艾灸對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠血清白細胞介素-6水平和結(jié)腸組織β-防御素-2及其mRNA表達的影響

儲浩然，吳立斌，程紅亮，吳生兵，蔡榮林，龍小娜，李 難，夏煥娟，吳克宇

(1.安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；2.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學科研實驗中心，安徽 合肥 230038；4.安徽中醫(yī)藥大學針灸經(jīng)絡(luò)研究所，安徽 合肥 230038)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種慢性的腸道功能疾病，并存在多種亞型，其中以腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea predominant irritable bowel syndrome, D-IBS)最為常見[1]。IBS對患有該病人群的身心和經(jīng)濟造成了巨大壓力[2-3]，這使得有關(guān)IBS的治療與發(fā)病機制近年來一直被人們所關(guān)注，而其發(fā)病機制至今說法不一，如腸-腦軸功能紊亂、腸道炎性反應[4-5]。有研究表明，IBS發(fā)病與腸道黏膜炎性反應關(guān)系密切[6]。

對于D-IBS的治療，現(xiàn)代醫(yī)學目前主要以對癥治療為主。臨床研究發(fā)現(xiàn)，艾灸療法對于D-IBS療效明確，且相對于現(xiàn)代醫(yī)學的常規(guī)方法，能更大程度地緩解癥狀，有更高的治愈率[7]。也有動物實驗證實，艾灸可促進D-IBS大鼠腸道黏膜功能修復，從而使癥狀緩解[8]，但其作用途徑與機制仍不明確，需要進一步探究。

本研究通過觀察艾灸對D-IBS大鼠血清白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)水平和結(jié)腸組織β-防御素-2(beta-defensin-2, BD-2)蛋白及其mRNA表達的影響，以IL-6、BD-2與Toll樣受體-4(Toll like receptor 4,TLR4)/核因子-κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)信號通路的關(guān)系為依據(jù)，判斷艾灸天樞、上巨虛治療D-IBS的機制是否與TLR4/NF-κB通路有關(guān)聯(lián)，初步揭示艾灸抑制D-IBS炎性反應的機制。

1 材料

1.1 實驗動物與分組 選取SPF級成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(190±15)g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2011-002。實驗動物房由安徽中醫(yī)藥大學實驗中心提供，室溫(26±1)℃，濕度50%～60%，12 h明暗交替環(huán)境。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機選取10只作為空白對照組，另20只復制D-IBS模型。模型復制完成后，按隨機數(shù)字表法分為模型組和艾灸組，每組10只。

1.2 主要試劑 IL-6 ELISA試劑盒(批號 E20170101A)：上海源葉生物科技有限公司；β-actin(批號 16AV0210)：北京中杉金橋生物科技有限公司；BD-2試劑盒(批號 AC09102356)：Bioss公司；電化學發(fā)光試劑盒(批號 QE218149)：Thermo公司；Trizol試劑(批號 101002)：Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號 00287813)：Thermo公司。

1.3 主要儀器 酶標儀(型號 Multiskan FC)、熒光定量PCR儀(型號PIKOREAL 96)：Thermo公司；電泳儀(型號 EPS 300)：Tanon公司。

2 方法

2.1 模型復制方法與模型評價 采用番瀉葉灌胃結(jié)合局部束縛的方法復制大鼠D-IBS模型[9]。將隨機選取的10只大鼠作為空白對照組，僅予以生理鹽水灌胃(劑量與番瀉葉水煎劑保持一致)，其余20只大鼠予以番瀉葉(0.3 g/mL)灌胃。灌胃1 h后用寬透明膠帶纏住大鼠上肢和肩部，限制其上肢活動，持續(xù)1 h，灌胃與束縛每日1次，持續(xù)2周。模型復制結(jié)束后通過統(tǒng)計并對比空白對照組(10只)與其他大鼠(20只)稀便率評價模型復制效果。即將每組大鼠分開放置于鐵籠中，鐵籠下放置墊有濾紙的托盤，6 h后，對各組大鼠總排便粒數(shù)和稀便數(shù)進行計數(shù)，最后計算稀便率(稀便數(shù)/總排便粒數(shù)×100%)。將各組大鼠稀便率進行統(tǒng)計分析比較，若稀便率較空白對照組顯著升高(P<0.05)，則D-IBS模型復制成功，可進行下一步處理，若稀便率與空白對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，則模型復制不成功，分析失敗原因后重新復制模型。

