阿爾山國家森林公園自然保護(hù)區(qū)楊樹根際土壤固氮菌多樣性及特性研究

牛艷芳，閆 偉，陳立紅，崢 嶸(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特0009；內(nèi)蒙古師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 000)

生物固氮是指微生物通過固氮酶的催化將大氣中的分子氮還原為氨的過程，在生物固氮中，固氮量的60%由陸生固氮生物完成，40%由海洋固氮生物完成[1-2]。到目前為止，所發(fā)現(xiàn)的生物固氮作用只存在于細(xì)菌域和古生菌域中,在分類地位上主要隸屬于固氮菌科(Azotobacteraceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、紅螺菌目(Rhodospirillales)、甲基球菌科(Methylococcacese)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)以及芽孢桿菌屬(Bacillus)和梭菌屬(Clostridium)中的部分菌種。自1886年人們首次分離出共生固氮的根瘤菌起，至2006年已發(fā)現(xiàn)的固氮微生物多達(dá)200余屬[3-6]。

近年來，很多學(xué)者熱衷于研究農(nóng)業(yè)作物及固氮樹種的固氮作用[7-13]，而對于非固氮樹種的固氮研究相對較少，僅限于楊樹、杉木、茶樹、馬尾松、桉樹等的初步研究，且集中在聯(lián)合固氮菌的回接對這些樹木的促生效應(yīng)方面[14-21]。楊樹具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長速度快、輪伐期短等特點(diǎn)，已成為主要的造林樹種，廣泛地應(yīng)用于森林保護(hù)、農(nóng)田防風(fēng)固沙和道路兩邊的綠化等領(lǐng)域，其氮素來源于土壤和人工施用的氮肥，對土地消耗巨大[22-23]。楊樹作為非固氮樹種的典型代表，其固氮機(jī)制研究相對較少。因此，本研究對阿爾山國家森林公園自然保護(hù)區(qū)楊樹根際土壤固氮菌進(jìn)行了篩選，并對其特性進(jìn)行分析，旨在探明楊樹的固氮機(jī)制，為以非固氮樹種為主的森林生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于內(nèi)蒙古自治區(qū)東部興安盟的西北端，地處大興安嶺中段，被呼倫貝爾、錫林郭勒、科爾沁、蒙古四大草原所環(huán)抱，東鄰扎蘭屯市，西與錫林郭勒盟及蒙古國接壤，北與呼倫貝爾新巴爾虎左旗、鄂溫克旗毗鄰，南與興安盟科右前旗相接，地理坐標(biāo)為北緯46°39′-47°39′，東經(jīng)119°28′-121°23′。年均溫度為-3.1 ℃，年平均濕度為70%，每年7-8月份濕度最大，約為80%，春季濕度在50%左右，冬季濕度為76%～79%。阿爾山森林資源豐富，森林面積46.4萬hm2，人工林10.53萬hm2，森林覆蓋率為79.2%，活立木蓄積量28 261 387.1 m3。林相以寒溫帶針闊葉混交林為主，樹種以興安落葉松、油松、山楊、白樺為主，均為非固氮樹種[24-25]。

2 研究方法

2.1 主要試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒，天根生化科技有限公司生產(chǎn)；TaqMaster Mix(2×)，購于南京博爾迪生物科技有限公司。試驗所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

阿須貝無氮培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO40.2 g，CaCO35 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH為7.0～7.2。

無機(jī)磷培養(yǎng)基：Ca3(PO4)25 g，葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KCl 0.3 g，MnSO40.03 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

2.2 土樣的采集

2015年8，在阿爾山國家森林公園自然保護(hù)區(qū)楊樹分布區(qū)內(nèi)選取一塊樣地，設(shè)置5個不同的采樣點(diǎn)(4個頂點(diǎn)加1個中心點(diǎn))，每個采樣點(diǎn)選取一棵楊樹，去除地表的腐殖質(zhì)，用無菌的鐵鍬挖取30 cm深的土壤，找到楊樹根系，將帶有根系的土壤裝入滅菌的密封袋，帶回實驗室于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 根際土壤固氮菌的分離與純化

