新魚腥草素鈉對小鼠鮑曼不動桿菌肺感染模型的保護(hù)作用

張怡敏，周雪寧，張宏方，環(huán) 誠，葉崢嶸

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)病原微生物及檢驗(yàn)教研室，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 咸陽 712000)

鮑曼不動桿菌為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界，屬于條件致病菌[1-2]。研究[3]表明，鮑曼不動桿菌已經(jīng)成為醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌，主要存在于重癥監(jiān)護(hù)病房和呼吸科，常引起呼吸系統(tǒng)感染，也可引發(fā)菌血癥、手術(shù)部位感染等。鮑曼不動桿菌感染致死率接近50%。此外，由于細(xì)菌耐藥的現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重，鮑曼不動桿菌的治療變得愈加困難[4]。因此，臨床上迫切需要發(fā)展針對鮑曼不動桿菌的新療法和干預(yù)策略。

魚腥草是一種傳統(tǒng)中藥，其性味辛寒，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋等功效，可用于治療肺膿潰瘍、肺熱咳喘、熱痢熱淋、水腫、腳氣、尿路感染、癰腫瘡毒等癥，因此魚腥草往往用于治療肺病、泌尿系統(tǒng)疾病[5-6]。魚腥草素是傳統(tǒng)中藥魚腥草的主要活性成分，化學(xué)名稱為癸酰乙醛，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有抗菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種作用[7]。由于該物質(zhì)不穩(wěn)定，目前臨床上常使用十二酰乙醛的亞硫酸氫鈉加成物，即新魚腥草素鈉。本研究通過制備小鼠鮑曼不動桿菌感染的肺炎模型，預(yù)先給予新魚腥草素鈉治療，觀察魚腥草素對鮑曼不動桿菌性肺炎的防治效果。

1 材料

1.1 動物 80只雄性C57BL/6小鼠，8～12周齡，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(小鼠合格證編號:20150073)，飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境中，能夠自由攝取食物和飲水。

1.2 菌株 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房分離的鮑曼不動桿菌菌株，經(jīng)過法國生物梅里埃API鑒定系統(tǒng)常規(guī)鑒定。

1.3 試劑 小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β， IL-1β) ELISA檢測試劑盒：上海潤裕生物科技有限公司；新魚腥草素鈉注射液：江西瑞金三九藥業(yè)有限公司。

1.4 儀器 BX53M光學(xué)顯微鏡：日本奧林巴斯公司；Appliskan 多功能讀數(shù)儀：美國賽默飛世爾公司。

2 方法

2.1 菌液制備 將臨床分離的鮑曼不動桿菌接種至瓊脂糖培養(yǎng)板，放置于37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，用滅菌牙簽挑取單個菌落轉(zhuǎn)接至含5～8 mL LB培養(yǎng)液的搖菌管中，置于搖床中37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，取5 mL細(xì)菌液4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，采用1 mL無菌生理鹽水重懸，用比濁法測定并調(diào)整菌液濃度為1×108集落形成單位(colony-forming units， CFU)/mL。

2.2 模型制備 80只C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量為18～20 g，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)化分組，分為對照組、肺炎模型組、低劑量(5 mg/kg)新魚腥草素鈉組和高劑量(10 mg/kg)新魚腥草素鈉組，每組20只，各組小鼠于模型制備前4 d和前1 d，通過腹腔注射環(huán)磷酰胺(50 mg/kg) ，以抑制小鼠免疫功能，其中低劑量新魚腥草素鈉組和高劑量新魚腥草素鈉組在手術(shù)前4 d開始每天通過腹腔注射給予新魚腥草素鈉注射液，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。小鼠經(jīng)4%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，用注射器將100 μL菌液注入氣道，對照組注射等量生理鹽水，注射完畢，待小鼠復(fù)蘇后正常飼養(yǎng)，觀察小鼠生存狀態(tài)，根據(jù)文獻(xiàn)[8]介紹的方法進(jìn)行，若小鼠接種后出現(xiàn)明顯的呼吸急促、活動減少、反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)雜亂等表現(xiàn)，表明模型復(fù)制成功。

