復(fù)方丹參滴丸對(duì)2型糖尿病大鼠代謝、生化指標(biāo)及缺氧誘導(dǎo)因子-1α/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子通路的影響

王 薇 王懷清 楊建明 王 穩(wěn)

(宜昌市第一人民醫(yī)院暨三峽大學(xué)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 宜昌 443000)

糖尿病腎病是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致患者出現(xiàn)終末期腎衰竭的重要病因。有學(xué)者提出，高血糖時(shí)紅細(xì)胞攜氧能力降低，引起腎組織缺氧，導(dǎo)致腎組織病理生理學(xué)的改變是推動(dòng)2型糖尿病(T2DM)向終末期腎病進(jìn)展的重要通路〔1〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α是機(jī)體缺氧狀態(tài)時(shí)的重要轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)特異性結(jié)合靶基因缺氧反應(yīng)元件(HRE)而啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮生理作用〔2〕。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是具有該結(jié)合位點(diǎn)的一類(lèi)靶基因，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增強(qiáng)血管通透性等作用〔3〕。近年來(lái)學(xué)者發(fā)現(xiàn)〔4〕，HIF-1α/VEGF通路激活可能是糖尿病腎病的重要發(fā)生機(jī)制。復(fù)方丹參滴丸(DSP)是目前臨床中用于緩解和治療糖尿病腎臟病變、冠心病等的常見(jiàn)藥物之一，但具體作用途徑及機(jī)制尚不明確。本文主要研究DSP對(duì)T2DM大鼠HIF-1α/VEGF通路的影響及其作用效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取48只6～8周齡的清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體重180～210 g，由上海靈暢生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK(滬)2013-0018。以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，室溫(25.0±2.0)℃，濕度45%～70%，自然光照，室內(nèi)保持安靜。

1.2動(dòng)物分組與造模 按簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣方法將48只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(NC組，n=10)和造模組(n=38)。對(duì)照組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)；造模組采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)4 w后，一次性腹腔注射2%鏈脲佐菌素(STZ)溶液，劑量為30 mg/kg，2 h后恢復(fù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)，72 h后采集尾靜脈血，以優(yōu)越型血糖儀(ACCU CHEK Advantage，瑞士羅氏診斷公司)測(cè)定2次隨機(jī)血糖(RBG)，兩次RBG值均≥16.7 mmol/L則判定為T(mén)2DM模型造模成功。本次共有32只大鼠成模，成功率為84.21%。將成模的32只大鼠依據(jù)血糖水平分為糖尿病對(duì)照組(DM組，n=16)和DSP治療組(DSP組，n=16)，其中DSP組大鼠在STZ注射1 w后給予400 mg·kg-1·d-1的DSP(天士力制藥集團(tuán)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z10950111，規(guī)格：薄膜衣滴丸每丸重27 mg)與生理鹽水混懸液治療；NC組及DM組大鼠給予等量的生理鹽水灌胃，均持續(xù)8 w。

1.3處理方法 灌胃最后1 d，留取大鼠24 h尿液，用于24 h尿微量白蛋白(24 h UAlb)的測(cè)定。第2天對(duì)三組大鼠腹腔注射1%水合氯醛全麻，劑量為40～50 mg/kg。真空管采集下腔靜脈血8 ml，3 000 r/min離心10 min后，取上清夜，-20℃保存，用于糖代謝及生化指標(biāo)的測(cè)定。同時(shí)剖腹快速摘取兩側(cè)腎臟組織，以冰生理鹽水原位灌洗，洗凈附著的血細(xì)胞，分離腎背膜、周?chē)窘M織及血管蒂，電子天平稱(chēng)量右腎組織。將腎組織放置于冰袋上，剪取大小約為2 cm×2 cm的腎皮質(zhì)組織塊，經(jīng)10%中性甲醛液固定后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，以切片機(jī)制成厚度為2 μm的連續(xù)切片，分別經(jīng)過(guò)脫蠟、水化等處理后，以PASM染色后行免疫組化檢測(cè)。將剩余腎臟組織置于凍存管內(nèi)，-70℃保存。

