microRNA-31對胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS遷移的影響

孫玉成 金恩鴻

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院普外一科，吉林 延吉 133000)

胃癌早期很難被發(fā)現(xiàn)，發(fā)展到晚期時有較高的轉(zhuǎn)移率，這也是胃癌死亡率高的重要原因之一〔1〕。文獻(xiàn)報道，胃癌的發(fā)生主要是由遺傳和環(huán)境等多因素所致〔2〕。microRNA(miRNA)是由內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄的約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA，在基因組中高度保守且在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)過程中具有組織特異性和時間性〔3〕。目前發(fā)現(xiàn)的miRNAs與人類腫瘤的形成及發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔4〕。研究報道m(xù)icroRNA(miR)-31通過抑制TIAM1促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔5〕。在乳腺癌細(xì)胞中，miR-31通過靶向特異AT序列結(jié)合蛋白(SATB)2基因抑制乳腺癌的遷移和浸潤〔6〕。然而，MiR-31對胃癌細(xì)胞遷移的作用未見報道。本研究采用實時定量(qRT)-PCR檢測miR-31在胃癌組織中的表達(dá)水平，并通過體外實驗驗證miR-31對胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS遷移的影響。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器 qRT-PCR試劑盒購自瑞士ROCHE公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金(TRANSGENE)公司，RNA裂解液Trizol Reagent購自日本TaKaRa公司，RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自美國Gibco公司，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，Transwell小室購自美國Corning Costar公司。MiR-31模擬物(miR-31mimics)購自廣州銳博生物公司。紫外可見分光光度計、倒置熒光顯微鏡及照相機、BioRad CFX-96型號的PCR儀、生物安全柜和二氧化碳培養(yǎng)箱〔MCO-18AIC(UV)〕等，分別購于德國eppendorf公司、日本OLYMPUS公司和尼康公司、美國BIO-RAD公司、江蘇凈化和日本三洋公司等。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 胃上皮細(xì)胞系GES-1、胃腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、SGC7901、MGC、BGC、HGC均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，其中人胃癌細(xì)胞HGC是未分化的胃腺癌細(xì)胞系。細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期細(xì)胞按3×105個/孔鋪6孔板，24 h后進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染體系按照Lipofectamine2000的說明制備轉(zhuǎn)染液，將轉(zhuǎn)染miR-31mimics組設(shè)為實驗組，未經(jīng)處理的胃癌細(xì)胞組設(shè)為對照組，對照組成分為轉(zhuǎn)染試劑和廣州銳博生物公司合成的無義RNA片段。加入轉(zhuǎn)染液后6 h對細(xì)胞換液處理，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行下一步處理。

1.3胃癌組織樣本 收集2015年1～12月延邊大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科胃癌患者27例的胃癌組織和對應(yīng)的正常組織，液氮保存。18例術(shù)前經(jīng)過化療和放射治療，未經(jīng)過治療的有9例。男15例，女12例，年齡27～63歲，平均(42.70±9.05)歲。腫瘤組織樣本的收集均經(jīng)過患者的同意且腫瘤組織樣本切片均已經(jīng)過病理學(xué)證實。

1.4RNA的提取定量 采用RNA裂解液Trizol Reagent裂解細(xì)胞，按照Trizol提取總RNA的說明書提取胃癌組織和對應(yīng)正常組織中總RNA。體外培養(yǎng)GES-1、AGS、SGC7901、MGC、BGC、HGC 6種細(xì)胞系，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時提取細(xì)胞系中的總RNA。用TE做標(biāo)準(zhǔn)體進(jìn)行定量，測定得總RNA的濃度，-80℃保存。

1.5逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 將上述提取的總RNA吸取2.0 μg，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(42℃ 30 min，85℃ 5 min)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：2×TS Reaction Mix 10.0 μl，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1.0 μl，Oligo(dT)1.0 μl，總RNA 2.0 μg，RNase-free Water補足至20.0 μl。

1.6qRT-PCR反應(yīng) 采用莖環(huán)法測量miRNA的相對表達(dá)量，所用引物購自廣州銳博生物科技有限公司，檢測組織樣本中GES-1、AGS、SGC7901、MGC、BGC、HGC中miR-31的表達(dá)量。將上述cDNA進(jìn)行50倍稀釋，采用ROCHE相對定量試劑盒進(jìn)行目的基因的定量。通過ct值進(jìn)行相對定量的計算。qRT-PCR主要體系：反應(yīng)體系SYBR Premix EX TapⅡ10 μl，Primer mix 2.0 μl，cDNA 2.0 μl，ddH2O 6 μl。

1.7細(xì)胞劃痕實驗 在未接種細(xì)胞的培養(yǎng)板后面做好標(biāo)記，轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞均勻鋪滿整個12孔板，待細(xì)胞長滿板底后，用已滅菌的尺子和10 μl槍頭進(jìn)行劃痕，在整個劃痕過程中保持快速均勻，使劃出的痕道大小一致，棄掉培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，在此過程中盡量把劃掉的細(xì)胞全部吸出，加入全新培養(yǎng)液，拍照記為0 h；并分別在12、24、36、48 h進(jìn)行拍照觀察。

