甘肅黑豬H-FABP基因克隆、SNPs篩查及生物信息學(xué)分析

農(nóng)偉倫，畢英杰，李宏旭，張 麗

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding proteins，F(xiàn)ABPs)是低分子量的胞漿蛋白質(zhì)，也是對脂肪酸有較高親和力的可溶性蛋白質(zhì)，屬于胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白超家族成員，在動物體內(nèi)大多數(shù)組織中含量豐富。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABPs能特異性地結(jié)合游離脂肪酸和其他疏水基團(tuán)，將細(xì)胞內(nèi)脂肪酸運送到甘油三酯和磷酯合成或分解的部位，促進(jìn)脂化反應(yīng)的進(jìn)行及甘油三酯的重新合成，從而增加肌內(nèi)脂肪含量(intramuscular fat，IMF)[1]。FABPs基因編碼脂肪酸結(jié)合蛋白，而脂肪酸結(jié)合蛋白是影響脂肪沉積的重要基因，對機(jī)體脂肪代謝有調(diào)控作用，研究FABPs基因多態(tài)性對揭示體脂變化規(guī)律具有重要意義[2]。據(jù)報道，脂肪酸結(jié)合蛋白已經(jīng)分離出9種類型，其中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(hear fatty acid binding proteins，H-FABP)、脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty acid binding proteins，A-FABP)、肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(live fatty acid binding proteins，L-FABP)、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(intestinal fatty acid binding proteins，I-FABP)是該家族中比較常見的4種類型[3]。H-FABP作為FABPs家族中的重要成員，參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運輸和濃度調(diào)控，使心肌和脂肪細(xì)胞中沉積甘油三酯，是影響肌內(nèi)脂肪含量的重要候選基因[4]。曹紅鶴等[5-7]研究認(rèn)為，H-FABP基因可作為杜洛克豬肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因；李長龍等[8]和李文娟等[9]研究表明，H-FABP基因多態(tài)位點的交互作用對豬和雞的肌內(nèi)脂肪含量均有顯著作用。

甘肅黑豬是甘肅省培育的第一個黑毛色肉脂兼用型豬種，主要分布在甘肅平?jīng)?、慶陽、天水、隴南等地，尤以生長速度快、繁殖力高，抗病力強(qiáng)，耐粗飼、肉鮮味美而成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶飼養(yǎng)的當(dāng)家豬種。甘肅黑豬具有與杜洛克、漢普夏、長白豬、大約克豬的雜交效果良好的種質(zhì)特性。本研究以甘肅黑豬為研究對象，克隆出H-FABP基因4個外顯子，快速篩選其多態(tài)性，利用生物信息學(xué)方法從分子水平預(yù)測和分析甘肅黑豬H-FABP蛋白質(zhì)功能，為揭示該基因理化性質(zhì)、功能信息、遺傳特性、相關(guān)生理機(jī)制及其與甘肅黑豬的生長發(fā)育和肌內(nèi)脂肪沉積等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 耳組織DNA的提取及DNA混合池構(gòu)建

于仔豬出生后1周內(nèi)采集102頭甘肅黑豬耳組織，每頭仔豬剪取耳組織3～5 g，置于裝有75%乙醇的離心管中，-70 ℃冰箱冷凍保存。采用常規(guī)的苯酚-氯仿抽提法[10]進(jìn)行耳組織DNA提取，去離子水溶解稀釋到適宜濃度后，各DNA樣品吸取5 μL構(gòu)建DNA混合池。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)布的野豬H-FABP基因序列(GenBank No.: Y16180)，應(yīng)用Primer6.0軟件設(shè)計4對特異性引物(表1)，用于擴(kuò)增甘肅黑豬H-FABP基因4個外顯子區(qū)域。引物由杭州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增、克隆及測序

PCR擴(kuò)增體系總體積為20 μL：基因組DNA模板0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，TaqPCR MasterMix 11 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃擴(kuò)增預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后條帶明亮且無雜帶、特異性良好的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒(北京天根)純化回收后，用PMD19-TVector載體連接充分混勻，恒溫連接2 h后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌(E.coli)DH5α菌株；篩選陽性克隆培養(yǎng)，培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增；菌液送至杭州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果用DNAStar、MegAlign和Editseq軟件比對和拼接獲得甘肅黑豬H-FABP基因編碼區(qū)序列。

