海馬齒狀回在針刺心經(jīng)抗心肌缺血中的作用

吳 欣，吳生兵，崔 帥，王 堃，曹 健，張先姚，周文超，周美啟

(1.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.針灸基礎與技術安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230038； 3.新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038；4.廣州中醫(yī)藥大學針灸康復臨床學院，廣東 廣州 510006；5.安徽中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，安徽 合肥 230012)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)，又稱缺血性心臟病，是指冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化引起的管腔狹窄或閉塞，導致心肌缺血、低氧或壞死而引起的心臟病[1]。隨著高血壓、吸煙等危險因素增加，我國心血管疾病負擔日益加重，表現(xiàn)為發(fā)病率和病死率亦逐年上升，并呈年輕化趨勢[2]。心肌缺血與心源性猝死密切相關[3]，心血管疾病已成為我國重要的公共衛(wèi)生問題之一。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌缺血可引起海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞放電發(fā)生變化，針刺心經(jīng)可逆轉這種變化，提示海馬CA1區(qū)參與針刺抗心肌缺血作用[4]。海馬在解剖結構上屬于邊緣前腦皮質結構，其亞區(qū)主要包括CA區(qū)和海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)區(qū)。有研究發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠DG區(qū)神經(jīng)細胞損壞明顯，提示DG區(qū)對缺血、低氧較為敏感[5]。當神經(jīng)細胞受損時，尼氏體出現(xiàn)不同程度的形態(tài)改變，甚至消失[6]。基于此，筆者提出海馬DG區(qū)可能參與針刺心經(jīng)抗心肌缺血作用的科學假說。本研究通過復制大鼠急性心肌缺血模型，同步觀察心電圖和海馬DG區(qū)細胞形態(tài)以及神經(jīng)細胞放電的變化，以探討海馬DG區(qū)在針刺心經(jīng)抗心肌缺血中的作用，亦為經(jīng)脈臟腑相關與腦聯(lián)系提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 清潔級健康SD大鼠60只，體質量(260±10)g，安徽醫(yī)科大學飼養(yǎng)中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011-002。在康為IR60獨立送風隔離籠具中飼養(yǎng)，籠內(nèi)溫度控制在(20±1)°C。自然濕度，自然光線。依據(jù)國家科技部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》處理實驗大鼠。

1.2 試劑與儀器 華佗牌SDZ-Ⅳ型電子針療儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；10%水合三氯乙醛：國藥集團化學試劑有限公司；0.9%氯化鈉注射液：安徽豐原藥業(yè)股份有限公司；尼氏染色液：碧云天；微絲電極：plexon；腦立體定位儀：瑞沃德；多通道信號采集處理系統(tǒng)：plexon；海人藻酸：Sigma。

2 方法

2.1 干預方法 參照既往研究成果[7]，選取與之對應穴位。其中針刺組和損毀組選取手少陰心經(jīng)“神門-通里”經(jīng)脈段，于大鼠左右腕部各刺入3根毫針，間距為2 mm，并以銅線分別將腕部毫針聯(lián)成一束連接至電針治療儀，電流強度為1 mA，頻率為2 Hz，刺激30 min，連續(xù)干預3 d。而偽手術組和模型組不予電針處理。

2.2 模型制備及分組 將60只大鼠按隨機數(shù)字表法分為偽手術組、模型組、針刺組、損毀組，每組15只。通過參考文獻[8]作相應的改進，采用冠狀動脈左前降支結扎法復制大鼠急性心肌缺血模型。采取乙醚麻醉大鼠，隨即背部固定，胸部備皮，常規(guī)局部無菌操作，沿左鎖骨中線縱向切開皮膚2～3 cm，胸部左側第4肋間鈍性分離，剪開心包膜，迅速擠出心臟，從肺動脈圓錐左緣、左心耳根部下緣1～2 cm處的線狀乳白色冠狀動脈左前降支下穿“5-0”無損傷縫合線，結扎。偽手術組只穿線不予結扎。隨即將心臟放回胸腔內(nèi)，迅速擠出胸腔內(nèi)氣體，縫合胸腔，常規(guī)無菌操作。心電圖出現(xiàn)ST段弓背上抬，T波高聳視為模型復制成功。按此模型復制標準，模型組和損毀組經(jīng)模型復制后，每組各剩10只大鼠。

2.3 海馬DG區(qū)化學損毀 大鼠固定于腦立體定位儀上，頭部常規(guī)備皮，參照Paxinos和Watson大鼠頭部圖譜，設定海馬DG區(qū)坐標；借助腦立體定位儀和微量注射器，以0.2 μL/min的速度，將1 μL海人藻酸(0.4 μg)注射于雙側海馬DG區(qū)，無菌頭皮縫合后，置于鼠籠飼養(yǎng)。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 心率和ST段 采用生物信號采集系統(tǒng)記錄各組大鼠心電圖，并將采集的心電圖導入Chart5軟件，對4組大鼠的心率和ST段的平均值進行處理分析。