2.2 干預方法 模型復制結(jié)束后對艾灸組大鼠進行干預，空白對照組與模型組不采取干預措施。選取雙側(cè)天樞、上巨虛穴進行艾灸，使用直徑為0.7 cm的無煙艾條，定位參考《實驗針灸學》[10]，每穴10 min，每日1次，持續(xù)1周。

2.3 大鼠結(jié)腸組織取材 大鼠使用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，在距離肛門8 cm左右處截取一段長度約1 cm的腸道組織，用預冷生理鹽水沖洗，并用濾紙吸干后迅速放入液氮罐中保存，隨后存入-80 ℃冰箱，用時取出。

2.4 觀察指標與檢測方法

2.4.1 ELISA法測定大鼠血清IL-6濃度 以10%水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉后，抽取腹主動脈血，用冷凍離心機制備血清，完成后放置于-20 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。按照IL-6 ELISA試劑盒說明書步驟測定樣本OD值，根據(jù)標準孔OD值和標準品濃度繪制回歸曲線，將樣本OD值代入回歸方程中計算每組大鼠血清IL-6濃度。

2.4.2 Western blot法檢測大鼠結(jié)腸組織BD-2蛋白表達 取約100 mg組織樣品，加入含PMSF裂解液進行裂解，在高速冷凍離心機中12 000 r/min離心15 min后收集上清液，將稀釋的待測樣本及內(nèi)參蛋白β-actin加入SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，完成電泳后，依次進行轉(zhuǎn)膜、封閉，按說明書進行一抗和二抗的孵育，再使用電化學發(fā)光試劑盒處理PVDF膜，膠片條帶使用北京科創(chuàng)銳新生物凝膠成像系統(tǒng)進行灰度分析，最后得出每組樣本BD-2蛋白相對表達水平。

2.4.3 實時熒光定量PCR測定大鼠結(jié)腸組織BD-2 mRNA的表達 按照Trizol試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟，進行大鼠結(jié)腸組織總RNA的抽提純化和cDNA的合成。β-actin上游引物為5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物為5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，長度為150 bp；BD-2上游引物為5′-GTAATTAGTGGGGTTCTACT-3′，下游引物為5′-ACCACGACGACAGCGGAGAA-3′，長度為167 bp。本次實驗使用相對定量實驗的分析方法，計算出目的基因相對表達倍數(shù)2-ΔΔCt。

3 結(jié)果

3.1 3組大鼠血清IL-6水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清IL-6含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組大鼠血清IL-6水平顯著下降(P<0.05)。見圖1。

注：與模型組比較，*P<0.05

3.2 3組大鼠結(jié)腸組織BD-2蛋白表達水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織BD-2表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組大鼠結(jié)腸組織BD-2水平顯著下降(P<0.05)。見圖2、圖3。

注：與模型組比較，*P<0.05

3.3 3組大鼠結(jié)腸組織BD-2 mRNA表達水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織BD-2 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組大鼠結(jié)腸組織BD-2 mRNA表達水平顯著下降(P<0.05)。見圖4。

圖3 3組大鼠結(jié)腸組織BD-2蛋白表達水平

注：與模型組比較，*P<0.05

4 討論

TLR4是一種可識別脂多糖信號并實現(xiàn)跨膜信號轉(zhuǎn)導的受體。脂多糖信號通過D-IBS模型大鼠腸道黏膜細胞中TLR4被轉(zhuǎn)導至細胞膜內(nèi)，隨后通過髓樣分化因子88依賴途徑使靜息狀態(tài)的NF-κB與其抑制蛋白解離并活化，NF-κB進入細胞核并誘導多種炎性因子表達，而其誘導產(chǎn)生的TNF-α、IL-6等炎性因子又可以激活靜息狀態(tài)的NF-κB，這樣就形成了一系列級聯(lián)反應參與的正反饋調(diào)節(jié)，炎性因子的過量表達使局部炎癥不斷加重，腸道黏膜結(jié)構(gòu)和功能被破壞[11-12]，最終產(chǎn)生腹痛、腹瀉等癥狀。BD-2廣泛存在于各種多細胞生物體內(nèi)，是一種天然的抗菌肽，具有抗微生物活性[13]，由NF-κB活化后進入細胞核與BD-2基因啟動子區(qū)域結(jié)合誘導產(chǎn)生。因此，BD-2可受TLR4/NF-κB通路調(diào)節(jié)，BD-2在IBS患者結(jié)腸黏膜細胞中往往呈現(xiàn)高表達[14]。