表1H-FABP基因引物信息表

Table1Information ofH-FABPprimers

外顯子Exon引物序列(5′→3′)Sequence(5′→3′)退火溫度Annealingtemperature/℃片段長度LengthofPCRproduction/bpExon1(1200?1721)F：5′?TCTCCTCTAGTCTCTCATCTCTGT?3′R：5′?GTCGTCCTCACCAATTGACTTC?3′600521Exon2(2339?2883)F：5′?AGCCTTTGAAAATTCTTGCCCT?3′R：5′?GACACGGAGGTCAGAATATCCT?3′600544Exon3(4455?4929)F：5′?AGCTGGGCTGTCTGACTC?3′R：5′?CCTCCACCCTCCACTATC?3′590474Exon4(5167?5553)F：5′?TGAAGACCTGGTGTAAGCA?3′R：5′?ACAACAAGAACCGGAACTG?3′610386

1.4 等位基因頻率估算

1.5 生物信息學(xué)分析

利用PredictProtein在線服務(wù)器預(yù)測H-FABP蛋白二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL同源建模方法構(gòu)建H-FABP蛋白三級結(jié)構(gòu)模型，運用PyMOL軟件對突變前后DRA蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比并繪制結(jié)果視圖。對H-FABP基因CDS編碼的氨基酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)特性及功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析與預(yù)測所用各種工具軟件與網(wǎng)址見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘肅黑豬H-FABP基因PCR擴(kuò)增

甘肅黑豬H-FABP基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得如圖1所示的清晰明亮、長度約為300～600 bp的條帶，與預(yù)期的目的片段大小一致。

2.2 甘肅黑豬H-FABP基因SNPs篩選及等位基因頻率估算

對測序結(jié)果進(jìn)行比對篩查出4個SNP位點(圖2)，其中在甘肅黑豬H-FABP基因第一內(nèi)含子734 bp處發(fā)生C→T突變，命名為C734T-Intron1；第二外顯子152 bp處發(fā)生T→C突變，命名為T152C-Exon2，為錯義突變，氨基酸由原來的異亮氨酸(Ile)轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(Thr)；第二內(nèi)含子30 bp處發(fā)生G→A突變，命名為G30A-Intron2；第二內(nèi)含子121 bp處發(fā)生T→G突變，命名為T121G-Intron2。

由表3可知，等位基因頻率在突變前后存在明顯差異，除了T121G-Intron2位點突變前后等位基因頻率相差不大外，其余3個SNPs位點的等位基因頻率突變前后均存在明顯差異。

表2蛋白結(jié)構(gòu)功能預(yù)測方法及相關(guān)網(wǎng)址

Table2The method of prediction about protein structure or function and related web sites

名稱Name軟件及網(wǎng)址Softwareandwebsite蛋白質(zhì)疏水性/親水性分析Proteinhydrophobicity/Hydrophilicityanalysishttp：//web．expasy．org/protscale/蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Proteinsecondarystructurepredictionhttp：//npsa?pbil．ibcp．fr/cgi?bin/npsa＿automat．pl？page=npsa＿sopma．html蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)Tertiarystructureofproteinhttp：//swissmodel．expasy．org/，PyMOL同源系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析PhylogenetictreeanalysisofhomologoussystemsDNAStar，MegAlign

M, 2 000 bp DNA marker；泳道1～4, H-FABP基因Exon1-Exon4 PCR產(chǎn)物。M, 2 000 bp DNA marker; Lane 1～4, PCR product of Exon1-Exon4.圖1 甘肅黑豬H-FABP基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果Fig.1 Agarose gel results of the PCR amplicons of H-FABP gene in Gansu black pigs

