基于甾體皂苷的襄麥冬塊根抑制性差減雜交文庫的構建

余海忠，王海燕，趙慧君，孫永林

(湖北文理學院化學工程與食品科學學院，湖北 襄陽 441053)

【研究意義】襄麥冬Liriopespicatavar.proliferaY. T. Ma，百合科山麥冬屬植物，是《中華人民共和國藥典》收錄的山麥冬基原植物之一，其塊根與川麥冬、杭麥冬一樣，中藥處方均作麥冬同等入藥[1]。甾體皂苷是襄麥冬的主要活性成分之一，具有降血糖、增強免疫、抗腫瘤、防治心血管疾病、調節(jié)免疫力等多種活性[2-4]。但是，由于受到諸如種植面積、氣候條件、生長周期等因素影響，尤其是較低的含量水平，襄麥冬甾體皂苷的可持續(xù)利用受到了一定的制約?！颈狙芯壳腥朦c】研究表明，皂苷類成分的含量及組成，不僅隨植物遺傳背景、組織類型、生長年齡、生理狀況、環(huán)境因子的改變而發(fā)生顯著變化，而且還取決于皂苷合成酶及其表達水平[5]。由于襄麥冬甾體皂苷的含量變化，具有明顯的生長發(fā)育階段特性[6]，提示與其相關的合成酶，在塊根生長發(fā)育階段進行了差異性表達，這為實驗室進行差異基因的篩選提供了理論可能?！厩叭搜芯窟M展】在尋找與某一性狀相關的基因時，抑制消減雜交(SSH)技術被認為是一種較為適合的常規(guī)技術，可在轉錄水平上發(fā)現(xiàn)兩樣品間差異表達的基因[7]。利用該技術，國內學者開展了一些與產(chǎn)苷調控基因篩選相關的基礎工作。和鳳美[8]構建了三七1年和3年生根cDNA的抑制消減文庫，用于尋找三七皂苷調控基因。羅志勇[9-10]通過SSH文庫鑒定出6個克隆(基因)在人參植物根生長發(fā)育階段差異表達。唐其[11]構建了羅漢果果實在不同生育時期皂苷生物合成相關基因的差減cDNA文庫，為提高羅漢果甜苷V的質量和產(chǎn)量奠定了基礎。王士杰[12]以茉莉酸甲酯誘導組與對照組人參發(fā)根為材料構建SSH文庫，獲得了誘導下的差異表達基因。【擬解決的關鍵問題】本實驗以始見期和采收期塊根為材料，構建襄麥冬不同生育期塊根的抑制性差減雜交文庫，以期能篩出一些參與甾體皂苷合成的酶或蛋白，為實現(xiàn)體外調控提高甾體皂苷含量提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 襄麥冬塊根

塊根樣品分2次采集，第1次是2012年9月7日(始見期)，第2次是2013年3月12日(采收期)，均采自湖北襄陽歐廟襄麥冬GAP生產(chǎn)基地，整株帶土移栽于盆中迅速帶回實驗室，自來水和ddH2O大量沖洗后，塊根用滅菌濾紙蘸干，快速切下后用液氮速凍，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和耗材

PCR-Select cDNA Subtraction Kit、Advantage 2 Polymerase Mix，購自Clontech公司；QIAquick PCR Purification Kit，購自Qiagen公司；Taq酶、標準分子量、pMDl9-T載體購自TaKaRa公司；大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α購自上海生工；CTAB、LiCl、SSTE、DEPC、瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母粉、NaCl、NaOH、氨芐青霉素、Tris飽和酚、氯仿、乙醇、異戊醇、異丙醇等，購自國藥(上海)集團公司；各型號tip、離心管等，購置Axygen公司。

1.3 主要設備

SIGMA 3K15冷凍離心機，ABI 9700 PCR儀，Bio-Rad Power Pac HCTM電泳儀，Bio-Rad GelDoc XR凝膠成像儀，HZ-9211K恒溫振蕩器，GHP-9050隔水培養(yǎng)箱，SW-CJ-1FD超凈工作臺，DK-8D三孔電熱恒溫水槽，New Bruns-wick scientific U41086超低溫冰箱，Thermo Nano Drop 2000紫外分光光度計。

1.4 SSH文庫構建

采用CTAB法和QIAquick PCR Purification Kit，完成襄麥冬塊根總RNA的提取與純化，經(jīng)質量檢測后，總RNA用于下一步的實驗。RNA的反轉錄及雙鏈DNA的合成參照SMART PCR cDNA Synthesis Kit進行。以襄麥冬始見期塊根cDNA為參照樣品，以采收期塊根cDNA為檢測樣品，按照ClontechTMPCR-Select cDNA Subtraction Kit說明，進行抑制差減雜交操作。SSH產(chǎn)物純化后，與pMD19-T載體連接過夜，轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，采用藍白斑篩選陽性克隆，隨機挑取24個白色克隆進行Nested PCR以進一步鑒定陽性克隆。實驗中用到的引物和接頭序列見表1。