[26-27]，采用阿須貝無氮培養(yǎng)基分離純化土壤樣品中的固氮菌。稱取土樣10 g，放入裝有90 mL無菌水的加玻璃珠的三角瓶中，在搖床上于150 r/min振蕩20 min，依次制成稀釋度分別為10-3，10-4，10-5的土壤懸液，分別接種到培養(yǎng)皿中，用無菌玻璃棒涂布均勻，28 ℃下培養(yǎng)6～7 d。將培養(yǎng)出來的固氮菌菌落利用劃線法進(jìn)行分離，培養(yǎng)分離到的純種固氮菌4～5 d，之后再轉(zhuǎn)接3次，保證分離純化的固氮菌仍具有固氮作用。將純化后的固氮菌保存于試管中，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 根際土壤固氮菌的形態(tài)觀察及生理生化特性測定

依照《微生物學(xué)實驗》[28]及周國英等[29]的方法，對分離出的固氮菌進(jìn)行菌體形態(tài)及生理生化鑒定，以不接菌的培養(yǎng)基作為空白對照(CK)。

2.5 根際土壤固氮菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取固氮菌基因組DNA，具體操作方法詳見試劑盒說明書。以細(xì)菌基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增16S rDNA。PCR反應(yīng)體系為25 μL：DaeamTaqGreen PCR Master Mix(2×)12.5 μL，10 μmol/L引物27f 1.0 μL，10 μmol/L引物1492r 1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，43 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 15 min。PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行16S rDNA測序。

將測定的固氮菌16S rDNA序列經(jīng)軟件DNAMAN6.0校正后引入EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)，進(jìn)行菌株分類地位的初步確定，尋找相似性最高的模式種序列作為系統(tǒng)發(fā)育分析的參比序列，利用DNAMAN6.0進(jìn)行多序列比對，然后采用MEGA 4中的鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值(Bootstrap)為1 000，分析根際土壤固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育地位[30-33]。

2.6 不同pH和溫度對根際土壤固氮菌生長的影響

2.6.1 pH 將篩選出的固氮菌制成菌懸液，使其在600 nm處的吸光值(D600 nm)為0.05，吸取不同固氮菌的菌懸液0.1 mL,分別接種于pH為 3，4，5，6，7，8，9，10和11的阿須貝無氮培養(yǎng)基中，每處理3個重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長情況。

2.6.2 溫 度 吸取上述菌懸液0.1 mL接種于阿須貝無氮培養(yǎng)基中(pH 7.0)，每個處理3次重復(fù)，分別于4，15，28，37，45 ℃培養(yǎng)5 d，觀察不同溫度下菌落的生長情況。

2.7 根際土壤固氮菌解磷能力的測定

將不同固氮菌進(jìn)行活化處理后，采用溶磷圈法[34]接種到無機(jī)磷培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)10 d，觀察菌落周圍是否有透明圈出現(xiàn)，如果出現(xiàn)，測定透明圈直徑(D)和菌落的直徑(d)，用D/d表示菌株解磷能力的強(qiáng)弱，其值越大，表明菌株解磷能力越強(qiáng)。

3 結(jié)果與分析

3.1 楊樹根際土壤固氮微生物的分離與純化

根據(jù)菌落大小、顏色、透明度、邊緣是否整齊等特征，最終從楊樹根際土壤中分離得到8株能在阿須貝無氮培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌，分別命名為XY1、XY2、XY5、XY7、XY8、XY9、XY14和XY15。

3.2 楊樹根際土壤典型固氮菌菌落的形態(tài)及生理生化特性

從圖1可以看出，8株固氮菌的菌落形態(tài)各不相同，菌株XY1菌落較大，淡黃色，不透明，表面較濕潤、光滑，邊緣整齊，扁平；菌株XY2菌落大小中等，乳白色，不透明，表面較濕潤、光滑，邊緣整齊，扁平；菌株XY5菌落較小，乳白色，不透明，表面濕潤、光滑，邊緣整齊，突起；菌株XY7菌落較大，中間淡黃色，邊緣乳白色，不透明，表面濕潤、光滑，邊緣整齊，突起；菌株XY8菌落較大，乳白色，不透明，表面濕潤、光滑，邊緣整齊，突起；菌株XY14菌落大小中等，乳白色，不透明，表面較濕潤，邊緣不整齊，扁平；菌株XY15菌落較小，乳白色，不透明，表面較濕潤，邊緣不整齊，扁平；菌株XY9菌落大小中等，乳白色，不透明，干燥，邊緣不整齊，扁平。