2.3 甘肅黑豬H-FABP編碼氨基酸理化性質(zhì)的預(yù)測和分析

甘肅黑豬H-FABP蛋白編碼133個氨基酸，20種氨基酸所占比例如表4，亮氨酸(Thr)數(shù)目最多，占整個氨基酸組成的14.3%，半胱氨酸(Cys)以及脯氨酸(Pro)數(shù)目最少，各占0.8%，負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為18，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為17。其分子式為C653H1052N172O206S4，分子質(zhì)量為14 720，半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為14.42。

2.4 甘肅黑豬H-FABP氨基酸疏水性/親水性預(yù)測和分析

甘肅黑豬H-FABP編碼氨基酸序列親水性/疏水性預(yù)測結(jié)果如圖4所示，第113位賴氨酸(Lys)疏水性最強(qiáng)(+1.289)，第76位的丙氨酸(Ala)親水性最強(qiáng)(-2.444)。整條氨基酸肽鏈中，親水氨基酸占62.15%，疏水氨基酸占37.85%，總平均親水性為-0.248。

圖2 測序分析結(jié)果Fig.2 Results of sequencing

表3甘肅黑豬H-FABP基因SNPs位點突變類型及等位基因頻率

Table3SNPs locus mutation types and allele frequency ofH-FABPgene in Gansu black pig

突變位點Mutantsite突變類型Mutationtype氨基酸變化Aminoacidvariation等位基因頻率Allelefrequency突變前頻率Beforemutation突變后頻率AftermutationC734T?Intron1——0625003750T152C?Exon2錯義突變MissensemutationIle→Thr0608603914G30A?Intron2——0695603044T121G?Intron2——0529404706

表4豬H-FABP編碼蛋白的氨基酸組成

Table4The amino acid composition of porcine H-FABP encoded protein

氨基酸Aminoacid數(shù)量Number頻率Frequency/%氨基酸Aminoacid數(shù)量Number頻率Frequency/%氨基酸Aminoacid數(shù)量Number頻率Frequency/%Ala(A)753Gly(G)1075Pro(P)108Arg(R)430His(H)215Ser(S)753Asn(N)430Ile(I)860Thr(T)19143Asp(D)1075Leu(L)1075Val(V)1290Cys(C)108Lys(K)1398Trp(W)215Gln(Q)430Met(M)323Tyr(Y)215Glu(E)860Phe(F)645

正值,疏水；負(fù)值,親水。Positive value, hydrophobicity; negative value, hydrophilicity.圖4 甘肅黑豬H-FABP蛋白的疏水性預(yù)測結(jié)果Fig.4 The hydrophobicity prediction of H-FABP protein in Gansu black pig

2.5 甘肅黑豬H-FABP蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

使用在線軟件http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html對甘肅黑豬H-FABP蛋白二級結(jié)構(gòu)組分進(jìn)行分析顯示，α-螺旋(Hh)占25.56%，β-折疊(Ee)占36.84%，β-轉(zhuǎn)角(Tt)占12.03%，無規(guī)則卷曲(Cc)占25.56%。H-FABP蛋白二級結(jié)構(gòu)中，β-折疊占主導(dǎo)地位。從三級結(jié)構(gòu)(圖5)預(yù)測結(jié)果來看，三級結(jié)構(gòu)主要成分為β-折疊，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

h, α螺旋；e, β-折疊；t, β-轉(zhuǎn)角；c, 無規(guī)則卷曲。h, Alpha helix; e, Extended strand; t, Beta turn; c, Random coil.圖5 甘肅黑豬H-FABP蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Prediction result of H-FABP protein secondary structure in Gansu black pigs

2.6 甘肅黑豬H-FABP基因同源性分析

使用DNAStar軟件對10個物種的H-FABP基因編碼產(chǎn)物序列進(jìn)行同源性分析(圖6)可知，H-FABP基因幾乎在所有的哺乳動物中都有表達(dá)。從進(jìn)化樹分析結(jié)果來看進(jìn)化樹分為兩支，其中偶蹄目聚為一類，鰻鱺目聚為一類。其中豬H-FABP基因的親緣關(guān)系與野驢最近，這一結(jié)果符合動物分類學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