表1 引物和接頭序列Table 1 The sequences of primers and adaptor

表2 襄麥冬塊根總RNA的分光光度檢測結果Table 2 The results of pectrophotometric detection of total RNA from L. spicata var. prolifera

1.5 EST序列分析

從文庫中隨機選取400個陽性克隆，經(jīng)活化培養(yǎng)后提取質粒DNA，送上海生工測序。對EST序列進行Blast分析，利用Interproscan、COG、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫進行功能注釋和歸類。

2 結果與分析

2.1 總RNA質量檢測

襄麥冬塊根總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測，得到始見期塊根的總RNA樣品OD260/OD280為2.1，采收期塊根的為2.2(表2)，表明RNA的純度較高，可用于后續(xù)反轉錄的模板。

由圖1可知，28S和18S rRNA條帶清晰、無彌散，表明提取的總RNA完整、無降解。同時，28S大約是18S條帶亮度的2倍，表明二者大致2倍的密度關系。此外，28S rRNA條帶上方無其它條帶出現(xiàn)，表明RNA制備過程中無DNA污染。

SJQ：始見期樣品，CSQ：采收期樣品；M：標準分子量SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber; M:DNA size markers圖1 襄麥冬塊根總RNA電泳圖Fig.1 The total RNA electrophoretogram of L. spicata var. prolifera

2.2 SMART反轉錄

利用SMART(Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript)技術合成cDNA，擴增循環(huán)數(shù)過低，cDNA表達豐度也過低，循環(huán)數(shù)過高，則會有非特異擴增，造成假陽性[13]。因此很有必要對合成的循環(huán)數(shù)進行優(yōu)化。如圖2所示，始見期樣品在第21個循環(huán)時顯示擴增效率降低，故采用18個循環(huán)進行cDNA擴增；而采收期樣品在第18個循環(huán)時顯示低擴增效率，所以采用21個循環(huán)進行cDNA擴增。

2.3 酶切效率的檢測

RsaI酶能將雙鏈cDNA 酶切成較小的cDNA片段，以降低雜交過程中形成的復雜二級結構對雜交的阻礙作用，既能提高不同基因的檢出率，又可防止長cDNA片段對消減雜交的干擾。取上述始見期和采收期塊根雙鏈cDNA片段，分別進行RsaI酶酶切，電泳檢測酶切結果。由圖3可知，酶切前，電泳條帶呈明顯的彌散狀，片段大小主要集中在500～3000 bp。而酶切后，雙鏈cDNA分布范圍明顯下移，片段被切成100～1000 bp多個小片段cDNA，這表明RsaⅠ已將較長的雙鏈cDNA消化成小片段，酶切比較充分，酶切效率較好，達到了實驗預期，確保了后續(xù)實驗操作的準確性。

SJQ：始見期樣品，CSQ：采收期樣品；泳道1,4：15個循環(huán)，泳道2,5：18個循環(huán)，泳道3,6：21個循環(huán)；M：標準分子量SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber. Lane 1 and 4, lane 2 and 5, lane 3 and 6 represent 15, 18, 21 cycles respectively. M:DNA size markers圖2 PCR循環(huán)數(shù)優(yōu)化Fig.2 The optimization experiment of PCR cycle parameter

SJQ：始見期樣品，CSQ：采收期樣品；泳道1,3：酶切前的片段，泳道2,4：酶切后片段；M：標準分子量SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber; Lane 1 and 3:Before Rsa I digestion; Lane 2 and 4:After Rsa I digestion; M:DNA size markers圖3 Rsa I 酶切雙鏈cDNA效率檢測Fig.3 Analysis of Rsa I digestion

2.4 接頭連接效率的檢測

ds cDNA與接頭的連接效率是決定抑制性消減雜交成敗的關鍵步驟之一，連接效率高才能保證后面的雜交效率高，理論上，用2個特異引物和由1個特異引物與1個通用引物擴增目標片段的產(chǎn)物量相同，即產(chǎn)物亮度一致，接頭連接效率達100 %。由圖4可以看出，由Primer l和18S rRNA 3’ primer擴增得到片段的亮度，是由18S rRNA 3’及5’primer擴增片段亮度的50 %，說明連接效率大于25 %。

2.5 差減效率的檢測

進行2輪雜交和兩輪PCR以后，差異表達的基因得到了富集，由圖5可以看出，差減以后去除了共有的序列，富集了差異表達的基因，因此條帶亮度有所降低。同時，差減以后cDNA片段整體向下偏移(泳道1和泳道3)，說明富集的差異表達片段集中在小片段范圍內，長度主要集中在250～1000 bp。此外，差減以后，條帶有些區(qū)域的亮度較集中，可能是由于相似長度的差異片段得到了最大程度的富集，符合cDNA文庫的構建要求。