1.8Transwell小室實驗 將已轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞進(jìn)行趨化計數(shù)處理，采用無血清培養(yǎng)液調(diào)整AGS細(xì)胞濃度，在聚碳酸酯膜上室接種已轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞3×104/100 μl，嵌入24孔板上，在24孔板加入500 μl含有20%的FBS培養(yǎng)液作為趨化劑，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，將小室內(nèi)細(xì)胞擦拭掉，用0.4%的多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，然后在顯微鏡下觀察并計算遷徙通過的細(xì)胞數(shù)，找穿過細(xì)胞數(shù)符合比例的視野進(jìn)行拍照。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件行配對樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-31在胃癌組織中的表達(dá)水平 miR-31在胃癌組織中的表達(dá)水平為(0.23±0.03)，明顯低于對應(yīng)正常組織的(0.36±0.04，t=13.510，P=0.000)。(以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法定量)。

2.2qRT-PCR檢測細(xì)胞系中miR-31的表達(dá)水平 以GES-1的miR-31的表達(dá)量(1.00)為對照，胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、SGC7901、MGC、BGC、HGC中miR-31呈低表達(dá)，分別為(0.59±0.08)，(0.19±0.04)，(0.60±0.13)，(0.32±0.08)，(0.49±0.07)，與GES-1比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.514，8.214，3.241，8.214，3.954；均P=0.000)，其中AGS細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平最低(以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法定量)。

2.3檢測miR-31瞬時轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞系的表達(dá) 在miR-31表達(dá)水平較低的AGS細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-31mimics，結(jié)果提示，與對照組(1.00)相比，實驗組中表達(dá)水平(8.2±1.5)顯著升高(t=11.521，P=0.000)(以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法定量)。

2.4過表達(dá)miR-31對AGS細(xì)胞遷移的影響

2.4.1劃痕實驗 miR-31mimics和對照組分別轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞36 h后，實驗組遷移距離(310.0±11)μm明顯小于對照組(690.0±0.2)μm(t=30.121，P=0.000)，提示miR-31抑制AGS細(xì)胞的遷移水平。見圖1。

2.4.2Transwell小室實驗 對照組上穿過的細(xì)胞多于實驗組，證明過表達(dá)miR-31抑制AGS細(xì)胞的遷移水平。見圖2。

圖1 劃痕實驗中過表達(dá)miR-31對AGS細(xì)胞遷移水平的影響(×200)

3 討 論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是個多基因互相調(diào)控的過程，基因的表達(dá)主要通過各種調(diào)節(jié)機制的影響以及表觀遺傳學(xué)的改變，主要概括為抑癌基因失活和原癌基因的激活。miRNA是一類在機體起重要調(diào)控作用的非編碼RNA，占人類基因的1%，調(diào)控著人類近30%的基因表達(dá)〔7〕。關(guān)于miRNA在胃癌中的功能研究已有很多報道，其轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)幾乎參與了各項生理活動，包括細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等過程〔8〕。

本課題主要在胃癌組織中檢測miR-31的表達(dá)水平，闡釋miR-31在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。miR-31作為miRNA家族的一員，在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，通過與靶基因mRNA的3′UTR區(qū)域結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)。本研究使用qRT-PCR的方法檢測組織中miR-31的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-31的低表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

文獻(xiàn)報道〔9〕，與正常組織相比，miR-31在卵巢癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，在卵巢癌細(xì)胞中，miR-31能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，通過天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)介導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。在前列腺癌細(xì)胞中，miR-31可以通過介導(dǎo)E2F6增強前列腺癌細(xì)胞系的耐藥性〔10〕。miR-31可能作為一個抑癌基因存在于胃癌組織細(xì)胞中。本研究通過劃痕實驗和Transwell小室實驗證明，在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS細(xì)胞中過表達(dá)的miR-31可以抑制AGS細(xì)胞的遷移，而其作用機制有待繼續(xù)研究。在乳腺癌細(xì)胞中，已經(jīng)被證實miR-31通過靶向SATB2、RhoA、ITGA5和RDX等基因抑制乳腺癌的遷移和浸潤〔6，11〕。在卵巢癌細(xì)胞中，miR-31抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和克隆形成〔12〕。暗示了miR-31很有可能作為一個重要調(diào)控因子參與胃癌遷移過程。在整個遷移過程中，同一種miRNA在不同腫瘤細(xì)胞中不一定有相同的作用，而作用的靶點也不一定是同一個靶點，還應(yīng)進(jìn)一步證實miR-31參與胃癌遷移的作用機制，尋找miR-31作用機制過程中的重要靶點。

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