豬 Sus scrofa；野驢 Equus asinus；綿羊Ovis aries；牛Bos taurus；褐家鼠 Rattus norvegicus；原雞 Gallus gallus；鼠耳蝠 Myotis lucifugus；山羊Capra hircus；金頭鯛 Sparus aurata；日本鰻鱺 Anguilla japonica。圖6 甘肅黑豬H-FABP基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 A phylogenetic tree of amino acid system encoding protein of H-FABP gene in Gansu black pig

3 討論

FABPs家族基因作為影響豬肉嫩度、風(fēng)味的肉質(zhì)基因，其4種主要家族基因中的H-FABP基因作為編碼脂肪酸結(jié)合蛋白基因，是影響肉質(zhì)性狀的主效基因或候選基因[11]。林萬華等[12]研究表明，江蘇二花臉豬H-FABP基因?qū)MF有直接的生理生化基礎(chǔ)作用。國外豬種的IMF相對國內(nèi)豬種來說普遍偏低，含量基本在2%～4%，也就是說國外豬種在口感上相對國內(nèi)豬種較好[13]。據(jù)報道，肌內(nèi)脂肪的脂肪酸還與人體健康密切相關(guān)，人體攝入的脂肪酸的量與某些疾病如冠心病、心臟病等相關(guān)[14]。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性?；蚪MDNA上的任何堿基都有可能發(fā)生變異，因此SNPs既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能發(fā)生在基因以外的非編碼序列上。相對來說，位于編碼區(qū)內(nèi)的CSNP(coding SNP，CSNP)比較少，因為在外顯子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。本研究主要篩查甘肅黑豬H-FABP基因編碼區(qū)內(nèi)SNP，基因外顯子編碼區(qū)的SNPs通常稱為功能CSNPs，致使氨基酸編碼發(fā)生改變的功能SNPs對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有顯著影響[15]，本研究中外顯子2第152C位點堿基發(fā)生突變，氨基酸由異亮氨酸(Ile)變成蘇氨酸(Thr)，引起錯義突變，且錯義突變氨基酸水平的極性發(fā)生改變，由不帶電荷的極性氨基酸變成帶電荷的非極性氨基酸，但其三級結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，而其他SNPs位點為同義突變且不在編碼區(qū)，不會對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成影響，但外顯子2內(nèi)的錯義突變可能會對蛋白質(zhì)造成隱性影響。因此，對蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測可對該蛋白的結(jié)構(gòu)功能更深入了解，利用蛋白質(zhì)預(yù)測在線網(wǎng)站對該基因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，進(jìn)而來預(yù)測功能基因的位置，獲得與其生物學(xué)功能相關(guān)的數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)功能預(yù)測是以目的基因的氨基酸序列為依據(jù)，通過與已知相似蛋白功能的對比進(jìn)而推測獲得目的蛋白的相應(yīng)功能[16]。柴志欣等[16]研究表明，麥洼牦牛H-FABP編碼蛋白為疏水性蛋白；高紅等[17]認(rèn)為，不同物種H-FABP編碼蛋白均為疏水蛋白；而本研究發(fā)現(xiàn)，甘肅黑豬H-FABP編碼蛋白為親水性蛋白，原因可能由于H-FABP在不同物種之間編碼蛋白不同所導(dǎo)致。盤道興等[18]在江口蘿卜豬H-FABP外顯子2中發(fā)現(xiàn)存在G113A-Exon2的錯義突變，而本研究在甘肅黑豬H-FABP基因第二外顯子的152 bp處發(fā)現(xiàn)存在一個T152C-Exon2的錯義突變，氨基酸由原來的異亮氨酸(Ile)轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(Thr)。曹健等[19]在甘南牦牛H-FABP基因第3外顯子處發(fā)現(xiàn)一同義突變，編碼區(qū)域非編碼區(qū)的同義突變不同，編碼區(qū)同義突變雖然不影響編碼的氨基酸序列，但可能引起外顯子的拼接增強(qiáng)，從而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)量，在一定程度上會改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的正常功能。內(nèi)含子是一段特殊的DNA序列，處在非編碼區(qū)，不參與蛋白質(zhì)的編碼。但在轉(zhuǎn)錄后的加工中，若內(nèi)含子對應(yīng)的mRNA片段沒有被除去，可能會發(fā)生非常大的突變，相對外顯子來說內(nèi)含子有更多的突變，本研究發(fā)現(xiàn)甘肅黑豬H-FABP基因存在4個SNPs，其中3個SNPs在內(nèi)含子上。研究表明，真核mRNA內(nèi)含子的存在都可以大大提高轉(zhuǎn)基因生物的基因表達(dá)[20]。mRNA前體的選擇性剪接極大地增加了蛋白質(zhì)的多樣性及基因表達(dá)的復(fù)雜程度，可以使相同的mRNA前體產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。精細(xì)的協(xié)調(diào)基因的功能，也可以直接影響相應(yīng)基因的編碼信息[21]。王立剛等[22]研究發(fā)現(xiàn)，影響IMF含量的兩個酶切位點，其中一個經(jīng)過驗證是在第1內(nèi)含子區(qū)域，表明基因在表達(dá)過程中內(nèi)含子的突變起到了作用，從而影響了胞內(nèi)脂肪酸的沉積。

在蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，既含有決定蛋白質(zhì)定位和功能的靶向信號和修飾信號，還含有決定蛋白質(zhì)壽命的信號，這種信號存在于蛋白質(zhì)N端的第一個氨基酸殘基，且第一個氨基酸是Met、Ser、Thr、Ala等氨基酸，則蛋白質(zhì)往往是穩(wěn)定的。研究表明，同一種蛋白質(zhì)在不同的細(xì)胞中或不同的環(huán)境中也表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性，并且蛋白質(zhì)半衰期越長則蛋白質(zhì)穩(wěn)定性越高[23]。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)指它的多肽鏈中有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象，二級結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角，對其進(jìn)行預(yù)測和分析有助于研究該蛋白質(zhì)的功能。本研究中甘肅黑豬H-FABP基因編碼區(qū)全長為402 bp，編碼133個氨基酸殘基，產(chǎn)物氨基酸具有較長的半衰期(30 h)，亮氨酸(Thr)數(shù)量最多，該蛋白是一種穩(wěn)定蛋白；在該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，β-折疊占主導(dǎo)地位，三級結(jié)構(gòu)主要成分為β-折疊，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。甘肅黑豬H-FABP基因預(yù)測結(jié)果顯示，二級結(jié)構(gòu)中Hh<30%，Ee>30%，由此可推測黑豬H-FABP蛋白為混合型二級結(jié)構(gòu)[24]。無規(guī)則卷曲易受側(cè)鏈相互影響而改變空間構(gòu)象，α螺旋和無規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)肽鏈中構(gòu)成配體受體結(jié)合的活性部位[25]，H-FABP蛋白質(zhì)肽鏈中的某些氨基酸可導(dǎo)致其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響其與受體結(jié)合的親和力及其生物學(xué)活性，進(jìn)而影響豬肉中肌內(nèi)脂肪含量的分布，影響豬肉的品質(zhì)。在編碼蛋白質(zhì)基因中H-FABP基因編碼脂肪酸結(jié)合蛋白，影響著肌內(nèi)脂肪沉積[26]，肌內(nèi)脂肪是一個極其重要的指標(biāo)，與肉質(zhì)密切相關(guān)，主要影響肉的嫩度、風(fēng)味及多汁性等。種間H-FABP基因編碼區(qū)有很高同源性，可以表現(xiàn)在所編碼氨基酸或DNA序列上，這可能造成不同物種間相同H-FABP編碼出來的蛋白質(zhì)具有明顯的差異，可能表現(xiàn)在蛋白質(zhì)的親水性或可溶性上。對H-FABP基因進(jìn)行遺傳生物信息學(xué)分析對動物種質(zhì)資源的保護(hù)具有重要的生物學(xué)意義，與此同時研究H-FABP基因可以為甘肅黑豬的分子遺傳育種提供一定科學(xué)理論依據(jù)。

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