圖1 阿爾山國家森林公園自然保護(hù)區(qū)楊樹根際8株土壤固氮菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of 8 tested nitrogen-fixing strains in Populus L.rhizosphere in Arxan National Forest Park

由表1可知，8株典型固氮菌的生理生化特征具有明顯的差異。菌株XY1的葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、尿素水解、過氧化氫酶反應(yīng)均為陽性；菌株XY2的葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、吲哚試驗、淀粉水解、油脂水解、過氧化氫酶反應(yīng)均為陽性；菌株XY5的葡萄糖、甘露醇、蔗糖、尿素水解、過氧化氫酶反應(yīng)均為陽性；菌株XY7的葡萄糖、甘露醇、甲基紅試驗、VP試驗、尿素水解、過氧化氫酶反應(yīng)均為陽性；菌株XY8的葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、尿素水解、過氧化氫酶反應(yīng)均為陽性；菌株XY14的葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、吲哚試驗、淀粉水解、油脂水解、尿素水解、過氧化氫酶、明膠液化反應(yīng)為均為陽性；菌株XY15的葡萄糖、甘露醇、吲哚試驗、VP試驗、油脂水解、過氧化氫酶、明膠液化均為陽性；菌株XY9的葡萄糖、甘露醇、蔗糖、VP試驗、油脂水解、過氧化氫酶、明膠液化、革蘭氏染色反應(yīng)均為陽性。

表1 阿爾山國家森林公園自然保護(hù)區(qū)楊樹根際8株固氮菌的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical features of 8 tested nitrogen-fixing strains in Populus L.rhizosphere in Arxan National Forest Park

注：“+”表示反應(yīng)呈陽性，“-”表示反應(yīng)呈陰性，“CK”表示空白對照。

Note：“+”.Positive，“-”.Negative，“CK”.Blank control

3.3 楊樹根際8株土壤固氮菌16S rDNA基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

用細(xì)菌通用引物27f和1492r，對阿爾山楊樹根際土壤中分離出的8株固氮菌的16S rDNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，所得片段長度均約為1.5 kb(圖2)，符合細(xì)菌16S rDNA的大小。

將測定的固氮菌16S rDNA序列引入EzTaxon進(jìn)行序列比對，結(jié)果表明，從楊樹根際土壤分離出的8株固氮菌的16S rDNA與相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性為96.85%～99.8%。根據(jù)16S rDNA鑒定標(biāo)準(zhǔn)，同源性大于等于97%的屬于同一種，同源性大于85%而小于97%的認(rèn)定為同一個屬不同的種[35-36]。從系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)可以看出，分離出的8株固氮菌分屬于8個不同的屬。

M．DNA Marker；1～8分別為菌株XY1、XY2、XY5、XY7、XY8、XY9、XY14、XY15擴(kuò)增產(chǎn)物M．DNA Marker；1-8.Represent amplification products of XY1,XY2,XY5,XY7,XY8,XY9,XY14,and XY15,respectively圖2 阿爾山國家森林公園自然保護(hù)區(qū)楊樹根際8株固氮菌16S rDNA電泳圖譜Fig.2 Amplification products of 16S rDNA gene from nitrogen-fixing bacteria strains in Populus L.rhizosphere in Arxan National Forest Park

根據(jù)《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》[37]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[38]，結(jié)合16S rDNA序列分析，最終確定，分離自阿爾山楊樹根際土壤的固氮菌XY1、XY2、XY5、XY7、XY8、XY14、 XY15 和XY9分別屬于柄桿菌屬(Caulobacter)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等。

圖3 基于16S rDNA序列的阿爾山國家森林公園自然保護(hù)區(qū)楊樹根際固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences from nitrogen-fixing bacteria strains in Populus L.rhizosphere in Arxan National Forest Park

3.4 pH和溫度對楊樹根際8株土壤典型固氮菌生長的影響

3.4.1 pH 從表2可以看出，不同固氮菌生長的pH范圍有差異，菌株XY1、XY2、 XY5 生長pH為3～9，其中XY1和XY2的最適pH為6～8，XY5的最適pH為6～7；菌株XY7的生長pH為4～10，最適pH為6～8；菌株XY8的生長pH為3～10，最適pH為7；菌株XY 14生長的pH為3～11，最適pH為7；菌株XY15生長的pH為5～9，最適pH為6～7；菌株XY9生長的pH為4～10，最適pH為7。

表2 阿爾山國家森林公園自然保護(hù)區(qū)楊樹根際8株固氮菌在不同pH下的生長情況Table 2 Effect of different pH on growth of strains from Populus L.in Arxan National Forest Park

注：“-”表示不生長，“+”表示生長，“++”表示生長較好，“+++”表示生長旺盛。下表同。

Note:“-” Represents no growth，“+” Represents growth，“++” Represents good growth,“+++” Represents lush growth.The same below.

