棘胸蛙腦膜炎敗血伊麗莎白菌的分離鑒定及其感染的病理損傷

雷雪平，耿 毅，*，余澤輝，鄭李平，曹師琪，黃小麗，陳德芳，歐陽萍，劉愷睿

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) a.動物醫(yī)學(xué)院; b. 水產(chǎn)系，四川 成都 611134)

腦膜炎敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)，曾稱腦膜炎膿毒黃桿菌(Flavobacteriummeningosepticum)或腦膜炎敗血金黃桿菌(Chryseobacteriummeningosepticum)，是一種廣泛分布于自然界和醫(yī)院環(huán)境的G-桿菌[1-2]。該菌是一種重要的人與動物共患條件致病菌，在人類可引起腹膜炎、肺炎、腦膜炎、蜂窩組織炎、敗血癥和眼部感染等，同時也可以感染禽類、貓、犬和魚類等動物，其感染的宿主范圍在不斷擴(kuò)大[3-6]，給人類與動物健康均造成嚴(yán)重威脅。

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)，俗稱石蛙、石雞等，屬蛙科、棘蛙屬，其棲息地主要分布在中國南部和越南北部[7-8]。棘胸蛙肉質(zhì)細(xì)嫩，味道甘美，同時具有很高的藥用價值，由于人為捕捉和棲息地范圍的縮小，野生棘胸蛙種群數(shù)量急速減少，已被中國物種紅色名錄列為易危等級，并于2004年被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)評估為全球性易危種[9-10]。為了保護(hù)和利用棘胸蛙，其養(yǎng)殖業(yè)逐漸在全國各地興起并形成了一定的規(guī)模，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，病害問題日益突出。2016年4月在四川雅安某棘胸蛙養(yǎng)殖場流行一種以白內(nèi)障、體表出血潰瘍及神經(jīng)癥狀為特征的高發(fā)病率和死亡率的傳染病。本研究從患病蛙體內(nèi)分離出一株G-短桿菌(CM160701)并鑒定其為腦膜炎敗血伊麗莎白菌(E.meningoseptica)，同時進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)、人工感染試驗(yàn)和病理損傷觀察，以期為棘胸蛙養(yǎng)殖中該疾病的診斷與防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病棘胸蛙采自四川雅安某養(yǎng)殖場，體質(zhì)量145.3～162.0 g；健康棘胸蛙體質(zhì)量134.2～150.7 g，采自雅安天全某養(yǎng)殖場。腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)(北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)；MH 培養(yǎng)基(杭州微生物試劑有限公司)；細(xì)菌DNA 提取試劑盒 [天根生化科技(北京)有限公司]；藥敏紙片(杭州天和微生物試劑有限公司)；細(xì)菌生化微量鑒定管(杭州微生物試劑有限公司)。

1.2 剖檢及病原菌的分離純化

對患病棘胸蛙進(jìn)行剖檢，取肝、脾、腎等組織于載玻片涂片，革蘭氏染色并觀察。在無菌條件下，從病蛙的肝、脾、腎取樣劃線接種于BHIA，28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，挑取形態(tài)大小一致的優(yōu)勢菌落于BHIA進(jìn)一步純化，獲得純培養(yǎng)菌株，觀察菌落及細(xì)菌形態(tài)特征，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人工感染試驗(yàn)

將獲得的優(yōu)勢純化菌株接種于BHI 平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用0.8%無菌生理鹽水洗下，麥?zhǔn)媳葷岱▽⒓?xì)菌濃度調(diào)整為1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108cfu·mL-1。健康棘胸蛙室內(nèi)暫養(yǎng)7 d后，每只腹腔注射0.2 mL，每組10只，對照組注射等量生理鹽水。接種后每天觀察棘胸蛙的臨床癥狀和死亡情況，連續(xù)觀察14 d，并對死亡蛙及時剖檢和病原菌再次分離與鑒定。

1.4 分離菌生理生化和藥敏試驗(yàn)

生理生化試驗(yàn)根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》對細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。藥敏試驗(yàn)參照CLSI抗微生物藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采用Kriby-Bauer紙片擴(kuò)散法進(jìn)行。將分離菌接種BHI 液體培養(yǎng)基，28 ℃ 震蕩培養(yǎng) 24 h，調(diào)整菌液濃度為1.0×108cfu·mL-1，將菌液均勻涂布MH平板，貼上藥敏紙片，28 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈大小，根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果，同時以大腸埃希氏菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.5 分離菌16S rDNA基因測序與系統(tǒng)發(fā)育分析