2.3 細(xì)菌學(xué)定量 在接種后24、72 h每組分別用頸椎脫臼方式處死5只小鼠，摘除肺組織，加入適量無菌生理鹽水后勻漿，通過70 μm孔徑的濾膜過濾，用無菌生理鹽水10倍稀釋后取100 μL樣品接種至瓊脂培養(yǎng)板進(jìn)行37 ℃培養(yǎng)過夜，計數(shù)鮑曼不動桿菌的菌落數(shù)量。

2.4 小鼠肺組織病理學(xué)觀察 每組各取小鼠5只，在接種后72 h處死小鼠，收集右側(cè)肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，觀察比較各組小鼠肺組織病理學(xué)變化。

2.5 支氣管肺泡沖洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)炎性細(xì)胞檢測 每組各取小鼠5只，同樣方法麻醉小鼠，切開氣管，注入0.5 mL PBS溶液進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，反復(fù)3次。將回收到的液體混勻，收集BALF中全部細(xì)胞，用血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，Hema-3染色后用細(xì)胞涂片進(jìn)行細(xì)胞分類。

2.6 ELISA檢測 每組各取小鼠5只，小鼠處死前通過心臟采血方法收集1 mL血液，分離血清，檢測血清中細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β水平。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠狀態(tài)觀察 在麻醉、插管、接種等操作過程中無小鼠死亡，對照組小鼠活動、進(jìn)食無異常。肺炎模型組小鼠接種鮑曼不動桿菌后6 h，出現(xiàn)明顯的呼吸急促、活動減少、反應(yīng)遲鈍的表現(xiàn)；接種后24 h，上述癥狀進(jìn)一步加重，并出現(xiàn)攝食減少、毛發(fā)雜亂、蜷縮、渾身顫抖等病變加重的征象；72 h后小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸困難、反應(yīng)遲鈍、渾身顫抖、體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)。新魚腥草素鈉組小鼠接種鮑曼不動桿菌后也出現(xiàn)呼吸急促、活動減少的現(xiàn)象，但是與肺炎模型組相比，癥狀較為輕微。

3.2 各組小鼠肺內(nèi)和血液中細(xì)菌計數(shù)比較 在檢測的各個時間點(diǎn)中，對照組小鼠肺組織中未檢出細(xì)菌，肺炎模型組小鼠肺內(nèi)和血液中細(xì)菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)。新魚腥草素鈉組小鼠肺內(nèi)和血液中細(xì)菌數(shù)量明顯少于肺炎模型組(P<0.05)，其中高劑量新魚腥草素鈉組治療效果優(yōu)于低劑量新魚腥草素鈉組(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠接種鮑曼不動桿菌后肺內(nèi)和血液中細(xì)菌計數(shù)

注：與肺炎模型組比較，*P<0.05；與低劑量新魚腥草素鈉組比較，#P<0.05

3.3 各組小鼠肺組織病理觀察 肺炎模型組小鼠術(shù)后72 h肺組織呈現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥變化，包括支氣管管壁增厚、支氣管擴(kuò)張、單核細(xì)胞滲出，肺間質(zhì)重度充血等典型的肺炎病理改變。在給予新魚腥草素鈉治療后，小鼠肺部炎癥明顯減輕，表現(xiàn)為少量的間質(zhì)充血、水腫和白細(xì)胞滲出。而高劑量新魚腥草素鈉治療的效果更為明顯。見圖1。

3.4 各組小鼠BALF中炎性細(xì)胞水平比較 與對照組相比，肺炎模型組小鼠BALF中炎性細(xì)胞明顯增加(P<0.05)；與肺炎模型組相比，經(jīng)過新魚腥草素鈉治療的小鼠BALF中炎性細(xì)胞明顯增加(P<0.05)，其中中性粒細(xì)胞占白細(xì)胞的比例也更高(P<0.05)。見表2。