泳道1,3：以18S rRNA兩端為引物的PCR產(chǎn)物，泳道2,4：以Primer 1和18S-rRNA 3’端為引物的PCR產(chǎn)物；泳道1和2是以加接頭1的樣品為模板，泳道3和4是以加接頭2的樣品為模板；M：標準分子量Lane 1 and 3:PCR products using the primer 1 and 18S rRNA 3' primer; Lane 2 and 4:PCR products using the 18S rRNA 5' and 3' primers; Lane 1 and 2:PCR products using adaptor 1-ligated as template; Lane 3 and 4:PCR products using adaptor 2-ligated as template. M:DNA size markers圖4 接頭連接效率檢測Fig.4 Analysis of the ligation efficiency

SJQ：始見期樣品，CSQ：采收期樣品；泳道1,3：以差減后產(chǎn)物為模板擴增的片段，泳道2,4：以差減前產(chǎn)物為模板擴增的片段；M：標準分子量SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber; Lane 1 and 3, PCR was performed using subtracted product as template. Lane 2 and 4:PCR was performed using unsubtracted product as template. M:DNA size markers圖5 差減效率驗證Fig.5 Analysis of subtraction efficiency

2.6 差減文庫的PCR驗證

經(jīng)SSH消減并富集得到的cDNA片段，轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，篩選藍白班，分別隨機挑取24個白色克隆，進行巢式PCR檢測。由6圖可知，大多數(shù)插入片段長度約在250～900 bp，符合建庫要求。

SJQ：始見期文庫，CSQ：采收期文庫；泳道1～24：以隨機挑選的白色克隆為模板的PCR擴增片段SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber; Lane 1-24, RCR products using the randomly selected clones as template圖6 差減文庫中插入片段檢測Fig.6 The cDNA inserts verified by PCR

表3 樣本基因與公共數(shù)據(jù)基因對比結果統(tǒng)計Table 3 BLAST result of ESTs with the database of NR,SWISS-PROT, TREMBL, CDD and PFAM

2.7 基因的生物信息學分析

2.7.1 基因的同源性注釋 基因的同源性注釋，采用BLST方法，將樣本基因分別與SWISS-PROT、CDD、PFAM、NR和TREMBL公共數(shù)據(jù)庫進行比對，取相似度>30 %，且e<1e-5的注釋為有效注釋，合并基因得到的所有注釋詳細信息。BLAST結果顯示：能注釋上NR、SWISS-PROT、TREMBL、CDD、PFAM數(shù)據(jù)庫的樣本基因，分別有65.26 %、34.42 %、63.96 %、26.30 %、14.94 %，具體注釋上不同數(shù)據(jù)庫的基因數(shù)量分布見表3。

2.7.2 基因的COG/KOG功能分類預測 對SSH文庫的Unigene分別進行COG與KOG功能分類預測(圖7)，結果發(fā)現(xiàn)有23個Unigene能被注釋上12種COG分類中，包括：核苷酸運輸和代謝(Nucleotide transport and metabolism)、翻譯后修飾(Posttranslational modification)、蛋白質周轉與陪伴(protein turnover, chaperones)、信號轉導機制(Signal transduction mechanisms)、轉錄(Transcription)、細胞骨架(Cytoskeleton)、次生代謝產(chǎn)物生物合成、運輸和分解代謝(Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism)等類群。其中，脂質運輸和代謝(Lipid transport and metabolism)類群包含的基因最多，占比為17.39 %；同時，KOG功能分類預測也發(fā)現(xiàn)，有103個Unigene能被注釋到核苷酸運輸和代謝(Nucleotide transport and metabolism)、碳水化合物運輸和代謝(Carbohydrate transport and metabolism)、轉錄(Transcription)、細胞骨架(Cytoskeleton)、次生代謝產(chǎn)物生物合成、運輸與分解代謝(Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism)等19個KOG分類中。其中，25個基因歸屬信號轉導機制(Signal transduction mechanisms)類群，占24.27 %。

A:COG;B:KOG圖7 ESTs序列COG與KOG功能預測分析結果Fig.7 COG and KOG functional analysis of EST sequences from SSH library