使用細(xì)菌DNA提取試劑盒抽提新鮮菌液的DNA作為模板。采用擴(kuò)增16S rDNA基因的通用引物 (F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R:5′-TACG GCTACCTTGTTACGAC -3′)[11]擴(kuò)增預(yù)期1 500 bp大小的16S rDNA基因片段。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照余澤輝等[12]的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后，送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果與GenBank 中已知核酸序列進(jìn)行BLAST分析,采用DNA star軟件的Seqman程序進(jìn)行多序列比對，MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 組織病理學(xué)觀察

取患病棘胸蛙的心、肝、脾、肺、腎、肌肉等組織，10%中性福爾馬林緩沖液固定，石蠟包埋切片，HE染色，中性樹脂膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察病理變化并照相。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)與剖檢變化

患病棘胸蛙食欲減退或喪失，體表發(fā)黑，頭頸歪斜，身體失去平衡，在水中間歇性游動打轉(zhuǎn)；腹部膨脹，四肢腫大，腳趾蜷曲，腿部肌肉出血(圖1-A)；部分棘胸蛙的皮膚可見潰瘍灶(圖1-B)，眼球角膜發(fā)白，渾濁呈“白內(nèi)障”表現(xiàn)(圖1-C)。從發(fā)病到死亡時間一般為2～4 d。剖檢見病蛙腹腔有一定量淡黃色，透明腹水，肝臟腫大，瘀血，呈花斑狀(圖1-D)；脾腫大，呈紫黑色；腦膜充血，神經(jīng)癥狀嚴(yán)重的病例見腦軟化；部分病蛙腸壁變薄呈半透明狀，其內(nèi)充滿透明黏液。

2.2 病原菌的分離與純化

病蛙內(nèi)臟組織涂片，革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)有G-短桿菌。無菌操作從病蛙肝、脾和腎內(nèi)分離到一株優(yōu)勢菌(CM160701)，其在BHI平板上的菌落形態(tài)為表面光滑濕潤、邊緣整齊、不透明的淡黃色小菌落，直徑為0.78～0.96 mm。革蘭氏染色鏡檢為G-，呈短直桿狀，菌體約長2～3 μm，單個排列。

2.3 人工感染試驗(yàn)

分離菌腹腔注射感染健康棘胸蛙，攻毒12 h后，試驗(yàn)蛙安靜反應(yīng)遲鈍；1.0×108cfu·mL-1濃度組在24 h后開始出現(xiàn)死亡，1.0×107、1.0×106與1.0×105cfu·mL-1濃度組相繼在32 h后開始死亡；發(fā)病蛙的臨床表現(xiàn)和病理變化與自然發(fā)病蛙相似，感染5 d后各試驗(yàn)組蛙未再發(fā)生死亡；而對照組無任何異常，各組的死亡情況見表1。采用寇氏法得出分離菌對棘胸蛙的LD50為1.19×106cfu·只-1。從人工感染發(fā)病死亡的棘胸蛙體內(nèi)再次分離細(xì)菌，獲得與感染接種菌形態(tài)、理化特性與16S rDNA基因序列一致的菌株。

A，后肢腫脹，出血與潰瘍(箭頭)；B，體表潰瘍(箭頭)；C，白內(nèi)障(箭頭)；D，腹水，脾腫大(黑色箭頭)，肝腫大(白色箭頭)A， Limbs swelling， bleeding and ulcer foci (arrows); B， Skin ulcer (arrow); C， Cataract of the frog (arrow); D， Ascites’ splenomegaly (black arrow)， hepatomegaly (white arrow)圖1 患病棘胸蛙臨床特征Fig.1 Clinical symptoms in infected Q. spinosa

2.4 分離菌生理生化特性與藥敏試驗(yàn)

分離菌株的生理生化特性見表2，其與腦膜炎敗血伊麗莎白菌生理生化特性基本一致。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該分離株僅對氟苯尼考敏感，對阿莫西林、氨芐西林、頭孢唑林、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、丁胺卡那、鏈霉素、慶大霉素、紅霉素、阿奇霉素、復(fù)方新諾明與林可霉素耐藥，具有強(qiáng)耐藥性。

表1菌株CM160701人工感染試驗(yàn)結(jié)果

Table1Artificial infection results of the strain CM160701

注射濃度Concentration/(cfu·mL-1)數(shù)量/只Number累計(jì)死亡數(shù)Accumulativedeathnumber1d2d3d4d5d6d7?14d死亡率Mortality/%10×1051．0×1061．0×1071．0×108對照組Control1010101010000000113003470157901581001581001581001050801000

表2分離株CM160701生理生化特性

Table2Comparison of phenotypic characteristics of strain CM160701 andE.meningoseptica

