在线| 国产精品久久电影中文字幕| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久久国产成人精品二区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产一区二区在线av高清观看| 国产亚洲欧美98| av天堂中文字幕网| 哪里可以看免费的av片| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久国产精品麻豆| 老司机福利观看| 身体一侧抽搐| 国产黄色小视频在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美成人性av电影在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 男女午夜视频在线观看| 两性夫妻黄色片| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 精品国产美女av久久久久小说| 午夜激情福利司机影院| 国产精品一区二区精品视频观看| 九九热线精品视视频播放| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 岛国在线观看网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美3d第一页| 日本黄大片高清| 最近最新中文字幕大全免费视频| 99热精品在线国产| 男女下面进入的视频免费午夜| 日韩有码中文字幕| 白带黄色成豆腐渣| 听说在线观看完整版免费高清| av黄色大香蕉| 欧美av亚洲av综合av国产av| 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美乱色亚洲激情| 国产一区二区激情短视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 午夜福利在线在线| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美乱色亚洲激情| 国产精品九九99| 在线播放国产精品三级| 国产三级在线视频| 欧美乱妇无乱码| 亚洲色图av天堂| 不卡一级毛片| 精品免费久久久久久久清纯| 一级毛片精品| 色综合亚洲欧美另类图片|