1.4觀察指標(biāo)與方法

1.4.1三組大鼠糖脂代謝及生化指標(biāo)的檢測(cè) 分別采用AU2700全自動(dòng)生化儀(日本Olympus公司)和自動(dòng)放射免疫儀(北京百思佳特科技有限責(zé)任公司)檢測(cè)空腹血糖(FPG)及空腹胰島素(FIns)水平；24 h UAlb采用BNII全自動(dòng)蛋白分析儀(德國(guó)西門(mén)子公司)檢測(cè)，其含量=尿微量白蛋白的濃度×總尿量；血脂代謝指標(biāo)：總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及生化指標(biāo)：肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的測(cè)定均采用AU2700全自動(dòng)生化儀進(jìn)行測(cè)定；胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)由計(jì)算公式FIns×FPG/22.5得到。

1.4.2三組大鼠腎小球細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)堆積指數(shù)的測(cè)定 高倍鏡視野下(×400)隨機(jī)觀察20個(gè)不重復(fù)的腎小球，通過(guò)觀察PASM的染色結(jié)果，以判斷ECM的堆積情況，從而對(duì)腎小球的病變狀況進(jìn)行評(píng)估。以ECM占據(jù)腎小球面積百分比為判定標(biāo)準(zhǔn)，其中百分比為0%～25%計(jì)為0分，26%～50%計(jì)為1分，51%～75%計(jì)為3分，76%以上計(jì)為4分。三組隨機(jī)選取5只大鼠，以平均積分作為三組ECM堆積指數(shù)。

1.4.3三組大鼠腎組織中HIF-1α及VEGF表達(dá)水平的檢測(cè) 采用Western印跡方法進(jìn)行檢測(cè)：剪取右腎皮質(zhì)組織約100 mg，以磷酸鹽緩沖液(PBS)充分清洗后，加入4℃預(yù)冷的組織裂解A液、B液，置于振蕩器中搖勻5 min后，冰浴靜置20 min以提取總蛋白，4℃ 14 000 r/min離心30 s后吸取上清液，置于EP管中，-70℃凍存。采用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。后經(jīng)由甲醇浸泡、緩沖液平衡、轉(zhuǎn)移、脫色等過(guò)程后，將PVDF膜(美國(guó)Millpore公司)放入一定大小的自封袋內(nèi)，以0.1 ml/cm2的劑量加入10%的脫脂奶粉(以0.05%的TBST溶解)，室溫封閉2～4 h后移至另一自封袋中，迅速加入劑量為1 ml/cm2的一抗(HIF-1α購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，VEGF購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，均以封閉液稀釋濃度為1∶1 000，β-actin 1∶5 000)，密封后置搖床孵育2 h，4℃過(guò)夜。后取出PVDF膜，以TBS液漂洗4次，每次10 min。加入二抗(北京百奧萊博科技有限公司)，封閉、室溫?fù)u床孵育2～3 h，以TBS液漂洗4次，每次10 min。加入Western印跡Lumininol Reagent A液和B液(美國(guó)Santa Cruz公司)后，充分混勻，固定于微型曝光盒中送入暗室曝光。以Fluor-s凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio Rad公司)分析目的條帶，以目的蛋白的吸光密度×面積與β-actin條帶的比值表示待測(cè)蛋白的相對(duì)含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件，計(jì)量資料組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1三組病理檢查結(jié)果及ECM堆積指數(shù)比較 NC組腎小球結(jié)構(gòu)正常，基底膜及系膜區(qū)未見(jiàn)明顯增厚、擴(kuò)張現(xiàn)象，而DM組及DSP組腎小球基底膜及系膜區(qū)呈現(xiàn)明顯腫脹、擴(kuò)張，DSP組腎小球病變有所減輕。三組大鼠腎小球ECM堆積指數(shù)的積分結(jié)果顯示，NC組(1.43±0.54)分，DM組(20.56±0.92)分，DSP組(11.80±1.63)分，三組ECM堆積指數(shù)整體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=802.819，P<0.05)。DM組及DSP組腎小球ECM堆積指數(shù)積分均顯著高于NC組，且DSP組顯著低于DM組(t=-59.396、-19.336、-18.721，均P=0.000)。