項(xiàng)目Items菌株strainCM160701E．meningoseptica革蘭氏染色Gramstain細(xì)菌形態(tài)Cellularmorphology運(yùn)動性Motility生長Growth 4℃ 27℃ 37℃ 40℃氧化酶Oxidase觸酶Catalase脲酶Urease葡萄糖Glucose麥芽糖Maltose甘露醇Mannitol木糖Xylose蔗糖Sucrose乳糖Lactose阿拉伯糖Arabinose纖維二塘Cellobiose鼠李糖Rhamnose棉子糖Raffinose水楊苷Salicin淀粉Starch七葉靈Esculin吲哚試驗(yàn)IndoleproductionH2S試驗(yàn)H2Sproduction明膠Gelatine檸檬酸鹽Citrateutilization-短桿狀Shortrod--++-++-+++--+------++-+--短桿狀Shortrod-ndnd+nd+ndvv+v--v------+v-+v

+，陽性；-，陰性；v， 可變反應(yīng)；nd，無參考數(shù)據(jù)。

+， Positive; -， Negative; v， Variable reactions; nd， No data available.

2.5 分離菌 16S rDNA基因測序與系統(tǒng)發(fā)育分析

以分離菌株的DNA為模板，擴(kuò)增的16S rDNA基因條帶與預(yù)期相符(GenBank 獲得登錄號為KY930330)，測序后在GenBank進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示分離菌與GenBank上E.meningoseptica的同源性最高，達(dá)100%；基于分離菌的16S rDNA 基因序列及GenBank 中黃桿菌屬其他細(xì)菌16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，分離菌與E.meningoseptica聚為一支(圖2)。

2.6 組織病理學(xué)觀察

患病蛙骨骼肌纖維變性，呈波浪狀，橫紋消失，胞質(zhì)紅染均質(zhì)無結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重者斷裂或溶解，呈條索狀或團(tuán)塊狀(圖3-A)。心肌纖維腫脹，橫紋消失，顆粒變性、空泡變性，甚至壞死，肌間隙出血、大量炎癥細(xì)胞浸潤(圖3-B)。肝血竇擴(kuò)張，淤血，肝細(xì)胞腫脹，廣泛性空泡變性(圖3-C)，并在肝小葉內(nèi)見肝細(xì)胞核濃縮、溶解，細(xì)胞崩解形成的灶性壞死及細(xì)菌團(tuán)塊(圖3-D)。脾髓內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著減少，白髓體積縮小甚至消失，紅髓淤血、出血，網(wǎng)狀細(xì)胞大量增生(圖3-E)。腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞大量增生，血管球充血，腎小囊內(nèi)充滿均質(zhì)紅染蛋白樣滲出物(圖3-F)，腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性與空泡變性，局部區(qū)域腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落，腎小管管腔內(nèi)大量蛋白或脫落的上皮細(xì)胞形成管型，腎間質(zhì)局灶性出血，炎癥細(xì)胞浸潤。腦膜疏松，毛細(xì)血管淤血，腦基質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞大量增生(圖3-G)，神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，染色加深，增生的小膠質(zhì)細(xì)胞圍繞在其周圍形成“衛(wèi)星”現(xiàn)象或呈“噬神經(jīng)元”現(xiàn)象(圖3-H)。

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的分離菌 CM160701與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of CM160701 and related strains based on 16S rDNA sequences

A， 肌纖維壞死、溶解； B， 心肌變性壞死，出血，炎癥細(xì)胞浸潤(箭頭)； C， 肝淤血，肝細(xì)胞顆粒變性與空泡變性； D， 肝小葉內(nèi)固縮的肝細(xì)胞(白色箭頭)與細(xì)菌團(tuán)塊(黑色箭頭)； E， 脾淤血，網(wǎng)狀細(xì)胞增生，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少； F， 腎小囊內(nèi)大量滲出液(箭頭)，間質(zhì)出血與炎癥細(xì)胞浸潤； G， 小膠質(zhì)細(xì)胞大量增生； H， 腦內(nèi)神經(jīng)元壞死，出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象與噬神經(jīng)元現(xiàn)象(箭頭)。HE染色A， Necrosis and cytolysis of muscle fibers appeared in the muscle; B， Degeneration， necrosis in myocardial fibers， hemorrhage and inflammatory cells infiltration (arrow); C， Hepatic congestion， granular degeneration and vacuolar degeneration of hepatocytes; D， Necrotic hepatocyte in the hepatic lobule (white arrows)， bacterial clumps (black arrow); E， Splenic congestion， proliferation of reticular cells and lymphocytes depletion in the spleen; F， Protein-like precipitate in renal capsule (arrows)， interstitial hemorrhage and infiltration of inflammatory cells; G， Microglia proliferation in the brain; H， Necrotic neurons， satellitosis and neuronophagia phenomenon (arrows). HE staining圖3 感染E. meningoseptica棘胸蛙的病理組織學(xué)觀察結(jié)果Fig.3 Histopathological lesions in infected Q. spinosa