3.4.2 溫 度 從表3可以看出，不同固氮菌生長溫度不同，菌株XY2、XY5、XY8、XY9的生長溫度范圍比較廣，在4～45 ℃都能生長；菌株XY1和XY7生長溫度為15～28 ℃；菌株XY14生長溫度為15～37 ℃；菌株XY15生長溫度為4～37 ℃。

表3 阿爾山國家森林公園自然保護(hù)區(qū)楊樹根際8株固氮菌在不同溫度下的生長情況Table 3 Effect of different temperature on growth of strain in Populus L.rhizosphere in Arxan National Forest Park

3.5 楊樹根際8株固氮菌的解磷能力

固氮菌除了具有固氮能力外，張曉勇等[39]和Malik等[40]還發(fā)現(xiàn)，有些固氮菌具有解磷作用。本試驗對篩選出的8株固氮菌的解磷能力進(jìn)行了測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有菌株XY2、XY7在培養(yǎng)基上出現(xiàn)了透明圈，其他菌株在培養(yǎng)基上未出現(xiàn)透明圈，其中菌株XY2的透明圈直徑(D)為1.35 cm，菌落直徑(d)為1.12 cm，其D/d值為1.21；菌株XY7的D為1.2 cm，d為0.9 cm，其D/d值為1.33。結(jié)果表明，只有XY2、XY7具有解磷能力，其他菌株無解磷能力。

4 討 論

植物根際土壤固氮菌具有豐富的多樣性，對一種植物而言，其根際土壤中能分離出幾種甚至十幾種不同類型的固氮菌[41]。本研究利用阿須貝無氮培養(yǎng)基從阿爾山國家森林公園自然保護(hù)區(qū)楊樹根際土壤中分離得到8株固氮菌，經(jīng)菌落形態(tài)、生理生化特性及分子生物學(xué)鑒定，分別屬于柄桿菌屬、葉柄菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、類芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬等8個不同的屬，表明該地區(qū)楊樹根際土壤固氮菌資源豐富。

本研究中，不同固氮菌的生長pH和溫度有差異，其中有的固氮菌pH生長范圍比較寬，既可以在堿性條件下生長，也可以在酸性條件下生長，如菌株XY14；有的菌株具有較寬的溫度生長范圍，在4～45 ℃都能生長，如菌株XY2、XY5、XY8和XY9；有的固氮菌除了具有固氮能力之外，還具有解磷能力，為樹木的生長提供氮素營養(yǎng)的同時又提供磷素營養(yǎng)，如菌株XY2和XY7。綜上所述可知，不同類型固氮菌的生物特性不同，這為森林生態(tài)系統(tǒng)非固氮樹種的固氮研究提供了理論依據(jù)。在后續(xù)的研究中，將分離鑒定出的不同固氮菌回接到楊樹根際，結(jié)合楊樹生長的特殊生境，篩選出可促進(jìn)楊樹生長的優(yōu)良菌株，為研制適合楊樹生長的專用微生物肥料提供理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張 武，楊 琳，王紫娟．生物固氮的研究進(jìn)展及發(fā)展趨勢 [J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，30(5)：810-821．

Zhang W，Yang L，Wang Z J.Advance and development trend of biological nitrogen fixation esearch [J].Journal of Yunnan Agricultural University，2015，30(5)：810-821．

[2] 馮曉敏，楊 永，任長忠，等．燕麥/大豆和燕麥/花生間作對根際土壤固氮細(xì)菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)的影響 [J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016,21(1)：22-32．

Feng X M，Yang Y ，Ren C Z，et al．Effects ofoat-soybean andoat-groundnu intercropping on the diversity and community composition of soil nitrogen-fixing bateral in rhizosp here soil [J].Journal of China Agriculturl University，2016，21(1)：22-32．