2.2三組血清糖脂代謝指標(biāo)水平比較 三組血清中糖脂代謝指標(biāo)水平整體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與NC組比較，DM組及DSP組血清FPG、FIns、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C水平均顯著升高，而HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；除HDL-C外，DSP組其他指標(biāo)水平均顯著低于DM組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3三組血清生化指標(biāo)水平比較 DM組及DSP組Scr、BUN及24 h UAlb水平明顯高于NC組，DSP組明顯低于DM組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 三組血清糖、脂代謝指標(biāo)水平比較

與NC組比較：1)P<0.05；與DM組比較：2)P<0.05；下表同

表2 三組血清中生化指標(biāo)水平比較

2.4三組腎組織中HIF-1α及VEGF表達(dá)水平比較 DM組與DSP組腎組織中HIF-1α及VEGF相對(duì)含量均顯著高于NC組，DSP組顯著低于DM組(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 三組大鼠腎組織中HIF-1α及VEGF相對(duì)含量比較

3 討 論

糖尿病腎病是導(dǎo)致糖尿病患者發(fā)生終末期腎衰竭的一類(lèi)常見(jiàn)并發(fā)癥，發(fā)生率為20%～40%，若不進(jìn)行及早治療，一旦發(fā)展為終末期腎病，將縮短患者的5年生存率〔5〕。糖尿病腎病的具體發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，學(xué)者普遍認(rèn)為其與遺傳易感性、氧化應(yīng)激機(jī)制、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子異常增高、多元醇代謝旁路、蛋白激酶C等多種因素及環(huán)節(jié)密切相關(guān)〔6〕。HIF-1α/VEGF通路激活導(dǎo)致腎組織產(chǎn)生血管內(nèi)皮增生、內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加等一系列病理生理改變，已成為學(xué)者們研究糖尿病相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生機(jī)制新的研究方向。

DSP是臨床中廣泛用于治療心血管疾病的一類(lèi)中成藥，以丹參、冰片和三七等為主要成分，具有緩解心絞痛、改善血管微循環(huán)等作用〔7〕。本次研究結(jié)果示，DSP組與DM組大鼠腎小球均呈現(xiàn)一定程度的病變，提示DSP可有效改善T2DM所致的腎臟病變。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，DSP可有效改善T2DM腎病大鼠的糖脂代謝及腎功能，分析原因?yàn)镈SP具有改善微循環(huán)障礙、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、清除自由基、調(diào)節(jié)血脂等多靶點(diǎn)作用，從而改善胰島素敏感性、降低胰島素抵抗〔8〕。

HIF-1α/VEGF通路激活是目前研究較多的造成腎臟疾病的重要機(jī)制，HIF-1α是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)氧代謝的關(guān)鍵因子之一，可穩(wěn)定細(xì)胞的缺氧狀態(tài)，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種可在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子〔9〕。T2DM早期的高糖毒性可引起機(jī)體缺氧，從而激活機(jī)體HIF-1α的大量積聚，HIF-1α可通過(guò)特異性結(jié)合具有HRE結(jié)構(gòu)的下游靶基因，如VEGF等，從而發(fā)揮促進(jìn)血管生成及增強(qiáng)血管通透性的作用，故可見(jiàn)早期腎病診斷指標(biāo)24 h UAlb水平大大增加〔10〕。有研究以該通路為新的思路，發(fā)現(xiàn)格列齊特、苦瓜總皂苷、羅格列酮等對(duì)于延緩T2DM所致腎臟損害的進(jìn)展具有顯著效果〔11～13〕。DSP對(duì)T2DM的改善作用是否與HIF-1α及VEGF通路有關(guān)，本文進(jìn)行了進(jìn)一步的探索。結(jié)果說(shuō)明HIF-1α及VEGF可能參與T2DM腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，DSP對(duì)T2DM腎損傷的改善作用機(jī)制可能與其對(duì)HIF-1α/VEGF通路的調(diào)控作用有關(guān)。

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