表4 基因的KEGG注釋結果統(tǒng)計Table 4 KEGG analysis result of ESTs from SSH library

2.7.3 基因的KEGG注釋 利用KAAS對基因注釋進行預測，可獲得基因對應的KO號，再由KO號可將基因對應到相關的KEGG pathway上，由此，便可得基因與KEGG中酶注釋的關系以及映射到pathway上的相關信息。經(jīng)KEGG分析，從本實驗構建的SSH文庫中，篩選出81個預測基因，它們能注釋到48個不同的EC號，參與到92個通路的代謝中(表4)。其中，ZB281822基因，對應酶編號為EC:2.3.1.9，能映射到13個pathway中，涉及萜類化合物骨架合成(ko00900)、脂肪酸代謝(ko00071)、酮體的合成與降解(ko00072)、纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸降解(ko00280)、賴氨酸降解(ko00310)、苯甲酸降解(ko00362)、色氨酸代謝(ko00380)、丙酮酸代謝(ko00620)、乙醛酸和二羧酸代謝 (ko00630)、丙酸代謝(ko00640)、丁酸甲酯代謝(ko00650)、固氮通路(ko00720)、雙組分系統(tǒng)(ko02020)等通路。

2.7.4 基因的GO分類 利用Gene Ontology對構建的SSH文庫EST序列進行功能注釋，發(fā)現(xiàn)在生物過程(biological process)分類中，基因序列主要聚集于biological process、metabiolic process、cellular process、celluar metabolic process和primary metabolic process，基因個數(shù)均超過90個，其中Biological process達到338個；在細胞組成(cellular component)分類中，序列主要聚集于cell、cell part和intracellular；而在分子功能(Molecular Function)分類中，數(shù)量排在前三的基因序列依次為catalytic activity、binding、transferase activity。圖8顯示的是Levle2水平下的GO注釋分類結果，其中catalytic activity的基因數(shù)量最多，達到124個。

甾體皂苷的生物合成，其前半部分與三萜皂苷生物合成一樣，共享甲羥戊酸代謝途徑，得到產(chǎn)物2，3-氧化鯊烯，經(jīng)環(huán)阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase，CAS)的作用形成環(huán)阿屯醇，然后再經(jīng)氧化、脫羧、還原等反應得到膽固醇，最后經(jīng)甾體的糖基轉移酶(Steroidal Glycosyltransferase, SGT)和β-糖苷酶(26-O-beta-glucosidase)的作用下形成各種甾體皂苷[14]。對甾體皂苷合成酶的研究，早期主要集中在甾體皂苷元部分，如3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(HMGR)、鯊烯合成酶(SQS)、環(huán)阿屯醇合成酶(CAS)等[15-17]，后來研究發(fā)現(xiàn)糖鏈結構對其生理活性影響也比較大，隨后也逐漸加強了對諸如糖基轉移酶[18]、糖苷酶[19]等糖酶的研究。

本實驗通過對EST序列進行生物信息學分析，從SSH文庫中篩選了一些與皂苷合成相關的酶或蛋白基因片段，它們分屬淀粉和蔗糖代謝、二萜類化合物的生物合成、類固醇生物合成、倍半萜類和三萜生物合成、萜類化合物骨架生物合成、糖酵解等代謝途徑，如β-呋喃果糖苷酶、環(huán)阿屯醇合酶、鯊烯單加氧酶、sterol 14-demethylase、UDP-glucosyl transferase 73C等，部分序列見表5。

圖8 Level 2水平下的GO注釋分類gene數(shù)量分布Fig.8 Level 2 functional classification of sequenced cDNAs by Gene Ontology

表5 SSH文庫中部分與皂苷合成相關的ESTs生物信息學分析Table 5 Bioinformatics analysis for a few ESTs related saponin synthesis from the SSH cDNA library

3 結 論

采用抑制性差減雜交技術，本實驗室構建了襄麥冬參與甾體皂苷代謝調控基因的SSH文庫：始見期塊根消減文庫和采收期塊根消減文庫，有效基因序列308條，長度主要分布在250～1000 bp左右，片段平均長度586.99 bp；文庫樣本序列注釋上NR、SWISS-PROT、TREMBL、CDD、PFAM庫的基因分別有65.26 %、34.42 %、63.96 %、26.30 %、14.94 %；樣本中分別有23和103個Unigene可注釋上12個COG分類與19個KOG分類中；樣本中有81個預測基因，可以注釋到48種酶與映射到92個代謝通路上；樣本基因功能在Biological Process分類中聚集于cellular process和metabiolic process，在Cellular Component主要聚集于cell、cell part和intracellular，在Molecular Function分類中主要聚集于catalytic activity、binding和transferase activity。該文庫的構建，非常有助于探索和揭示甾體皂苷生物合成途徑的分子基礎。

4 討 論

抑制消減雜交是建立在抑制性PCR基礎上的一種高效的差減雜交技術，可使高豐度與低豐度mRNA達到均衡，起到富集稀少mRNA的作用，有利于篩選低拷貝差異表達基因[20]，可一次檢出上百個差異表達基因。盡管目前已經(jīng)出現(xiàn)了基于第二、三代測序技術的組學研究，但是筆者認為，SSH成本低、速度快的技術特點，非常適合樣品差異表達基因的初步篩選和探索，可作為組學大規(guī)模篩選研究的有益補充。

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