[3] 周德慶．微生物學(xué)教程 [M].北京：高等教育出版社，2011：136-141．

Zhou D Q. Microbiology tutorial [M].Beijing：Higher Education Press，2011：136-141．

[4] 沈 萍，陳向東．微生物學(xué) [M].北京：高等教育出版社，2006，119-120．

Shen P，Chen X D．Microbiology [M].Beijing：Higher Education Press，2006：119-120．

[5] 孫建光，徐 晶，胡海燕，等．中國十三省市土壤中非共生固氮微生物菌種資源研究[J]．植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2009，15(6)：1450-1465．

Sun J G ，Xu J ，Hu H Y，et al．Collection and investigation on asymbiotic nitrogen-fixing microbial resources from 13 provinces over China[J]．Plant Nutrition and Fertilizer Science，2009，15(6)：1450-1465．

[6] Navarro-Noya，Yendi E， Hernandez-Mendoza，et al．Isolation and characterization of nitrogen fixing heterotrophic bacteria from the rhizosphere of pioneer plants growing on mine tailings [J].Applied Soil Ecology，2012，62：52-60．

[7] Katherine E F，Andrzej T，Lindsay A，et al．Conversion of grassland to arable decreases microbial diversity and alters community composition [J].Applied Soil Ecology，2017，1：43-52．

[8] Bauer J T, Kleczewski N M, Bever J D , et al．Nitrogen-fixing bacteria and arbuscular mycorrhizal fungi in Piptadenia gonoacantha (Mart.) Macbr [J].Brazilian Journal of Microbiology，2016，481(1)：95-100．

[9] 樊俊華，張曉波，趙 艷．地毯草根際固氮菌的分離及鑒定 [J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，43(8)：105-109．

Fan J H，Zhang X B，Zhao Y．Isolation and identification of associative nitrogen-fixing bacteria in the rhizosphere ofAxonopuscompressus[J].Journal of Northeast Agricultural University，2012，43(8)：105-109．

[10] Verma J P，Yadav J，Tiwari K N，et al．Impact of plant growth promoting rhizobacteria on crop producti[J]．International Journal of Agricultural Research，2010，5(11)：954-983．

[11] Fernando I，Luis W，Adriana F．Starting points in plant-bacteria nitrogen-fixing symbioses:intercellular invasion of the roots [J].Journal of Experimental Botany，2016，2：1-10．

[12] 陳勝男，谷 潔，付青霞，等．接種自生固氮菌對玉米根際土壤酶活性和細(xì)菌群落功能多樣性的影響 [J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2012，18(2)：444-450．

Chen S N，Gu J，F(xiàn)u Q X，et al．Effects of inoculating azotobacter on soil enzyme activities and bacterial community functional diversity in the rhizosphere of maize (ZeamaysL．)[J]．Plant Nutrition and Fertilizer Science，2012，18(2)：444-450．

[13] Zhang G X， Peng G X，Wang E T，et al．Diverse endophytic nitrogen-fixing bacteria isolated from wild riceOryzarufipogon and description ofPhytobacterdiazotrophicusgen.nov．sp．Nov [J]Archieve Microbiology，2008，189：431-439．

[14] Zhu R F，Tang F L，Liu J L．Co-inoculation of arbusculr mycorrhizae and nitrogen fixing bacteria enhanceAlfalfayield under saline conditions [J].Pakistan Journal of Botany，2016，28(2)：763-769．

[15] Wurzburger，Nina．Old-growth temperate forests harbor hidden nitrogen-fixing bacteria [J].New Phytologist，2016，210(2)：374-376．

[16] Liu J Y，Peng M J，Li Y G．Phylogenetic diversity of nitrogen-fixing bacteria and thenifHgene from mangrove rhizosphere soil [J].Canadian Journal of Microbiology，2012，58(4)：531-539．

[17] 王勁松，呂成群，覃林海,等．兩個桉樹無性系接種固氮菌造林試驗效果初探 [J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2010，30(12)：56-61．

Wang J S，Lü C Q，Qin L H，et al．Effect of inoculating nitrogen fixation bacteria on afforestation experiment for twoEucalyptusclones[J]．Journal of Central South University of Forestry &Technology，2010，30(12)：56-61．

[18] 馬海賓，康麗華，江業(yè)根，等．接種固氮菌對尾葉桉抗青枯病的作用及相關(guān)酶活性變化 [J].浙江林業(yè)科技，2009，29(4)：7-10．