D-IBS可歸屬于中醫(yī)學“泄瀉”“腹痛”等病范疇，其中不同的證候分型有不同的病機，如肝氣乘脾證是由于肝失疏泄、木旺乘脾，使脾主運化功能失司，也有腎陽虛衰、脾失溫煦形成的腎陽虛衰證，這些都可以導致大腸傳化糟粕、主津的功能受影響，形成泄瀉或腹痛。本次實驗選取的天樞穴為大腸募穴，上巨虛為大腸下合穴，兩者合募配用治療腑病，可以調(diào)整大腸腑氣機，止瀉止痛，使其恢復正常功能。前期臨床隨機對照實驗中，選用天樞、上巨虛配合其他辨證取穴方法治療D-IBS，療效確切[15]。對于該病的治療，西醫(yī)通常使用止瀉劑、腸道解痙劑等藥物對癥治療，中醫(yī)對該病有多種治療方法，艾灸為其中一種，通過臨床實驗發(fā)現(xiàn)，艾灸治療D-IBS，相對于常規(guī)對癥治療，能更有效地控制癥狀且不易復發(fā)[16]。

本研究結(jié)果顯示，艾灸天樞、上巨虛可以顯著降低D-IBS模型大鼠血清IL-6和結(jié)腸組織BD-2蛋白及其mRNA的表達水平，而TLR4/NF-κB信號通路是IL-6和BD-2被誘導產(chǎn)生的重要途徑之一，對IL-6高表達的小鼠細胞使用TLR4抑制劑(抗TLR4抗體)后，IL-6表達水平有所下降[17],BD-2蛋白及其mRNA的表達也受NF-κB抑制劑(咖啡酸苯乙酯)的影響而被抑制[18]。由此可以看出，艾灸天樞、上巨虛可能有類似于抑制TLR4/NF-κB信號通路的作用，其治療D-IBS的過程可能是通過抑制TLR4/NF-κB通路降低IL-6以及BD-2的表達，與此同時，IL-6水平的下降本身也緩解了NF-κB激活后參與的正反饋調(diào)節(jié)，進一步使BD-2及其mRNA的表達降低，使炎性反應更有效地得到控制，促進機體恢復正常。

本研究初步探明，艾灸天樞、上巨虛對D-IBS大鼠血清IL-6水平和結(jié)腸組織BD-2的表達均有降低的作用，可能艾灸使TLR4/NF-κB信號通路受到抑制是這一作用產(chǎn)生的機制，但IL-6和BD-2的表達也受到TLR2介導的NF-κB或p38 MAPK信號通路等途徑的影響[19-20]，所以這一推測仍需要進一步的實驗去驗證。本實驗為臨床上艾灸天樞、上巨虛治療D-IBS提供了部分理論依據(jù)，也為今后繼續(xù)探索艾灸治療D-IBS的機制提供實驗依據(jù)。

[1] 崔立紅,李超,王曉輝,等.腸易激綜合征臨床癥狀學及分型研究[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2014,26(2):1-2,6.

[2] LEE C, DOO E, CHOI J M, et al. The increased level of depression and anxiety in irritable bowel syndrome patients compared with healthy controls: systematic review and meta-analysis[J].J Neurogastroenterol Motil,2017,23(3):349-362.

[3] ZHANG F, XIANG W, LI C Y, et al. Economic burden of irritable bowel syndrome in China[J]. World J Gastroenterol，2016,22(47):10450-10460.