2.4.2 海馬DG區(qū)細胞形態(tài) 實驗結束后，開胸內(nèi)固定后，斷頭取腦，用4%多聚甲醛外固定腦組織，經(jīng)常規(guī)脫水，包埋，切片后，行尼氏染色，觀察偽手術組、模型組、針刺組海馬DG區(qū)細胞形態(tài)變化，由于損毀組海馬DG區(qū)被損毀，因此損毀組不予尼氏染色處理。

2.4.3 海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞放電信號的采集與處理 麻醉大鼠后，俯臥位固定于腦立體定位儀。頭部常規(guī)備皮后，碘伏無菌操作，沿頭皮正中切開，分離結締組織，充分暴露顱骨面和前囟，參照大鼠腦圖譜，分別標記前囟和海馬DG區(qū)坐標，進行鉆孔和開骨窗，將顱骨釘固定于顱骨面，隨即挑硬腦膜，移動臂桿，將微絲電極緩慢移至目標區(qū)域，當神經(jīng)細胞放電信噪比達到3∶1，進行記錄，再經(jīng)過offline sorter和Neuro Explore 進行分類與分析，由于損毀組海馬DG區(qū)被損毀，因此只記錄偽手術組、模型組、針刺組3組。

3 結果

3.1 各組大鼠心率、ST段電壓比較 與偽手術組比較，模型組心率和ST段電壓均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，針刺組心率和ST段電壓均顯著降低(P<0.05)；與針刺組比較，損毀組心率和ST段電壓均顯著升高(P<0.05)。見圖1、圖2。

3.2 各組大鼠海馬DG區(qū)細胞形態(tài)比較 偽手術組大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞排列緊密，細胞核大而圓，胞質色淺而均勻，尼氏體豐富。模型組大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞排列較為稀疏，細胞體積變小，尼氏體減少。針刺組大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞排列相對較為緊密，細胞體積較大，尼氏體相對增多。見圖3。

3.3 各組大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞放電頻率比較 與偽手術組比較，模型組海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞放電頻率顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，針刺組海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞放電頻率顯著減少(P<0.05)。見圖4。

注：與偽手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，

#P<0.05；與針刺組比較，△P<0.05

注：與偽手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，

#P<0.05；與針刺組比較，△P<0.05

圖2 各組大鼠ST段電壓比較

注：與偽手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

目前對海馬DG區(qū)的研究多集中在應激、情緒等方面[9-10]，對心血管的研究較少。而在雙心醫(yī)學領域，相關研究[11]明確表明，情緒障礙類疾病與冠心病是相互聯(lián)系的。雖然中醫(yī)學并未明確提出“雙心病”，但在闡述“胸痹”“心悸”等心臟疾病時均指出患者精神心理的異常，與郁證存在一定交叉。同時針刺作為對機體的一種良性應激，可以調節(jié)機體的內(nèi)環(huán)境。有學者提出電針可通過增加海馬組織中5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素等單胺類神經(jīng)遞質的含量，繼而發(fā)揮抗抑郁作用[12]。據(jù)此推測海馬DG區(qū)可能與心血管疾病存在一定的聯(lián)系。在體多通道記錄技術可考察神經(jīng)核團群體神經(jīng)細胞的電活動。本實驗運用該技術記錄海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞放電信號，發(fā)現(xiàn)海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞放電維持在較低水平，這一點與相關學者[13]的結論基本一致。復制大鼠急性心肌缺血模型后，海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞放電頻率顯著提高，這可能與心肌損傷后海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞的興奮有關，針刺干預后，心肌損傷后激活的神經(jīng)細胞得到抑制。

尼氏體的主要功能是合成蛋白質，作為神經(jīng)活動時所需，神經(jīng)細胞在興奮傳導過程中，不斷消耗相關蛋白質，尼氏體可合成新的蛋白質進行補償。本實驗通過復制大鼠急性心肌缺血模型，經(jīng)尼氏染色后，對比偽手術組，發(fā)現(xiàn)海馬DG區(qū)細胞排列較為稀疏，細胞體積變小，尼氏體減少，通過針刺干預，細胞形態(tài)存在一定程度的逆轉，可能與心肌損傷后海馬DG區(qū)神經(jīng)細胞興奮，消耗大量與小分子物質有關的蛋白質存在一定的聯(lián)系。本研究結果表明，在針刺抗心肌缺血過程中，海馬DG區(qū)發(fā)生相應的變化。雙側損毀海馬DG區(qū)后，針刺心經(jīng)改善大鼠急性心肌缺血作用受到明顯影響，提示海馬DG區(qū)在參與針刺心經(jīng)抗心肌缺血中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本次研究結果表明，海馬DG區(qū)可能是針刺改善大鼠急性心肌缺血損傷的關鍵中樞之一。依據(jù)經(jīng)脈臟腑相關理論，心臟的異?？梢鹣嚓P腦區(qū)的異常，但腦區(qū)出現(xiàn)異常是否亦會引起心臟的異常？即心臟和腦之間是否存在雙向相關性？另外，通過腦區(qū)注射海人藻酸損毀海馬DG區(qū)是否會產(chǎn)生負性刺激或是應激反應？針對這些問題，筆者將在后續(xù)實驗中予以研究證實。

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