Ma H B，Kang L H，Jiang Y G，et al．Effect of nitrogen-fixation bacteria on resistance ofEucalyptusurophyllato bacteria wilt disease and changes of defense enzymes activity[J]．Jour of Zhejiang for Sci & Tech，2009，29(4)：7-10．

[19] Boddey R M，Dobereiner J．Nitrogen fixation associated with grasses and cereals：recent results and perspectives for future research [J].Plant Soil，1988(108)：53-65．

[20] 何雪香，李 玫，廖寶文．紅樹林固氮菌和解磷菌的分離及對秋茄苗的促生效果 [J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，33(1)：64-68．

He X X，Li M，Liao B W．Isolation of nitrogen-fixing bacteria and phosphate-solubilizing bacteria from the rhizosphere of mangrove plants and their enhancement to the growth of kandelia candel seedlings [J]．Journal of South China Agricultural University，2012，33(1)：64-68．

[21] 趙秀云,韓素芬.固氮細(xì)菌與楊樹的聯(lián)合固氮作用 [J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2001,25(4)：17-20．

Zhao X Y，Han S F．Nitrogen fixing bacteria andPoplar’s associative nitrogen fixation [J].Journal of Nanjing Forestry University，2001，25(4)：17-20．

[22] 劉文國，張旭東，黃玲玲,等.我國楊樹生理生態(tài)研究進(jìn)展 [J].世界林業(yè)研究，2010,23(1)：50-54．

Liu W G，Zhang X D,Huang L L, et al.Research progress on physiologic and ecologic characteristics of popular [J].World Forestry Research,2010,23(1)：50-54．

[23] Kaur K,Goyal S,Kapoor K K.Impact of organic fertilizers with and without chemical fertilizers on soil chemical properties and the establishment of nitrogen-fixing bacteria in the rhizosphere [J].Microbes and Environments，2008，23(4)：313-316．

[24] 李 菁．內(nèi)蒙古阿爾山林區(qū)植物、節(jié)肢動物生物多樣性與森林健康評價[D]．北京：北京林業(yè)大學(xué)，2012．

Li J．Plant, arthropod diversity and forest health evaluation in aershan forestry area,Inner Mongolia[D]．Beijing：Beijing Forestry University，2012．

[25] 李 菁，駱有慶，石 娟．基于生物多樣性保護(hù)的興安落葉松與白樺最佳混交比例 [J].生態(tài)學(xué)報，2012,32(16)：4943-4949．

Li J，Luo Y Q，Shi J.The optimum mixture ratio of larch and birch in terms of biodiversity conservation：a case study in Aershan forest area [J].Acta Ecologica Sinica，2012，32(16)：4943-4949．

[26] 楊鴻儒，袁 博，趙 霞，等．三種荒漠灌木根際可培養(yǎng)固氮細(xì)菌類群及其固氮和產(chǎn)鐵載體能力 [J].微生物學(xué)通報，2016，43(11):2366-2373．

Yang H R，Yuan B，Zhao X，et al．Cultivable diazotrophic community in the rhizosphere of three desert shrubs and their nitrogen-fixation and siderophore-producing capabilities[J]．Microbiology China，2016，43(11)：2366-2373．

[27] Teixeira,Helena，Rodriguez-Echeverria，et al．Identification of symbiotic nitrogen-fixing bacteria from three African leguminous trees in Gorongosa National Park [J].Systematic and Applied Microbiology，2016，39(5)：350-358．

[28] 沈 萍，陳向東．微生物學(xué)實驗 [M].北京：高等教育出版社，2007:111-129．

Sheng P，Chen X D．Microbiology experiment [M].Beijing：Higher Education Press，2007：111-129．

[29] 周國英，唐大武，陳曉艷,等．幾種木本植物聯(lián)合固氮細(xì)菌的研究:聯(lián)合固氮細(xì)菌的分離鑒定及固氮活性 [J].中南林學(xué)院學(xué)報，2002,22(1)：23-26．

Zhou G Y，Tang D W，Chen X Y，et al．Studies of the associative diazotrophs from woody plants：segregation identification of associative nitrogen-fixing bacteria and theirs activity [J]．Journal of Central South Forestry University，2002，22(1)：23-26．