3 討論

腦膜炎敗血伊麗莎白菌(E.meningoseptica)作為一種人與動物共患的病原菌不僅對人類健康造成威脅，也對禽、貓與犬等多種動物造成嚴(yán)重危害?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，該菌可感染爪蟾(Xenopuslaevis)[13-14]、美國牛蛙(Ranacatesbeiana)[15-16]、豹蛙(Ranapipiens)[17]、虎紋蛙(Ranatigerinarugulosa)[18]等蛙類并引起大量死亡；本研究表明，E.meningoseptica對健康棘胸蛙具有較強(qiáng)的致病性，且可自然感染棘胸蛙并造成大量死亡，由此可見，E.meningoseptica可能是蛙類的一種重要病原，對蛙類健康造成嚴(yán)重威脅。近幾十年來，全球范圍內(nèi)蛙類等兩棲動物種群數(shù)量快速下降，已有研究表明，蛙病毒(ranavirus)病、壺菌病(chytridiomycosis)等傳染性疾病在兩棲動物種群數(shù)量下降中有重要作用。鑒于E.meningoseptica對蛙類危害的嚴(yán)重性，其是否會是又一威脅其種群數(shù)量的病原值得人們關(guān)注[19-20]。

在本研究中，患病棘胸蛙臨床特征主要表現(xiàn)為食欲減退、行動遲緩、白內(nèi)障、皮膚出血潰瘍、四肢腫脹和神經(jīng)癥狀等，與先前報(bào)道的美國牛蛙與虎紋蛙等感染E.meningoseptica相似[15，18]，其中白內(nèi)障與神經(jīng)癥狀具有代表性，可以作為臨床上診斷該病的一個重要參考依據(jù)。組織病理研究發(fā)現(xiàn)，E.meningoseptica感染棘胸蛙可導(dǎo)致全身多器官組織損傷，尤其是腦、心、肝、脾與腎等組織損傷嚴(yán)重，表現(xiàn)為明顯的變性、壞死和炎癥反應(yīng)，致多組織器官功能障礙而引起感染蛙的死亡。感染蛙腦神經(jīng)元表現(xiàn)為明顯的變性、壞死，小膠質(zhì)細(xì)胞大量增生，出現(xiàn)“衛(wèi)星”現(xiàn)象或“噬神經(jīng)元”現(xiàn)象，這應(yīng)當(dāng)是臨床上感染蛙出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的病變基礎(chǔ)，但對于E.meningoseptica是如何突破血腦屏障對腦導(dǎo)致?lián)p傷的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究；同時研究中也發(fā)現(xiàn)免疫器官脾臟的淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著減少，網(wǎng)狀細(xì)胞大量增生，表明該菌對蛙的免疫系統(tǒng)也有明顯的損傷，對于其損傷的發(fā)生機(jī)制值得進(jìn)一步探索。

由于E.meningoseptica可產(chǎn)生包括金屬類β-內(nèi)酰胺酶和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶在內(nèi)的多種β-內(nèi)酰胺酶，常具有多重耐藥性，尤其對碳青霉烯類抗生素、頭孢類抗生素耐藥更明顯[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，該E.meningoseptica分離株對測試的大多數(shù)抗生素表現(xiàn)出耐藥性，僅對氟苯尼考敏感，在實(shí)際處理中推薦使用氟苯尼考成功控制了疫情。藥敏試驗(yàn)結(jié)果與李明等[23]分離的E.meningoseptica在藥物敏感上有較大差異，表明在不同時間不同地域的分離株耐藥表型可能不同，提示在臨床上應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇用藥，提高用藥的有效性。但由于抗生素的使用易導(dǎo)致新耐藥菌株的產(chǎn)生以及環(huán)境污染，因此，針對蛙類E.meningoseptica感染的防控，應(yīng)在研究疫苗、免疫增強(qiáng)劑及中草藥制劑等方面積極開展探索，以減少抗生素的使用；同時，在如徹底的消毒、水質(zhì)調(diào)整、降低養(yǎng)殖密度和減少應(yīng)激等養(yǎng)殖環(huán)境控制與飼養(yǎng)管理上也應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的改善工作以降低該病的發(fā)生風(fēng)險。

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