[4] STASI C, BELLINI M, GAMBACCINI D,et al. Neuroendocrine dysregulation in irritable bowel syndrome patients: a pilot study[J]. J Neurogastroenterol Motil，2017，23(3):428-434.

[5] 郭文濤,劉萍，董麗娜,等.腹瀉型腸易激綜合征患者腸黏膜優(yōu)勢菌的改變與Toll樣受體2和4基因表達的相關(guān)研究[J].中華內(nèi)科雜志，2016,55(7):541-543.

[6] LIU L, LIU B N, CHEN S, et al. Visceral and somatic hypersensitivity, autonomic cardiovascular dysfunction and low-grade inflammation in a subset of irritable bowel syndrome patients[J]. Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology),2014,15(10):907-914.

[7] 儲浩然,黃學勇,李學軍,等.艾灸治療腹瀉型腸易激綜合征臨床研究[J].安徽中醫(yī)學院學報,2011,30(6):33-36.

[8] 周次利,吳璐一,吳蓓玲,等.艾灸及其生成物對腹瀉型腸易激綜合癥模型大鼠內(nèi)臟痛和結(jié)腸水液代謝的影響[J].世界科學技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2014,16(6):1261-1267.

[9] 趙妍,羅丹妮,陳穎,等.慢性束縛應激聯(lián)合番瀉葉灌胃法制備IBS-D大鼠模型的量效及時效關(guān)系評價[J].世界華人消化雜志,2017,25(15):1360-1367.

[10] 李忠仁.實驗針灸學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2011:255-257.

[11]ZHANG H, CHEN W. Interleukin-6 inhibition by triptolide prevents inflammation in a mouse model of ulcerative colitis[J].Exp Ther Med，2017,14(3):2271-2276.

[12] FUJII M, NISHIDA A, IMAEDA H,et al.Expression of interleukin-26 is upregulated in inflammatory bowel disease[J].World J Gastroenterol，2017,23(30):5519-5529.

[13] MANKO A, MOTTA J P, COTTON J A,et al.Giardia co-infection promotes the secretion of antimicrobial peptides beta-defensin-2 and trefoil factor 3 and attenuates attaching and effacing bacteria-induced intestinal disease[J].PLoS One，2017,12(6):e0178647.

[14] SUNG J, MORALES W, KIM G,et al. Effect of repeated Campylobacter jejuni infection on gut flora and mucosal defense in a rat model of post infectious functional and microbial bowel changes [J].Neurogastroenterol Motil，2013,25(6):529-537.

[15] 儲浩然,李難,程紅亮.溫針灸治療肝郁脾虛型腸易激綜合征療效觀察[J].上海針灸雜志,2015,34(5):424-425.

[16] 張蕊,徐亞莉,趙愛玲.鋪灸電聯(lián)治療腹瀉型腸易激綜合征臨床觀察[J].針灸臨床雜志,2012,28(5):41-43.

[17] OHTSU A, SHIBUTANI Y, SENO K, et al. Advanced glycation end products and lipopolysaccharides stimulate interleukin-6 secretion via the RAGE/TLR4-NF-κB-ROS pathways and resveratrol attenuates these inflammatory responses in mouse macrophages[J]. Experimental and Therapeutic Medicine，2017,14(5):4363-4370.

[18] CHEN L, SUN B B, WANG T, et al. Cigarette smoke enhances β-defensin 2 expression in rat airways via nuclear factor-κB activation[J]. European Respiratory Society，2010,36(3):638-645.

[19] HOJO K, TAMAI R, KOBAYASHI-SAKAMOTO M, et al. Etidronate down-regulates Toll-like receptor (TLR) 2 ligand-induced proinflammatory cytokine production by inhibiting NF-κB activation[J].Pharmacological Reports，2017,69(4):773-778.

[20] LEE H Y, TAKESHITA T, SHIMADA J, et al. Induction of beta defensing-2 by NTHi requires TLR2 mediated MyD88 and IRAK-TRAF6-p38MAPK signaling pathway in human middle ear epithelial cells [J/OL]. BMC Infectious Diseases， 2008,8:87[2017-9-28]. https://doi.org/10.1186/1471-2334-8-87. DOI:10.1186/1471-2334-8-87.