[30] 李 雯，閻愛華，黃秋嫻．尾礦區(qū)不同植被恢復(fù)模式下高效固氮菌的篩選及Biolog 鑒定 [J].生態(tài)學(xué)報，2014，34(9)：2329-2337．

Li W，Yan A H，Huang Q X，et al．Isolation and biolog identification of the high-efficiency azotobacter from iron tailing under different vegetation restoration modes [J].Acta Ecologica Sinica，2014，34(9)：2329-2337．

[31] 田國杰，王 晗，陳立紅．內(nèi)蒙古赤峰地區(qū)主要樹種根際固氮菌的分離和鑒定 [J].內(nèi)蒙古林業(yè)科技，2016，42(1)：21-26．

Tian G J，Wang H，Chen L H．Isolation and determination of nitrogen-fixing bacteria in rhizosphere of main tree species in chifeng，Inner Mongolia [J].Journal of Inner Mongolia Forestry Science & Technology，2016，42(1)：21-26．

[32] 牛艷芳，陳立紅，閆 偉．賀蘭山地區(qū)油松根際固氮菌的多樣性研究 [J].湖南林業(yè)科技，2016，43(5)：17-21．

Niu Y F，Chen L H，Yan W．Diversity of nitrogen-fixing bacteria isolated fromPinustabulaeformis in Helan mountains[J]．Hunan Forestry Science & Technology，2016，43(5)：17-21．

[33] 鄭紅麗，龐保平，靳潤歲，等．內(nèi)蒙古錫林郭勒天然草原禾本科牧草根際18株固氮細(xì)菌的初步分類鑒定 [J].干旱區(qū)資源與環(huán)境，2011，25(9)：106-109．

Zheng H L，Pang B P，Jin R S，et al．Primary dentification of nitrogen fixation bacteria isolated from rhizosphere of 18 species of grasses in Xilingol Grassland of Inner Mongolia[J]．Journal of Arid Iand Resources and Environment，2011，25(9)：106-109．

[34] 余賢美，王 義，沈奇賓，等．解磷細(xì)菌PSB3 的篩選及拮抗作用的研究 [J].微生物學(xué)通報，2008,35(9)：1398-1403．

Yu X M，Wang Y，Shen Q B，et al．The screening of phosphorus solubilizing bacteria PSB3 and the study of its antagonism [J].Microbiology，2008,35(9)：1398-1403．

[35] 裘娟萍，汪 琨，邱樂泉，等.微生物學(xué)教程多媒體課件 [CD].北京：高等教育出版社，高等教育電子音像出版社，2008.

Qiu J P，Wang K，Qiu L Q，et al．Microbiology tutorial multimedia courseware [CD].Beijing：Higher Education Press，Higher Education Electronic Audio Video Press，2008．

[36] 周賢軒，楊 波，陳新華．幾種分子生物學(xué)方法在菌種鑒定中的應(yīng)用[J]．生物技術(shù)，2014，14(6)：35-38．

Zhou X X，Yang B，Chen X H．Application of several molecular biological methods in microbe characterization[J]．Biotechnology，2014,14(6)：35-38．

[37] 布坎南R E，吉本斯N E．伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M]．北京：科學(xué)出版社，1984．

Buchanan R E，Gibbons N E，et al．Bergey’s manual of determinative bacteriology [M].Beijing：Science Press，1984．

[38] 東秀珠，蔡妙英．常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]．北京：科學(xué)出版社，2001．

Dong X Z，Cai M Y．Handbook of common bacterial system identification [M].Beijing：Science Press，2001．

[39] 張曉勇，劉平義．玉米聯(lián)合固氮菌的溶磷作用 [J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，1992(6)：264-265．

Zhang X Y，Liu P Y．Phosphate solubilization of associative nitrogen fixation bacteria in maize [J].Xinjiang Agricultural Sciences，1992(6)：264-265．

[40] Malik R D S，Kavimandan S K，Tilak K V B R．Growth promoting bacteria associated with sunflow [J].Indian Journal of Experimental Biology，1995，33(4)：311-312．

[41] 蔡 苗，彭方任，陳隆升，等．不同油茶林分聯(lián)合固氮菌及固氮效能分析 [J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，35(5)：121-124．

Cai M，Peng F R，Chen L S，Isolation of associative-nitrogen-fixing bacterium from typicalCamelliaforestsand analysis of nitrogen efficiency [J].Journal of Nanjing Forestry University，2011，35(5)：121-124．