注：A.對照組；B.肺炎模型組；C.低劑量新魚腥草素鈉組；D.高劑量新魚腥草素鈉組

注：與對照組比較，△P<0.05；與肺炎模型組比較，*P<0.05

3.5 各組小鼠BALF中TNF-α和IL-1β水平比較 與對照組比較，肺炎模型組小鼠TNF-α、IL-1β水平顯著升高(P<0.05)；在給予新魚腥草素鈉治療后，治療組BALF中TNF-α、IL-1β水平均高于肺炎模型組(P<0.05)，其中高劑量新魚腥草素鈉組又明顯高于低劑量新魚腥草素鈉組(P<0.05)。結(jié)果提示新魚腥草素鈉對小鼠免疫功能的促進(jìn)作用具有劑量依賴性。見表3。

4 討論

隨著臨床大量抗生素的應(yīng)用，鮑曼不動桿菌的耐藥性愈加嚴(yán)重，鮑曼不動桿菌感染已經(jīng)成為臨床難控制的感染性疾病之一[9-11]。開發(fā)新的有效藥物控制鮑曼不動桿菌感染是目前研究的重要方向。由于鮑曼不動桿菌是機(jī)會致病菌，通常情況下不會導(dǎo)致免疫力正常的人和動物致病。針對這一問題，在本實(shí)驗(yàn)中預(yù)先給予小鼠環(huán)磷酰胺處理。環(huán)磷酰胺是常用的烷化劑類免疫抑制劑，常用于器官移植或者自身免疫性疾病[12]，經(jīng)過環(huán)磷酰胺預(yù)處理的小鼠體內(nèi)免疫功能下降，使得鮑曼不動桿菌能夠成功感染小鼠。在本研究中，筆者利用臨床分離的鮑曼不動桿菌菌株通過呼吸道接種的方式制備了小鼠肺炎模型。鮑曼不動桿菌可以在小鼠肺內(nèi)增殖并在肺外快速傳播，導(dǎo)致小鼠發(fā)生菌血癥和肺炎。這種模型一定程度上模擬了臨床鮑曼不動桿菌感染導(dǎo)致肺炎的病理過程。

表3 各組小鼠BALF中TNF-α和IL-1β水平比較

注：與對照組比較，△P<0.05；與肺炎模型組比較，

*P<0.05；與低劑量新魚腥草素鈉組比較，#P<0.05

新魚腥草素鈉在臨床上作為重要的輔助用藥常用于呼吸系統(tǒng)感染性疾病的治療，對卡他球菌、流感桿菌、肺炎球菌、金黃色葡萄球菌等有明顯抑制作用[13-17]。研究表明，其能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有抑制病原微生物以及抗腫瘤作用[18-19]。在本研究中，小鼠接種大量鮑曼不動桿菌后，肺和血液中細(xì)菌增加，由于自身免疫功能受到抑制，白細(xì)胞數(shù)量不足，不能夠充分激活固有免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為白細(xì)胞升高受限，釋放細(xì)胞因子不足，其結(jié)果是不能夠快速清除體內(nèi)細(xì)菌，造成肺嚴(yán)重的炎性反應(yīng)和組織損傷，而經(jīng)過新魚腥草素鈉治療的小鼠，肺內(nèi)和血循環(huán)中細(xì)菌的數(shù)量顯著減少，肺組織損傷程度較輕微，BALF中白細(xì)胞數(shù)量顯著高于未給予新魚腥草素鈉治療的小鼠，TNF-α和IL-1β作為急性炎癥過程中重要細(xì)胞因子，主要由單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌產(chǎn)生，因此這兩種細(xì)胞因子水平反映炎性反應(yīng)程度以及單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的功能。肺炎模型組小鼠經(jīng)過環(huán)磷酰胺處理，其炎性反應(yīng)受到一定程度的抑制，但仍能夠增生和活化，而新魚腥草素鈉治療后，小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)能力顯著提高，表現(xiàn)為細(xì)胞因子水平增加更為明顯，說明新魚腥草素鈉能夠提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)白細(xì)胞活化，增加細(xì)胞因子分泌。

綜上，本次研究結(jié)果表明，新魚腥草素鈉能夠顯著改善鮑曼不動桿菌感染小鼠的免疫力并抑制鮑曼不動桿菌在體內(nèi)增殖，針對這一現(xiàn)象進(jìn)行深入研究可望為鮑曼不動桿菌的防治提供更多的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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